CC BY
49
УДК 616.932:616-07
Т.В.Аленкина1, Г.В.Бочкарева1, Л.В.Саяпина2, И.В.Касина2, И.В.Шульгина1, О.А.Лобовикова1,
Е.Г.Абрамова1, О.В.Громова1, А.К.Никифоров1
РАЗРАБОТКА И ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ВНЕДРЕНИЯ ПРЕПАРАТА «ИММУНОГЛОБУЛИНЫ ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ ХОЛЕРНЫЕ О139»
1ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов;
2 ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», Москва
Разработан новый препарат, предназначенный для индикации и идентификации возбудителя холеры О139 се-рогруппы в мазках из различных материалов и чистых культур методом флуоресцирующих антител. Диагностикум прошел все этапы Государственных приемочных испытаний, в результате которых был оценен как высокоспецифичный, так как не выявлял штаммы, не относящиеся к Vibrio cholerae О139 серогруппы в концентрации бактерий 108 в 1 мл. Чувствительность с чистыми культурами холерных вибрионов О139 серогруппы составляла 5^105-5-106 м.к./мл, при исследовании биологических объектов - 106-107 м.к./мл, объектов внешней среды -5^105-5-106 м.к./мл. Была определена перспективность применения иммуноглобулинов в практике здравоохранения и даны рекомендации к регистрации в Российской Федерации в качестве изделия медицинского назначения.
Ключевые слова: иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные О139, V. cholerae О139, метод флуоресцирующих антител, государственные испытания
T.V.Alenkina1, G.V.Bochkareva1, L.V.Sayapina2, I.V.Kasina2, I.V.Shul’gina1, O.A.Lobovikova1, E.G.Abramova1, O.V.Gromova1, A.K.Nikiforov1
Development and Main Stages of Introduction of the Preparation “Cholera O139 Diagnostic Fluorescent Immunoglobulins”
1Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov; 2Research Center for Evaluation of Products for Medical Application, Moscow
Developed was a new preparation intended for cholera O139 agent indication and identification in the smears and pure cultures, using fluorescent antibodies method. The diagnosticum underwent State validation procedure, and was evaluated as a highly specific preparation. Its sensitivity was shown to be equal to 5^105—5^106 m.c./ml for pure cultures of V cholerae O139, 106—107 - for biological objects and 5-105-5-106 - for environmental objects. Application of the preparation for practical purposes was considered to be promising, and it was recommended for State registration as a product of medical application.
Key words: cholera O139 diagnostic fluorescent immunoglobulins, V. cholerae O139, fluorescent antibodies method, State validation procedure.
Появление в 1992 г. холерного вибриона О139 серогруппы, который явился причиной вспышки диарейных заболеваний, принявших в дальнейшем характер крупных эпидемий, опровергло долго существовавшее представление о том, что только холерные вибрионы О1 группы способны вызывать эпидемии и пандемии [5, 6], и вызвало необходимость создания препаратов для обнаружения данного патогена.
Первым препаратом для детекции Vibrio cholerae О139, зарегистрированным в Российской Федерации (РУ ФСр № 2008/03209) и внесенным в перечень препаратов для диагностики холеры, стала разработанная в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» сыворотка диагностическая холерная не О1 группы О139 адсорбированная кроличья для реакции агглютинации (РА) на стекле [4].
Однако достоверность лабораторной диагностики холеры «Бенгал» может быть достигнута при комплексном применении различных методов - от классической реакции агглютинации до тест-систем,
разработанных на основе таких современных технологий, как гибридомная биотехнология, или с помощью генодиагностических методов [1, 2, 10]. В то же время при конструировании диагностических препаратов немаловажным фактором является их доступность для практического здравоохранения.
Метод флуоресцирующих антител (МФА) занимает ведущее место в индикации возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний благодаря высокой иммунологической чувствительности в сочетании с точностью микроскопического анализа. Чувствительность МФА при приготовлении мазков из взвеси бактерий составляет Ы05-5405 м.к./мл. Метод надежно зарекомендовал себя при обнаружении возбудителя холеры О1 серогруппы. Отсутствие подобного диагностикума для индикации V. ско!ете О139 обусловило актуальность работ в этом направлении.
