CC BY
37
УДК 574.32:575.174:597.442:639.3.03
Т. Ю. Переварюха
ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АНТИГЕННОГО СОСТАВА СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ ВОЛЖСКОЙ И КУРИНСКОЙ ПОПУЛЯЦИЙ СЕВРЮГИ
T. Yu. Perevaryuha
IMMUNOCHEMICAL PECULIARITIES OF THE ANTIGENIC COMPOSITION OF SERUM PROTEINS OF VOLGESKOY AND KURINSKOY STURGEON POPULATIONS
Методами иммунохимического анализа изучали антигенные особенности сывороточных белков севрюги, мигрирующей в реки Волгу и Куру. Антигены сывороточных белков севрюги с нормальными гомо- и гетероантисыворотками иммуноэлектрофоретически дифференцируются на 22-25 компонентов. Перекрестная абсорбция антисывороток выявила наличие специфических антигенов. Волжская севрюга отличается от куринской севрюги по двум антигенам, которые находятся в зоне р1-глобулинов. Делается вывод о том, что наличие специфических антигенов у волжской популяций севрюги и отсутствие их у куринской свидетельствуют о репродуктивной самостоятельности этих внутривидовых группировок.
Ключевые слова: севрюга Acipenser stellatus, Каспийское море, иммунохимический анализ, популяция.
Methods of immunochemical analysis helped to study the antigenic peculiarities of serum proteins of the sturgeon, migrating in the Volga and Kura rivers. Antigens of serum proteins of the sturgeon with normal homo- and heteroantiserums immuno-electrophoretically are differentiated on 22-25 components. Cross absorption of antiserums has revealed the presence of specific antigens. Volgeskaya sturgeon differs from Kurinskaya one by two antigens, which are found in p1-globulin zone. The conclusion on the fact that the presence of specific antigen of Volgeskaya sturgeon and their absence of Kurinskaya sturgeon indicate on the reproductive independence of these intraspecific groups is made.
Key words: sturgeon Acipenser stellatus, Caspian Sea, immunochemical analysis, population.
Введение
Севрюга до недавнего времени была многочисленным видом в фауне Черного, Азовского и Каспийского морей и имела большое промысловое значение. В настоящее время севрюга, как и другие представители семейства осетровых, отнесена к группе редких видов и включена в Приложение II Конвенции о международной торговле видами дикой фауны и флоры, находящимися под угрозой уничтожения (CITES).
Катастрофическое снижение численности осетровых рыб обусловлено интенсивным строительством гидротехнических сооружений и чрезмерным выловом [1]. Естественное воспроизводство севрюги характеризуется сложной зависимостью между нерестовой частью популяции и пополнением, наблюдается также сильное действие эффекта Олли [2]. Восполнение численности севрюги в значительной степени осуществляется за счет искусственного воспроизводства на рыбоводных заводах. В Каспийском бассейне доля искусственно воспроизведенных рыб достигает 50 % [3]. В связи с этим мероприятия по поддержанию численности севрюги в бассейне Каспийского моря должны учитывать сохранение устойчивости её популяций, которая обусловлена генетической гетерогенностью, и, следовательно, требуют знаний об эволюци-онно сформировавшейся популяционной структуре вида, а также методов идентификации популяционной принадлежности [4].
В современных условиях эффективная организация управляемого осетрового хозяйства в Каспийском бассейне невозможна без четкого знания внутривидовой структуры каждого вида осетровых рыб. Самое главное, она невозможна без умения практической идентификации особей отдельных популяций. Это важно, во-первых, при промысловой эксплуатации популяций: определении их возрастного и полового состава, плодовитости, темпов роста и т. д.; во-вторых, при определении абсолютной численности отдельных популяций, поскольку суверенные прикаспийские государства озабочены главным образом судьбой тех естественных популяций, не-
рестовые ареалы которых находятся на их территории; в-третьих, смешение разных популяций при заводском воспроизводстве сопровождается нарушениями популяционных генофондов, что приводит к аномалиям в развитии половых желез, снижению качества и количества выращиваемой молоди; в-четвёртых, происходит нарушение хоминга, и в результате производители не возвращаются для размножения в родные реки. В конечном итоге это приводит к снижению экономической эффективности искусственного воспроизводства осетровых рыб [5].
