CC BY
167. Cinco M., Ruscio M., Rapagna F. Evidence of Dbps (decorin binding proteins) among European strains of Borrelia burgdorferi sensu lato and in the immune response of LB patient sera. FEMS Microbiol. Lettt. 2000, 183 (1): 111-114.
8. Crowder C.D., Matthews H.E., Schutzer S. et al. Genotypic variation and mixtures of Lyme Borrelia in Ixodes ticks from North America and Europe. PLoS One. 2010, 14; 5 (5): e 10650.
9. Heikkila T., Seppala I., Saxen H. et al. Cloning of the gene encoding the decorin-binding protein B (DbpB) in Borrelia burgdorferi sensu lato and characterisation of the antibody responses to DbpB in Lyme borreliosis. J. Med. Microbiol. 2002, 51: 641-648.
10. Junttila J., Peltomaa M., Soini H. et al. Prevalence of Borrelia burgdorferi in Ixodes ricinus ticks in urban recreational areas of Helsinki. J. Clin. Microbiol. 1999, 37 (5): 1361-1365.
11. Mavin S., Evans R., Milner R. M. et al. Local Borrelia burgdorferi sensu stricto and Borrelia afzelii strains in a single mixed antigen improves western blot sensitivity. J. Clin. Pathol. 2009, 62: 552-554.
12. Panelius J., Sillanpää H., Seppälä I. et al. Antibodies to recombinant decorin-binding proteins A and B in the cerebrospinal fluid of patients with Lyme neuroborreliosis. Scand. J. Infect. Dis. 2007, 39 (9): 775-780.
13. Postic D., Assous M.V., Grimont P.A.D. et al. Diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato evidenced by restriction fragment length polymorphism of rrf (5S)-rrl (23s) intergenic spacer amplicons. Int. J. Syst. Bacteriol. 1994, 44 (4): 743-752.
14. Randall L.L., Hardy S.J.S. Correlation of competence for export with lack oftertiary structure of the mature species: a study in vivo of maltose-binding protein in E. coli. Cell. 1986, 46 (6): 921-928.
15. Stanek G, Reiter M. The expanding Lyme Borrelia complex—clinical significance of genomic species? Clin. Microbiol. Infect. 2011, 17(4): 487-493.
Поступила 23.10.12
Контактная информация: Караваев Виталий Семенович,
630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2, р.т. (383)306-44-71
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
Н.Р.Телесманич, Е.А.Меньшикова, В.В.Агафонова, Ю.М.Ломов, А.Б.Мазрухо, И.В.Архангельская, В.Д.Кругликов, Л.В.Ларионова, Д.И.Симакова, Е.М.Курбатова, А.В.Миронова
СЕРОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ХОЛЕРНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ АНТИГЕННЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ
Ростовский-на-Дону противочумный институт
Цель. Оценка показателей качества сконструированных холерных антигенных полимерных диагностикумов с помощью комплекса специфичных противохолерных сывороток. Материалы и методы. Сенситином для экспериментальных препаратов являлись клеточные лизаты штаммов Vibrio cholerae cholerae 1395, V. eltor Огава 2044, V. eltor Инаба 13020, V. cholerae О139 16064. В качестве контроля использовали 3 сыворотки от больных холерой, нормальную человеческую сыворотку, холерные О1 (Огава, Инаба) коммерческие лошадиные, холерные О139 коммерческие кроличьи и гетерологичные сыворотки к ши-геллам, сальмонеллам, эшерихиям и иерсиниям, а также экспериментальные холерные кроличьи сыворотки О1 и О139. Результаты. В ходе исследования установили, что по
показателям качества диагностикумы на основе сенсетинов штаммов V. cholerae cholerae 1395 и V. cholerae О139 16064 можно в дальнейшем использовать для конструирования данных диагностикумов. Заключение. Контролем экспериментальных диагностикумов при отсутствии человеческих сывороток от больных холерой могут служить антителосодержа-щие препараты — коммерческие лошадиные сыворотки О1, кроличьи экспериментальные и коммерческие сыворотки и МКА О139, демонстрирующие титры не ниже 1/51201/10240.