Целью исследований была разработка препарата для индикации и идентификации V. ско!ете О139 в
прямом МФА и внедрение его в практику здравоохранения.
Основные этапы работы заключались в разработке биотехнологической схемы получения диагно-стикума, проведении всех этапов Государственных испытаний и регистрации препарата в качестве изделия медицинского назначения (ИМН).
Материалы и методы
В качестве животных-продуцентов гиперим-мунных холерных О139 сывороток были использованы кролики породы шиншилла массой (2,5±0,5) кг. Иммунизацию проводили препаратом О-антигена, выделенного ультрафильтрацией из формалини-зированного безмикробного супернатанта штамма V cholerae O139 МО-45. Данный антиген характеризуется тем, что на всех стадиях очистки сохраняет однофазное растворенное состояние. Однородность фазового состояния при выделении О-антигена позволяет сохранять неизменной нативную конформацию его специфических эпитопов, определяющих серологическую активность липополисахаридного комплекса [7].
Активность и специфичность полученных сывороток определяли в объемной РА и оценивали в соответствии с нормативной документацией (НД) на аналогичные препараты.
Адсорбентами являлись формалинизирован-ные клетки штаммов V. cholerae не О1 169-68 О22 серогруппы, V. cholerae О1 М-41 (Огава) и 569В (Инаба), выращенные методом глубинного культивирования. Свойства адсорбентов стабилизировали лиофилизацией.
Контроль специфической активности гипе-риммунных сывороток и экспериментальных серий препарата иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих холерных О139 кроличьих адсорбированных проводили на штаммах V. cholerae O139 серогруппы: Р-16064, Р-16131, 1306, 1311, АР-1. Специфичность препарата изучали на штаммах V. cholerae cholerae 1488а (Инаба), М-47 (Огава); V. cholerae eltor 118 (Инаба), 7/96 (Огава), а также V. cholerae не О1 N СТС 4716 (О4), В-4202-64 (О5), 7007-62 (О6), 11416-62 (О13), В 5267-64 (О18), КМ-24 (О22), 14438-62 (О24), 12630-62 (О28), 161-68 (О29), 152-68 (О34), 14520 (О41). Все штаммы были получены из Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
Культуры холерных вибрионов выращивали при температуре (37±1) °С в течение 18-20 ч на жидких и плотных питательных средах - мясопептонном бульоне Мартена, бульоне Хоттингера, агаре Мартена и Хоттингера, рН всех сред - 7,7±0,1.
Бактериальные суспензии с концентрацией 109 м.к./мл готовили на 0,9 % растворе натрия хлорида по оптическому стандарту мутности бактериальных взвесей 5 единиц.
Иммуноглобулиновую фракцию из сыворотки животных выделяли однократным осаждением 3М
раствором (NH4)2SO4 при 45 % насыщении.
Конъюгирование иммуноглобулинов с флуорес-цеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) («Sigma», США) проводили по методу J.D.Marshall et al. (1958).
Освобождение иммуноглобулиновой фракции от (NH4)2SO4, а также удаление ФИТЦ, химически не связанного с белком, осуществляли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 в 0,5 М натрий карбонат-бикарбонатном буфере при рН 9,2±0,1.
Уровень специфической активности и специфичности изготовленных серий иммуноглобулинов определяли в прямом МФА. Степень яркости свечения бактерий оценивали по общепринятой 4-крестовой системе: 4 креста - сверкающая флуоресценция оболочки микробной клетки, четко контрастирующая с темным телом клетки; 3 креста - яркая флуоресценция оболочки микробной клетки; 2 или 1 крест - слабое свечение всей клетки или едва заметные контуры. Препарат в рабочем разведении должен обеспечивать специфическое свечение V. cholerae O139 интенсивностью 3-4 креста. Свечение на 1-2 креста является неспецифическим и не учитывается.