Положение усугубляется тем, что естественные популяции севрюги, нерестящиеся в реках Урале и Куре, остались за пределами Российской Федерации. Антигенный состав сывороточных белков севрюги, нерестящейся в Куре, совершенно не изучен. В таких условиях накопление новых данных, отражающих генетическое разнообразие и экологические особенности севрюги, становится всё более проблематичным.
Материалы и методы исследования
Объектом нашего исследования была севрюга (Acipenser stellatus Pallas, 1771), обитающая в бассейне Каспийского моря. Она относится к роду осетров (Acipenser Linnaeus, 1758), подсемейству осетроподобных (Acipenserinae), семейству осетровых (Acipenseridae Bonaparte, 1831) [6]. Мы использовали особей, отловленных в дельте р. Волги на тонях «9-я Огневка» и «10-я Огневка» - 126 экз., в устье Куры - 22 экз. Для иммунизации кроликов из индивидуальных сывороток готовили сборные сыворотки (пул), используя самцов независимо от стадии зрелости и самок только на I и II стадиях зрелости половых желез, чтобы исключить влияние половых фракций. Использование пулов сывороток позволяет оперировать со спектром антигенов, в большей степени характерным для исследуемой группировки рыб в целом, чем сыворотки отдельных особей. Их консервировали борной кислотой и хранили в холодильнике при температуре +4 °С в плотно закрытых пробирках.
Продуцентами антисывороток служили кролики пород шиншилла и белый великан. Иммунизацию проводили по новой, разработанной нами схеме, позволившей получить антисыворотки с более высокими разрешающими способностями. Основной цикл состоял обычно из серии четырех подкожных инъекций в брюшную область животного с 10-12-дневными интервалами. Вводили возрастающие дозы эмульсии сыворотки с адъювантом Фрейнда в соотношении 1 : 1, начиная с 1 мл и доводя до 3 мл на каждое животное к концу основного цикла. Первые две инъекции выполняли с полным адъювантом, последующие - с неполным. Через 10-12 дней после последней инъекции прижизненно брали 40-50 мл крови из краевой вены уха. Взятую кровь инкубировали в течение 30 минут при температуре +37 °С и отстаивали в течение суток в холодильнике. Затем полученную антисыворотку отсасывали пипеткой, разливали в пробирки и хранили в холодильнике при температуре +4 °С. Спустя 1-1,5 месяца проводили реиммунизацию 3 мл эмульсии с неполным адъювантом подкожно. Через 10-12 дней снова брали кровь. Каждую последующую реиммунизацию проводили аналогично. Использовали антисыворотки, полученные после 4-5 реиммунизаций. На каждую популяцию иммунизировали не менее четырех кроликов. В работе использовали два типа антисывороток: 1) антисыворотка против сывороточных белков севрюги, отловленной в р. Волге; 2) антисыворотка против сывороточных белков севрюги, отловленной в р. Куре.
Опыты ставили, используя нормальные и абсорбированные антисыворотки. Абсорбцию антисывороток проводили с целью выявления специфических антигенов, по которым одна популяция может отличаться от другой. Наличие подобных антигенов у осетровых рыб на межвидовом и внутривидовом уровнях показано исследованиями С. И. Седова [7], А. И. Суриаля [8], Б. Б. Каратаевой [9], М. Ф. Субботкина [10] и др. Для выявления специфических антигенов проводили абсорбцию (истощение) поливалентных иммунных сывороток по принципу Кастеллани. Если антисыворотка была получена путем иммунизации кроликов сывороткой севрюги одной популяции, то абсорбцию проводили сывороткой севрюги другой популяции.
Для увеличения концентрации антител в сыворотке проводили её концентрирование в потоке воздуха. Полученная таким образом антисыворотка узкой специфичности использовалась для выявления качественных различий между сывороточными препаратами.