Журн. микробиол., 2013, № 3, С. 79—83
Ключевые слова: холерные антигенные полимерные диагностикумы, Vibrio cholerae, лизаты штаммов, сенситины
N.R.Telesmanich, E.A.Menshikova, V.V.Agafonova, Yu.M.Lomov, A.B.Mazrukho, I.V.Arkhangelskaya, V.D.Kruglikov, L.V.Larionova, D.I.Simakova, E.M.Kurbatova, A.V.Mironova
SEROLOGIC STUDY OF EXPERIMENTAL CHOLERA POLYMER ANTIGEN DIAGNOSTICUMS
Rostov-on-Don Research Institute of Plague Control, Russia
Aim. Evaluation of quality indicators of constructed cholera antigen polymer diagnosticums by using a complex of specific anti-cholera sera. Materials and methods. Cell lysates of cholera vibrio strains Vibrio cholerae cholerae 1395, V. eltor Ogawa 2044, V. eltor Inaba 13020, V. cholerae О139 16064 were sensitins for experimental preparations. 3 sera from cholera patients, normal human sera, cholera O1 (Ogawa, Inaba) commercial horse, cholera O139 commercial rabbit and heterologic sera against shigella, salmonella, escherichia and yersinia as well as experimental cholera rabbit sera against O1 and O139 were used as control. Results. The study established that diagnosticums based on V. cholerae cholerae 1395 and V. cholerae О139 16064 strain sensitins by quality indicators may be used in the future for construction of these diagnosticums. Conclusion. Antibody containing preparations — commercial horse O1 sera, rabbit experimental and commercial sera and MCA O139 demonstrating titers not lower than 1/5120-1/10240 may serve as a control of experimental diagnosticums in the absence of human sera from cholera patients.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 3, P. 79—83
Key words: cholera antigen polymer diagnosticums, Vibrio cholerae, strain lysates, sensitins
Комплекс серологических методов в диагностике холеры используют как при идентификации возбудителя, так и с целью выявления противохолерных антител в крови. Значимость выявления противохолерных антител у людей, величина и динамика их титров рассматриваются и оцениваются в сочетании с клинической картиной, эпидемиологической ситуацией и характеристикой обследуемого контингента [8, 10]. Серологические методы исследования для выявления противохолерных антител, как правило, имеют дополнительное значение, но при проведении ретроспективного эпидемиологического анализа их результаты могут быть решающими. Серологическое обследование позволяет подтвердить диагноз у больных с клиникой холеры при отсутствии возможности выделения возбудителя в случае лечения антибиотиками до взятия анализа на идентификацию [2, 3]. Ранее при невозможности исследования парных сывороток от больных и носителей при однократном заборе материала был установлен диагностический титр агглютининов при взаимодействии сывороток от переболевших со штаммами холерных вибрионов, циркулирующими в очаге, равный 1/40 [1].
В серологической диагностике холеры в соответствии с действующими МУК
4.2.2315-08 «Серологические методы в диагностике холеры» предложены подходы с использованием эритроцитарных препаратов для постановки реакции пассивной (непрямой) гемагглютинации РПГА (РНГА), реакции пассивной гемагглютинации с энтеротоксическим холерным диагностикумом (РПГАэхэд) и реакции нейтрализации антигена РНАг [6]. Эти методы позволяют выявить в сыворотках больных, переболевших, вибриононосителей и вакцинированных специфические антитела (агглютинины и антитоксины) [4, 7]. Необходимо отметить, что коммерческие эритроцитарные диагностикумы (антигенный для РНГА, иммуноглобулиновый для РНАг, энтероток-сический для РНГА) выпускает Казахский центр карантинных и зоонозных инфекций, и в настоящее время применение их в России ограничено. Следовательно, представляется целесообразным расширение арсенала отечественных доступных, чувствительных и специфичных препаратов для комплексной серологической диагностики холеры у людей за счет создания препаратов на основе полимерных носителей как более совершенный аналог эритроцитарных диагностикумов. В этой связи привлекает внимание возможность создания латексных полимерных диагностикумов для реакции аггломерации объемной (РАО) [5, 9].
Одним из необходимых этапов при создании таких диагностикумов является моделирование системы контроля и оценки показателей качества при использовании специфических противохолерных сывороток (кроличьих, лошадиных) и монокло-нальных антител, так как сыворотки от больных и вакцинированных людей труднодоступны.
Цель исследования — оценка показателей качества сконструированных холерных антигенных полимерных диагностикумов с помощью комплекса специфичных противохолерных сывороток.
В работе использовали антигенные холерные видо- и серовароспецифические диагностикумы на полимерном носителе. Сенситином для препаратов являлись клеточные лизаты штаммов холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп: I — V cholerae cholerae 1395, II — V. eltor Огава 2044, III — V. eltor Инаба 13020, IV — V cholerae О139 16064 (номера штаммов холерных вибрионов приведены в соответствии с нумерацией по Музею живых культур РостНИПЧИ).