Результаты и обсуждение
Для выполнения поставленной цели необходимым условием являлось получение качественного сырья - гипериммунной кроличьей сыворотки с минимальным содержанием гетерологичных антител. Первоначальные опыты по созданию флуоресцирующих иммуноглобулинов к V. cholerae O139 на основе кроличьей сыворотки О139, полученной с использованием корпускулярного О-антигена бескапсульного варианта штамма V cholerae О139 Р-16064, показали, что основной недостаток выделенных иммуноглобулинов заключался в необходимости проведения неоднократных адсорбций препарата с целью удаления гетерологичных антител. Присутствие большого количества перекрестно реагирующих антител в сыворотке-полуфабрикате было обусловлено не только высоким генетическим сродством холерных вибрионов О139 и О22 серогрупп (более 90 %), но и структурными изменениями в составе О-антигена под воздействием высокой температуры, поскольку при изготовлении корпускулярного О-антигена способом инактивации микробной клетки является кипячение в течение 2 ч. При такой обработке неизбежна частичная деградация терминальных строгоспецифичных полисахаридных боковых цепей, в результате чего обнажаются участки липополисаха-рида (коровая часть), являющиеся группоспецифическими антигенными детерминантами [11].
Немаловажным фактором, предопределяющим интенсивность антителообразования, является физическое состояние антигена, а также степень его очистки. На основании этого в качестве альтернативы был выбран растворимый О-антиген, полученный способом [7].
Подбор способов аппликации О-антигена, доз и
кратности введения определил наиболее оптимальную схему иммунизации - 2-цикловая схема иммунизации большими дозами O-антигена (до 8 мг) при внутривенном способе введения. Активность холерных Oi39 сывороток, полученных по такой схеме, составляла в объемной РА 1:1600-1:2000. Неспецифические реакции со штаммами холерных вибрионов Oi и O22 серогрупп у 59,22 % продуцентов отсутствовали, у 40,78 % находились на уровне 1:200. Таким образом, сыворотки-полуфабрикаты от кроликов, иммунизированных O-антигеном, полученным способом [7], по активности и специфичности соответствовали требованиям, предъявляемым к качеству полуфабриката для изготовления флуоресцирующих иммуноглобулинов. Минимальная активность сывороток-полуфабрикатов, пригодных для последующего изготовления иммуноглобулинов флуоресцирующих холерных Oi39, была установлена в пределах 1:400.
Изучение сывороток, полученных от 87 кроликов-продуцентов в непрямом МФА с холерными вибрионами O2-O82 серогрупп, показало отсутствие перекрестных реакций с указанными штаммами, за исключением V. cholerae не Oi i69-68, относящегося к O22 серогруппе, и подтвердило высокую специфичность полуфабрикатов, применяемых для изготовления препарата. Штамм V. cholerae не Oi i69-68 был внесен в технологическую схему в качестве адсорбента. Кроме того, результаты тестирования сывороток послужили основанием для внесения в НД в качестве контрольных культур, помимо холерных вибрионов классического и эльтор биоваров сероваров Инаба и Oгава, только i i штаммов V. cholerae не O1 серогруппы - O4, O5, O6, O13, O18, O22, O24, O28, O29, O34, O41, наиболее часто встречающиеся на территории Российской Федерации, а также штамм V. cholerae не O1 КМ-24 (357) O22 серогруппы.
Диагностические препараты, как правило, изготавливают из полуфабрикатов, подвергшихся хранению при температуре 2-8 °С не менее 6 мес. [8]. Целью такого выдерживания является, во-первых, физическое просветление сывороток благодаря оседанию на дно бутыли белков макроглобулиновой природы. Во-вторых, стабилизация активности полуфабриката. Титр сыворотки, первое время падающий иногда весьма резко, к концу 3-6-го месяца становится относительно устойчивым. В дальнейшем возможно снижение активности лишь в небольших пределах (до i0 % за год).