Иммунохимический анализ выполнен с использованием методов двойной иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза. Метод двойной иммунодиффузии позволяет проводить анализ антигенной смеси, т. к. каждая пара антиген - антитело образует свою линию преципитации, а также сравнение антигенных компонентов в различных системах [11]. Микромодификация
метода двойной иммунодиффузии дает возможность очень экономно использовать такой ценный препарат, как специфическая антисыворотка [12]. Реакцию двойной иммунодиффузии ставили в 1 % растворе агара фирмы «Дифко» (США), приготовленном на физиологическом растворе, руководствуясь рекомендациями по микрометоду. Основным штампом служил вариант «семёрка» с диаметром лунок и расстоянием между ними 4 мм. Для получения полной серологической характеристики двух систем антиген - антитело применяли постановку реакции диффузии по «квадратной схеме». Опыты ставили в чашках Петри размерами 60 х 15 мм или на предметных стеклах. Стекла после заполнения лунок помещали в чашки Петри размерами 110 х 20 мм. Преципитация проходила в течение 24-48 часов, после чего проводили регистрацию результатов опытов. Расшифровку реакции осуществляли в соответствии с общепринятой схемой, согласно которой полная идентичность сопоставляемых антигенов проявляется слиянием соответствующих им дуг преципитации. Полное различие сравниваемых антигенов проявляется образованием перекреста, т. е. пересечения линий преципитации. Частичное сходство сравниваемых антигенов можно обнаружить по образованию «шпоры» (отростка) в результате неполного слияния линий преципитации. Иммуноэлектрофорез проводили на предметных стеклах. Использовали 1 % агар «Дифко», приготовленный на веронал-мединаловом буфере или 1 % гель агарозы «Н» на трис-барбитуратном буфере. Ионная сила буфера 0,02; рН 8,6. Консервированные сыворотки перед анализом диализировали против кюветного буфера и выравнивали по белку до концентрации 35 мг/мл. Электрофорез проводили в модифицированной камере прибора ПЭФ-3, снабженной охлаждающей плитой. Благодаря этому поддерживался температурный режим от +11 до +13 °С. Продолжительность электрофореза при напряжении 10 В/см составляла, в зависимости от условий опытов, около 45 или 75 минут. Преципитация длилась 24-48 часов во влажной камере с раствором антисептика. Затем препараты отмывали в физиологическом растворе от непрореагировавшего белка и сканировали. Результаты хранили в компьютерной базе данных.
При расшифровке результатов реакций учитывали число полос преципитации, их форму, интенсивность и локализацию [9, 10, 11, 13]. Опыты двойной иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза с цельными (многокомпонентными) антисыворотками проводили в 10-15-кратной повторности, а с абсорбированными (моноспецифическими) антисыворотками - в 5-кратной повторности.
Результаты исследования и их обсуждение
В опытах двойной иммунодиффузии антисыворотка против сывороточных белков волжской севрюги формирует с гомологичными антигенами до 11 полос преципитации, а с гетероло-гичными антигенами - белками куринской севрюги - до 9-10 полос преципитации. Антисыворотка против белков куринской севрюги выявляет в гомологичной сыворотке до 10-11 полос преципитации, а в опытах с гетерологичными сыворотками волжской севрюги - до 11 линий преципитации, переходящих из одной зоны в другую без образования феноменов как частичной, так и полной неидентичности (шпор и перекрестов).
С помощью иммуноэлектрофореза сывороточные белки каждой из двух популяций севрюги удалось разделить на 22-25 индивидуальных антигенных компонентов (табл.).
Общее число и распределение антигенных компонентов по зонам электрофоретической подвижности у севрюги, отловленной в реках Волге и Куре
Анти- сыворотка Антиген Общее число компонентов Зоны электрофоретической подвижности
А1Ь аі- а2- Рі- 02- у-
ВС ВС 25 1 5 9 6 3 1
ВС КС 22-24 1 5 8-9 4-5 3 1
КС КС 25 1 5 9 6 3 1
КС ВС 25 1 5 9 6 3 1
Примечание. ВС - волжская севрюга; КС - куринская севрюга.
Расшифровка результатов иммуноэлектрофореза показала, что в зонах электрофоретической подвижности альбуминов и наименее подвижных у-глобулинов у волжской и куринской севрюги выявляется по одному компоненту. На первом месте по уровню гетерогенности оказались а2-глобулины, которые в опытах с обеими антисыворотками удается разделить на 8-9 компонентов. В области в^глобулинов, находящихся на втором месте по уровню гетерогенности,
обнаружено от 4 до 6 компонентов. Несколько менее гетерогенными являются а1-глобулины, представленные 5 компонентами. В зоне подвижности антигенов, относящихся к р2-глобулинам, у волжской и куринской севрюги выявлено по 3 компонента.
