Оценка значимости рекомбинантного белка DbpB спирохет Borrelia garinii для серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 В.С.Караваев, А.В.Рябченко, А.Б.Беклемишев

ОЦЕНКА ЗНАЧИМОСТИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА DbpB СПИРОХЕТ BORRELIA GARINII ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОРРЕ-ЛИОЗА

НИИ биохимии, Новосибирск

Цель. Получение рекомбинантного белка DbpB западносибирского изолята Borrelia garinii 20047 и оценка его антигенной активности для возможного использования в серодиагностике иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ). Материалы и методы. Кодирующая область гена dbpB новосибирского изолята B. garinii 20047 была амплифицирована методом ПЦР и клонирована в составе экспрессирующего вектора pETm в клетках штамма Escherichia coli BL21(DE3). Рекомбинантный белок DbpB, продуцируемый отобранным клоном, исследовали методом ИФА на его способность реагировать с антителами сывороток больных ИКБ. Результаты. Был получен клон E.coli BL21(DE3), продуцирующий рекомбинантный белок DbpB в количестве 30% от суммарного клеточного белка E.coli. Гомология аминокислотной последовательности рекомбинантного белка DbpB новосибирского изолята B.garinii 20047 с первичными структурами белков DbpB спирохет гено-видов B.garinii, B. afzelii и B.burgdorferi sensu stricto, представленных в базе данных GenBank, составила 98,4, 77 и 73%, соответственно. Чувствительность иммуноферментного выявления в сыворотках больных ИКБ с мигрирующей эритемой IgM и IgG, реагирующих с антигеном DbpB, составила 13,9% и 20,0%, соответственно. Частота обнаружения IgM и IgG к DbpB в сыворотках больных с диссеменированной формой ИКБ составила 15,7 и 43,8%, соответственно. Специфичность иммуноферментного выявления антител к реком-бинантному антигену DbpB, в котором в качестве контрольных сывороток использовали сыворотки больных сифилисом, ревматоидным артритом и здоровых доноров, составила 100%. Заключение. Рекомбинантный белок DbpB новосибирского изолята B.garinii 20047 может быть использован в качестве одного из антигенов для высокоспецифичной серодиагностики диссеминированной стадии ИКБ.

Журн. микробиол., 2013, № 3, С. 73—79

Ключевые слова: Borrelia garinii, ген, ПЦР, клонирование, рекомбинантный белок DbpB; гомология, иксодовый клещевой боррелиоз, иммуноферментный анализ

V.S.Karavaev, A.V.Ryabchenko, A.B.Beklemishev

EVALUATION OF SIGNIFICANCE OF BORRELIA GARINII SPIROCHETE RECOMBINANT PROTEIN DbpB FOR SERODIAGNOSTICS OF IXODES TICK-BORNE BORRELIOSIS

Research Institute of Biochemistry, Novosibirsk, Russia

Aim. Obtaining recombinant protein DbpB of West Siberia Borrelia garinii 20047 isolate and evaluation of its antigen activity for the possible use in serodiagnostics of ixodes tick-borne bor-reliosis (ITB). Materials and methods. Coding region of dbpB gene of novosibirsk B. garinii 20047 isolate was amplified by PCR and cloned as part of expressing pETm vector in Escherichia coli BL21(DE3) strain cells. Recombinant protein DbpB produced by the selected clone was studied by EIA method for its ability to react with sera antibodies ofITB patients. Results. E. coli BL21(DE3) clone producing recombinant protein DbpB in quantity of 30% of total E. coli cell protein was

obtained. Homology of amino acid sequence of recombinant protein DbpB of novosibirsk B.garinii 20047 isolate with primary structures of B. garinii, B. afzelii and B. burgdorferi sensu stricto spirochete genospieces DbpB proteins presented in GenBank database was 98.4, 77 and 73%, respectively. Sensitivity of immune enzyme detection in sera of ITB patients with migrating erythema of IgM and IgG reacting with DbpB antigen was 13.9 and 20.0%, respectively. Frequency of detection of IgM and IgG against DbpB in patient sera with disseminated ITB form was 15.7 and 43.8%, respectively. Specificity ofimmune enzyme detection ofantibodies against recombinant antigen DbpB in which sera of syphilis, rheumatoid arthritis patients and healthy donors used as control sera was 100%. Conclusion. DbpB recombinant protein of novosibirsk B. garinii 20047 isolate may be used as one of antigens for highly specific serodiagnostics of ITB disseminated stage.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 3, P. 73-79