Изучение стабильности свойств гипериммун-ных холерных O139 кроличьих сывороток в процессе хранения показало, что i00 % исследованных полуфабрикатов сохраняли первоначальную активность в течение 5 лет (срок наблюдения). У 92 % сывороток наблюдалось снижение уровня гетерологичных антител на 1-2 порядка в течение 3 и более месяцев. Это объясняется тем, что в условиях гипериммунизации в организме продуцента вырабатываются специфические антитела, относящиеся к классу G. IgG являют-
ся пространственно стабильными молекулами и характеризуются устойчивостью к физико-химическим воздействиям. Неспецифические антитела, идентифицированные как IgM [8], быстрее разрушаются в процессе хранения вследствие своей лабильности, а также образуют конгломераты и выпадают в осадок. На основании полученных данных был установлен срок, необходимый для стабилизации сывороток-полуфабрикатов, - не менее 3 мес.
Как правило, для изготовления флуоресцирующих диагностических препаратов используют не цельную иммунную сыворотку, а выделяют ее глобу-линовую фракцию для последующего присоединения флуорохрома [3]. Этим достигается концентрирование активных иммунных белков для конъюгации, а удаление балластных белков альбуминовой фракции, во-первых, позволяет снизить неспецифические реакции, обусловленные высокой реакционной способностью альбумина, во-вторых, уменьшает расход флуорохрома.
Для выделения иммуноглобулиновой фракции оптимальным оказался метод осаждения сульфатом аммония, который обеспечивал хорошую степень очистки, высокий выход и сохранение иммунологической активности антител.
После конъюгирования холерных О139 иммуноглобулинов с ФИТЦ следовал этап адсорбции форма-линизированными клетками гетерологичных штаммов. Перекрестно реагирующие антитела полностью удалялись в результате одной адсорбции. В 96,4 % случаев это не влияло на специфическую активность иммуноглобулинов. В 3,6 % случаев отмечалось снижение специфической активности иммуноглобулинов в 2 раза.
Лиофилизацию препарата осуществляли в течение (34±2) ч. В качестве стабилизатора использовали 0,9 % сахарозы и 0,1 % натрия тиосульфата. Герметизацию ампул с сухим препаратом проводили под вакуумом.
Изготовленный по данной технологии препарат представлял собой аморфную массу оранжевого цвета, характеризовался хорошей растворимостью - в течении 1 мин. После растворения - опалесцирую-щая жидкость желто-зеленого цвета. Потеря в массе при высушивании не превышала 2,5 %, рН 8,0-9,5, содержание белка от 0,7 до 1,5 %, молярное соотношение ФИТЦ/белок от 5,0 до 14,0. Специфическая активность лиофилизированных иммуноглобулинов составляла 1:64-1:128.
Экспериментальные серии иммуноглобулинов изучали в лабораторных испытаниях с 22 штаммами V. cholerae O139, выделенными от больных и вибрио-ноносителей и 20 авирулентными штаммами V. cholerae O139, выделенными из объектов внешней среды (вода), специфичность - с холерными вибрионами серогрупп: О2-О83, О1 классического и эльтор биова-ров сероваров Инаба и Огава, холерными вибрионами в R-форме, а также с микроорганизмами семейств Vibrionaceae, Pseudomonaceae и Enterobacteriacae.
Показатели стабильности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих холерных О139
№ серии Контроль при выпуске, через Растворимость, с (норма* -в течение 3 мин) рн (норма - от 8,0 до 9,5) Белок, % (норма - от 0,7 до 1,5 %) Молярное соотношение ФИТЦ/белок (норма - от 5,0 до 14,0) Специфическая активность препарата в рабочем разведении (норма - не менее 3+) Потеря в массе при высушивании (норма -не более 2,5 %)
01 При выпуске 30 8,0 1,3 7,5 4+ 0,25
2 года 30 8,1 1,3 7,5 4+ 0,25
2 года 6 мес. 30 8,0 1,3 7,5 4+ 0,25
02 При выпуске 30 8,0 1,3 6,96 4+ 0,85
2 года 30 8,0 1,3 7,0 4+ 0,85
2 года 6 мес. 30 8,1 1,3 7,0 4+ 0,85
03 При выпуске 10 9,1 0,7 8,0 4+ 1,26
2 года 10 9,1 0,7 8,0 4+ 1,26
2 года 6 мес. 10 9,1 0,7 8,0 4+ 1,26
04 При выпуске 20 9,1 0,7 8,0 4+ 2,13
2 года 20 9,1 0,7 8,0 4+ 2,13
2 года 3 мес. 20 9,1 0,7 8,0 4+ 2,13
05 При выпуске 20 9,1 1,1 11,8 4+ 1,4
2 года 20 9,1 1,1 11,8 4+ 1,4
*Норма указана в соответствии с требованиями технических условий.