Основная масса этих компонентов иммунохимически идентична. Но в опытах с антисывороткой против сывороточных белков волжской севрюги в зоне а2-глобулинов в сыворотке крови волжской севрюги выявлено 9 компонентов. Одновременно в сыворотке крови куринской севрюги выявляется от 8 до 9 компонентов. В зоне электрофоретической подвижности Р^глобулинов у волжской севрюги обнаружено 6 антигенных компонентов, а у куринской севрюги выявляется от 4 до 5 антигенов сывороточных белков.
Опыты с реакцией двойной иммунодиффузии показали, что после абсорбции антисыворотки, полученной против белков волжской севрюги, сывороточными белками куринской севрюги она продолжала реагировать с белками волжской севрюги, формируя две полосы преципитации (рис. 1). Один из этих специфичных для волжской севрюги компонентов (А) проявляется в виде интенсивной, длинной, слегка изогнутой на концах линии преципитации. Он расположен ближе к лунке с антисывороткой. Второй специфичный компонент (Б) проявляется в виде прямой линии преципитации. Она несколько короче первого компонента. Этот компонент расположен ближе к лункам с антигенами. С белками куринской севрюги полосы преципитации не формируются.
Рис. 1. Выявление специфических антигенных компонентов в сыворотке волжской севрюги, отсутствующих у куринской севрюги: 7 - антисыворотка волжской севрюги, абсорбированная белками куринской севрюги. Антигены: 1, 3, 5 - куринской севрюги;
2, 4, 6 - волжской севрюги. А, Б - специфические антигены волжской севрюги
Результаты иммуноэлектрофоретического анализа показали, что эти два специфических компонента находятся в зоне р1-глобулинов (рис. 2).
+
Рис. 2. Иммуноэлетрофоретический анализ локализации специфических антигенных компонентов волжской севрюги, отсутствующих у куринской севрюги.
В траншее - антисыворотка волжской севрюги, абсорбированная белками куринской севрюги. Антигены севрюги: 1 - волжской; 2 - куринской
На иммуноэлектрофореграмме они представлены в виде двух слабоизогнутых дуг, расположенных ближе к лунке с антигенами. Обе дуги преципитации, начинаясь в зоне а2-глобулинов, тянутся в виде узких полос через всю зону р1-глобулинов, немного заходят в зону р2-глобулинов, где и оканчиваются.
Таким образом, у волжской севрюги имеются два антигенных компонента, отсутствующие у куринской севрюги. Оба специфических для волжской севрюги антигена локализуются в зоне подвижности р1-глобулинов. После абсорбции антисыворотки против белков куринской севрюги белками волжской севрюги она переставала реагировать и с гомологичными, и с гете-рологичными антигенами. Это означает, что в антисыворотке куринской севрюги нет специфических антигенов, отсутствующих у волжской севрюги.
Заключение
Сравнительный анализ сывороточных белков севрюги, обитающей в бассейне Каспийского моря, проведенный с помощью иммунохимических методов, выявил сложный состав и мно-гокомпонентность антигенов сыворотки крови севрюги. Обобщая полученные данные, необходимо отметить, что севрюга, обитающая в бассейне Каспийского моря, гетерогенна по антигенам сывороточных белков и сопоставима в этом отношении с другими видами осетровых рыб. Например, С. И. Седову [7] и Б. Б. Каратаевой [9] методом иммуноэлектрофореза в сывороточных белках русского осетра удалось выявить от 15 до 18 самостоятельных в антигенном отношении индивидуальных белков, у белуги - от 16 до 19 компонентов.