В качестве контроля диагностикумов в РАО использовали в сравнительном аспекте: 1) кроличьи экспериментальные сыворотки, полученные в лаборатории микробиологии холеры РостНИПЧИ к штаммам V cholerae eltor Огава (№ 16078, 2044), V cholerae eltor Инаба (№ 13020), V. cholerae cholerae 1395 и V. cholerae non О1/О9; 2) экспериментальные серии эмоноклональных антител к антигенным эпитопам холерных вибрионов О1, 0139 и серовара Инаба, полученные в группе гибридом РостНИПЧИ; 3) коммерческие лошадиные сыворотки к холерным вибрионам О1 и О139 серогрупп, сероварам Огава и Инаба производства РостНИПЧИ «Микроб». В качестве позитивного контроля использовали сыворотки от больных холерой (возбудитель V.cholerae eltor), прибывших в 2010 году из Индии в Москву (3 сыворотки), а для контроля постановки реакции использовали нормальную человеческую сыворотку (НЧС). Для изучения специфичности диагностикумов в отношении холерных антител в РАО исследовали гетерологичные коммерческие сыворотки к шигеллам, сальмонеллам, эшерихиям и иерсиниям.
Сыворотки коммерческие лошадиные и экспериментальные холерные кроличьи предварительно разводили физиологическим раствором 1/10 и в этом разведении и дальнейшей раститровке использовали для постановки РАО. Моноклональные антитела к О1, О139, Инаба, сыворотки от больных людей и НЧС исследовали цельными с последующими двукратными разведениями.
Постановку реакции агломерации осуществляли по общепринятой методике: исследуемый материал (50 мкл) — в данном случае сыворотки и МКА — титровали в 50 мкл НКС; далее в каждую лунку вносили полимерные антигенные диагностикумы в рабочем разведении в объеме 25 мкл. В качестве контроля использовали нормальную
6. ЖМЭИ 3 № 5184
81
человеческую сыворотку и нормальную кроличью сыворотку с испытуемыми диа-гностикумами. Результаты учитывали через 1,5 — 2 часа от начала реакции.
В ходе исследования показано, что полимерный дагностикум на основе клеточного лизата классического холерного вибриона (V еИо1егае еИо1егае 1395) выявлял специфические противохолерные антитела в высоких титрах в коммерческих лошадиных сыворотках О1 (1/5120); Огава (1/2560); значительно ниже в Инаба (1/80). Эти данные подтверждали реакцию диагностикума с сыворотками от больных холерой людей с ранее подтвержденным диагнозом при помощи бактериологических исследований. В реакции с диагностикумом (V. еИо1егае еИо1егае 1395) были обнаружены противохолерные антитела в трех испытуемых сыворотках от больных холерой: № 1 — 1/2560, № 2 — 1/5120, № 3 — 1/80. Контроль диагностикума V еИо1егае еИо1егае 1395 на препаратах МКА практически не оправдал себя, выявляя специфические иммуноглобулины к V. еИо1егае О1 (1/4), Инаба (1/2). С МКА к V. еИо1егае О139 реакция диагностикума V. еИо1егае еИо1егае 1395 была отрицательной. С коммерческой лошадиной и экспериментальными кроличьими сыворотками к V еИо1егае О139 (16064) данный диагностикум, как и другие два к вибрионам эльтор (V еИо1егае еНог 2044 Огава и 13020 Инаба), давали перекрестные реакции в титрах 1/40 — 1/80. Однако это приемлемый факт, и с точки зрения выявления антител к возбудителю холеры даже полезен. Таким образом, диагностикум V еИо1егае еИо1егае 1395 выявляет антитела ко всем представителям возбудителя холеры (V. еИо1егае еИо1егае, V. еИо1егае еКог, V. еИо1егае О139).
Экспериментальные диагностикумы на основе V. еИо1егае еНог Огава 2044, Инаба 13020 в высоких титрах взаимодействовали только с коммерческой лошадиной сывороткой О1 (1/2560 — 1/5120); средний минимальный титр остальных испытуемых сывороток (лошадиных и кроличьих) составлял 1/40, что подтверждает сформировавшиеся ранее представления о том, что результат исследования сыворотки больного при положительной реакции агглютинации 1/40 и выше считается ориентировочно положительным. При исследовании трех сывороток от больных холерой были получены следующие результаты: V. еИо1егае еНог 2044 Огава — сыворотка № 1 — 1/32, сыворотка № 2 — 1/32, сыворотка № 3 — 1/64, что не позволяет рекомендовать сен-ситины V. еИо1егае еНог Огава 2044 и Инаба 13020 для конструирования диагностических препаратов. Максимальный титр нормальной человеческой сыворотки составлял 1/8 — 1/16 со всеми диагностикумами.