Результаты испытаний показали, что эффективность выявления холерных вибрионов 0139 серо-группы составила 100 % независимо от источника выделения штаммов, а также подтвердили высокую специфичность нового препарата, поскольку отсутствовали перекрестные реакции с другими микроорганизмами.
Для установления срока годности изучали стабильность физико-химических (растворимость, рН, содержание белка, молярное соотношение ФИТЦ/ белок, потеря в массе при высушивании) и биологических свойств (специфическая активность и специфичность) экспериментальных серий препарата, хранившихся при температуре от 0 до 8 °С. Иммуноглобулины сохраняли все физико-химические и биологические характеристики в течение 2,5 лет (таблица). На основании этого был установлен срок годности - 2 года.
Три экспериментальные серии иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих холерных О139 были представлены на Государственные испытания. Первый этап (приемочные испытания) включал экспертизу проектов НД и лабораторную оценку качества экспериментальных серий препарата с использованием коллекционных штаммов. В ходе испытаний препарат показал высокую специфичность, так как не выявлял штаммы, не относящиеся к V ско!ете О139 серогруппы, в концентрации бактерий 108 м.к./мл. Чувствительность с чистыми культурами холерных вибрионов О139 серогруппы составила 5-105-5-106 м.к./мл. В рабочем разведении препарат давал свечение на 4-3 креста.
Второй этап (испытания по медицинскому применению - полевые испытания) проходил на двух клинических базах и заключался в исследовании клинического материала от людей (испражнения, рвотные массы) и проб из объектов окружающей среды (вода и смывы). По результатам полевых ис-
пытаний препарат признан высокоспецифичным, так как не выявлял в клиническом материале и пробах из объектов окружающей среды холерные вибрионы О1 и не О1/О139 серогрупп в концентрации 108 м.к./ мл. Чувствительность составляла 106-107 м.к./мл при исследовании испражнений и рвотных масс, 5-1055-106 м.к./мл - в пробах воды и смывах.
Заключительным этапом испытаний была экспертиза качества, эффективности и безопасности. По результатам Государственных испытаний препарат «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные О139 адсорбированные кроличьи, лиофилизат для диагностических целей» был признан перспективным и зарегистрирован в качестве изделия медицинского назначения в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (РУ № ФСР 2010/09364).
Таким образом, в результате проведенных исследований разработан новый препарат, предназначенный для выявления и идентификации возбудителя холеры О139 серогруппы в мазках из различных материалов и чистых культур прямым МФА. Внедрение в практику иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих холерных О139 позволит повысить эффективность лабораторной диагностики холеры.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Алексеева Л.П., Мазрухо Б.Л., Маркина О.В. и др. Получение диагностических флюоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов к Vibrio cholerae O139 серовара. Клин лаб. диагн. 2002; 12:50-1.
2. Алексеева Л.П., Сальникова О.И., Мазрухо Б.Л., Маркина О.В., Чемисова О.С.. Лобанов В.В. Моноклональные антитела к липополисахариду Vibrio cholerae O139. Биотехнология. 2002; 2:79-84.
3. Гольдин Р.Б., Белецкая Л.В., Крюкова И.Н. и др. Иммунолюминесценция в медицине. М., 1977. 240 с.