Нам удалось, используя новую схему иммунизации кроликов, выявить у севрюги от 22 до 25 антигенных компонентов. У севрюги, как и у других видов осетровых, альбумины оказались гомогенными в антигенном отношении, а глобулины - наиболее высокогетерогенными. Следует отметить, что у персидского осетра и севрюги наиболее гетерогенными являются а-глобулины (а1- и а2-), а у русского осетра и белуги гетерогенность различных фракций глобулинов (а- и Р-) более или менее одинакова. Наконец, у-глобулины, представляющие собой наиболее тяжёлые и наименее подвижные сывороточные белки, у всех исследованных видов каспийских осетровых гомогенны в антигенном отношении. И в этом проявляется их сходство с наиболее легкими и наиболее подвижными сывороточными белками - альбуминами.
Перекрестная абсорбция антисывороток позволила установить наличие специфических антигенов, по которым волжская и куринская севрюги различаются между собой. У волжской севрюги выявлено два специфических антигена (в зоне электрофоретической подвижности Р1-глобулинов), отсутствующих у куринской севрюги. Полученные данные свидетельствуют, что популяции севрюги, нерестящиеся в реках Волге и Куре, являются иммуногенетически, а следовательно, и репродуктивно самостоятельными.
Таким образом, совокупность полученных данных по иммунохимическому анализу сывороточных белков севрюги, обитающей в бассейне Каспийского моря, свидетельствует об обоснованности выделения популяций, нерестящихся в реках Волге и Куре.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ходоревская Р. П., Рубан Г. И., Павлов Д. С. Поведение, миграции, распределение и запасы осетровых рыб Волго-Каспийского бассейна. - М.: Товар-во науч. изд. КМК, 2007. - 242 с.
2. Переварюха А. Ю. Моделирование эффекта волнообразной кривой воспроизводства популяций рыб // Экологические системы и приборы. - 2008. - № 8. - С. 41-44.
3. Иванов В. П., Мажник А. Ю. Рыбное хозяйство Каспийского бассейна (Белая книга). - М.: ТОО «Журнал «Рыбное хозяйство», 1997. - 40 с.
4. Алтухов Ю. П. Генетические процессы в популяциях: учеб. пособие / отв. ред. Л. А. Животов-ский. - М.: ИКЦ «Академкнига», 2003. - 431 с.
5. Переварюха Т. Ю. Некоторые правовые и биологические аспекты сохранения биоразнообразия при искусственном воспроизводстве рыб (на примере осетровых) // Вестн. Астрахан. гос. техн. ун-та. Сер.: Рыбное хозяйство. - 2010. - № 1. - С. 107-113.
6. Аннотированный каталог круглоротых и рыб континентальных вод России / под ред. Ю. С. Решетникова. - М.: Наука. 1998. - 218 с.
7. Седов С. И. Сравнительный иммунохимический анализ белков сыворотки крови рыб на примере осетровых и карповых: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Ростов н/Д: Ростов. гос. ун-т, 1973. - 25 с.
8. Суриаль А. И. Фракционный состав сывороточных белков и гемоглобина крови шипа (Атрвтвг пыЖувпМз Ьоу.) в связи с особенностями его экологии: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М.: ВНИРО, 1974. - 26 с.
9. Каратаева Б. Б. Антигенная дифференциация сывороточных белков сезонных рас каспийских осетровых: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Севастополь: Ин-т биологии южных морей АН УССР, 1977. - 20 с.
10. Субботкин М. Ф. Антигенная дифференциация сывороточных белков осетровых рода АЫрвтвг:
автореф. дис...канд. биол. наук. - М.: ВНИРО, 1991. - 24 с.
11. Иммунологические методы / под ред. Х. Фримеля. - М.: Мир, 1979. - 518 с.
12. Гусев А. И. Микрометод преципитации в агаре // Иммунохимический анализ. - М.: Медицина, 1968. - С. 99-119.
13. Грабар П., Буртэн П. Иммуноэлектрофоретический анализ: применение для исследования биологических жидкостей человека. - М.: Изд-во иностр. лит., 1963. - 207 с.
Статья поступила в редакцию 12.09.2011
ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРЕ
Переварюха Татьяна Юрьевна - Астраханский государственный технический университет; аспирант кафедры «Гидробиология и общая экология»; [email protected].
Perevaryukha Tatyana Yurievna - Astrakhan State Technical University; Postgraduate Student of the Department "Hydrobiology and General Ecology "; [email protected].