Полимерный диагностикум на основе клеточных лизатов V. еИо1егае О139 проявлял высокую активность и специфически взаимодействовал с коммерческой сывороткой О139 в высоких титрах (1/10240). Перекрестные реакции были выявлены с лошадиными сыворотками О1, Огава, Инаба. Минимальный перекрестный титр со всеми сыворотками к V. еИо1егае О1 — 1/40. Что подтверждает возможность данного диагностикума выявлять антитела к возбудителям холеры. А низкий титр 1/40 в сыворотках больных, выявляемый с помощью диагностикума V. еИо1егае О139, может свидетельствовать о наличии возбудителя V. еИо1егае еНог, аналогично, если такая ситуация возникнет при использовании диагностикума V. еИо1егае еИо1егае 1395. Интересным является тот факт, что в случае диагностикума V. еИо1егае О139 эффективным оказался контроль при использовании гомологичных МКА (титр 1/10240). Все сконструированные диагностикумы были специфичны холерным антителам и не всупали в реакцию с гетерологичными сыворотками: шигелезной, сальмонеллезной, эшерихиозной и иерсиниозной.
Таким образом, сенситины на основе штаммов V. еИо1егае еИо1егае 1395 и V еИо-1егае О139 16046 можно в дальнейшем использовать как для конструирования данных диагностикумов, так и для реакции агглютинации с целью комплексной оценки ситуации.
Исходя из результатов данного исследования моделью контроля сконструированных диагностикумов при отсутствии человеческих сывороток от больных холерой
могут быть антителосодержащие препараты, реагирующие со сконструированными диагностикумами в титре не менее 1/5120 — 1/10240. В данном исследовании — это лошадиные сыворотки О1 при контроле диагностикума V. cholerae 1395, кроличья коммерческая сыворотка О139 при контроле диагностикума V cholerae О139 16064 и МКА О139.
ЛИТЕРАТУРА
1. Адамов А.К. Иммунология холеры. Саратов, 1981.
2. Ефременко В.И., Савельев В.Н. Лабораторная диагностика холеры: состояние и перспективы. В: Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней. 2003, с.57-62;
3. Королев Ю.С., Иванова С.М., Кюрегян А.А. и др. О значении систем серологических реакций при обследовании людей на холеру. В: Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней. 2003, с.97-98.
4. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство. М., 2009.
5. Леви М.И., Басова Н.Н. Эритроцитарные диагностикумы и их применение в серологии. Проблемы ООИ. 1970, 2: 207-213.
6. Мазрухо Б.Л., Поляков И.И. Получение и использование холерного антигенного эри-троцитарного диагностикума. Журн. микробиол. 1976, 1: 26-30.
7. Подосинникова Л.С., Ломов Ю.М., Королев Ю.С., и др. Серологическая диагностика холеры. В: Холера и патогенные для человека вибрионы. 2005, 18: 131-133.
8. Савельева И.В. Экспериментальная разработка липосомального энтеротоксического диагностикума для серологической диагностики холеры. Автореф. дис.канд.мед.наук. Ставрополь, 2002.
9. Телесманич Н. Р., Ломов Ю. М., Агафонова В.В. и др. Конструирование антилипазно-го иммуноглобулинового полимерного диагностикума для выявления штаммов холерных вибрионов эльтор, обладающих гемолитической и липазной активностью. Журн. микробиол. 2006, 1: 57-60.
10. Цыбин Б.П. Применение реакции пассивной гемагглютинации в изучении антитоксического и антибактериального иммунитета у вибриононосителей. Проблемы ООИ. 1975, 1 (41): 117-121.
Поступила 23.10.12
Контактная информация: Телесманич Наталья Робертовна, д.б.н., 344002, Ростов-на-Дону, ул. М. Горького, 117/40, р.т. (8632)240-35-94
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 Л.П.Блинкова, Ю.Д.Пахомов, О.В.Дмитриева
ОБНАРУЖЕНИЕ НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФОРМ БАКТЕРИЙ В ЛИОФИЛИЗИРО-ВАННЫХ ПРЕПАРАТАХ ПРОБИОТИКОВ
НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва
Цель. Обнаружение среди лиофильно высушенных клеток промышленных пробиоти-ков жизнеспособных, но некультивируемых форм. Материалы и методы. Объектами исследования являлись серии 9 пробиотических препаратов (колибактерин, бификол, би-фидумбактерин, бифиформ) с истекшим (до 30 лет хранения) или действующим сроком годности. Общее количество бактерий рассчитывали под микроскопом в камере Горяева, число жизнеспособных клеток определяли в люминесцентном микроскопе после окрашивания набором флуоресцентных красителей, количество КОЕ/мл оценивали методом посева на соответствующие плотные или полужидкие питательные среды. Результаты. Сопоставление величин указанных показателей позволило установить, что в лиофили-зированных препаратах колибактерина с истекшим сроком хранения количество живых,