4. Громова О.В., Джапаридзе М.Н., Дятлов И.А., Елисеев Ю.Ю., Киреев М.Н., Космоенко О.Л. Способ получения О-антигена холерного очищенного. Патент РФ 2143280, опубл. 27.12.1999. Бюл. № 56.
5. Ломов Ю.М. Эволюция возбудителя холеры и прогноз по этой инфекции на ближайшее будущее. Эпидемиол. и инф. бол.
2004; 1:7-12.
6. Онищенко Г.Г., Ганин В. С., Голубинский Е.П. Вибрионы не О1 серологической группы и их значение в патологии человека. М.; 2001. 384 с.
7. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. М.: Медицина; 2009. 472 с.
8. Смирнов В.В., Чаплинский В.Я., Андреева ЗМ. и др. Научные основы производства диагностических препаратов. Киев, 1980. 195 с.
9. Смирнова Н.И. Возбудитель холеры новой О139-серогруппы: молекулярно-генетические особенности и происхождение. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2002; 3:23-33.
10. Федорова В.А., Громова О.В., Девдариани З.Л. Иммуноферментная тест-система для детекции Vibrio cholerae О139. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобил. 1998; 5:7780.
11. Яровая Л.М., Алешкин В.А. Новые данные о химической структуре липополисахаридов и практические перспективы. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобил. 1991; 3:73-8.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Alekseeva L.P., Mazrukho B.L., Markina O.V. et al. [Obtaining of monoclonal fluorescent diagnostic immunoglobulins for Vibrio cholerae 0139]. Clin. Lab. Diagn. 2002; 12:50-1.
2.Alekseeva L.P., Sal'nikova O.I., Mazrukho B.L., Markina O.V, Chemisova O.S., Lobanov V.V. [Monoclonal antibodies for Vibrio cholerae 0139 lipopolisaccharide]. Biotekhnologya. 2002; 2:79-84.
3. Goldin R.B., Beletskaya L.V, Kryukova I.N. et al. [Immunoluminescence in Medicine]. M.; 1977. 240 p.
4. Gromova O.V., Dzhaparidze M.N., Dyatlov IA., Eliseev Yu.Yu., Kireev M.N., Kosmoenko O.L. [Method of obtaining of cholera purified O-antigen]. RF Patent 2143280.
5. Lomov Yu.M. [Cholera agent evolution and prognosis on this infection for the nearest future]. Epidemiol. Infek. Bol. 2004; 1:7-12.
6. Onishchenko G.G., Ganin VS., Golubinsky E.P. [Non-01 Vibrios and Their Impact in Human Pathology]. M.; 2001. 384 p.
7. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Dangerous Infectious Diseases]. M.; 2009. 472 p.
8. Smirnov V.V, Chaplinsky VYa., Andreeva Z.M. et al. [Scientific Bases of Diagnostic Preparations Production]. Kiev; 1980. 195 p.
9. Smirnova N.I. [Cholera agent of the new 0139 serogroup: molecular genetic peculiarities and origin]. Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 2002; 3:2333.
10. Fedorova VA., Gromova O.V, Devdariani Z.L. [Immuno-enzyme test-system for Vibrio cholerae 0139 detection]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1998; 5:77-80.
11. Yarovaya LM., Aleshkin VA. [New data on chemical structure of lipopolysaccharides and practical prospects]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 1991; 3:73-8.
Authors:
Alenkina T.V., Bochkareva G.V., Shul'gina I.V., Lobovikova O.A., Abramova E.G., Gromova O.V., Nikiforov A.K. Russian Research AntiPlague Institute “Microbe”. 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russia. E-mail: [email protected]
Sayapina L.V., Kasina I.V. Research Center for Evaluation of Products for Medical Application. Moscow.
Об авторах:
Аленкина Т.В., Бочкарева Г.В., Шульгина И.В., Лобовикова ОА., Абрамова Е.Г., Громова О.В., Никифоров А.К. Российский научноисследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: [email protected]
Саяпина Л.В., КасинаИ.В. Научный центр экспертизы средств медицинского применения. Москва.
Поступила 15.12.11.