Key words: Borrelia garinii, gene, PCR, cloning, recombinant protein DbpB; homology, ixodes tick-borne borreliosis, immune enzyme assay

ВВЕДЕНИЕ

Иксодовый клещевой боррелиоз, ИКБ (синонимы: Лайм-боррелиоз, болезнь Лайма) — одно из самых распространенных природно-очаговых заболеваний в России, возбудителем которого являются спирохеты комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.), переносимые иксодовыми клещами. В состав комплекса B.burgdorferi s.l. входит 18 геновидов, из которых только три (B.burgdorferi s.s, B.garinii и B.afzelii) являются патогенными для человека [5, 15]. Все эти три геновида обнаружены в Европе и Азии [8], причем на территории Западной Сибири распространены, преимущественно, боррелии геновида B.garinii субгрупп 20047 и NT29 [1, 6]. По уровню заболеваемости и тяжести клинического течения ИКБ представляет собой одну из актуальных проблем современной инфекционной патологии. Диагностика этой инфекции представляет определенные трудности и основывается на совокупности эпидемиологических, клинических и лабораторных данных. Ввиду разнообразия клинических проявлений и органных поражений, вызываемых ИКБ, для подтверждения диагноза используют дополнительные лабораторные методы, среди которых широкое распространение получили методы, основанные на выявлении антител к возбудителю. В современных диагностических наборах в качестве антигенов используют преимущественно рекомбинантные белки, свойственные патогенным геновидам боррелий. Серодиагностика ИКБ существенно осложняется межвидовой и внутривидовой вариабельностью антигенов у спирохет Borrelia burgdorferi s.l., оказывающей негативное влияние на показатели чувствительности и специфичности используемых диагностических тест-систем. В этой связи, многие исследователи считают, что для повышения эффективности серодиагностики ИКБ в тест-системах целесообразно использовать антигены изолятов боррелий, эпидемически значимых для конкретной территории [4, 11].

Декорин-связывающий белок В (DbpB) — иммунодоминантный белок спирохет B.burgdorferi s.l., вызывающий иммунный ответ у больных ИКБ. Белкам DbpB боррелий свойственна значительная межгеновидовая гетерогенность первичных структур, достигающая 33 — 38% [9]. C вариабельностью аминокислотных последовательностей коррелирует и изменчивость антигенных свойств. В частности, сыворотки больных ИКБ, инфицированных спирохетами одного генови-да, как правило, слабее реагируют с DbpB других патогенных геновидов B. burgdorferi s.l. [12]. В настоящее время отсутствует информация об иммунохими-ческих свойствах этого белка у боррелий, циркулирующих на территории азиат-

ской части России. Исследование этого вопроса представляет интерес с точки зрения использования белка DbpB в диагностических целях.

Целью настоящего исследования явилось получение и оценка антигенной активности рекомбинантного белка DbpB западносибирского изолята B.garinii методом ИФА в экспериментах с сыворотками больных ИКБ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служил рекомбинантный белок DbpB, полученный экспрессией в клетках E.coli гена dbpB новосибирского изолята Nsk-10-06 B.garinii 20047 [3]. Выделение ДНК из клещей, идентификацию и типирование ДНК спирохет B. burgdorferi s.l. проводили по [13] в модификации [6]. Амплификацию кодирующей области гена dbpB проводили методом ПЦР, используя пару прайме-ров: PR162 (5'-CTTGGTACCGGATTAACAGGAGAAGTAAAAG-3') и PR163

Гидролиз ДНК рестриктазами и сшивку фрагментов ДНК при помощи Т4 ДНК-лигазы проводили согласно прилагаемым к препаратам ферментов инструкциям фирм-производителей. Электрофорез ДНК проводили в 5% полиакрила-мидном или 0,8% агарозном гелях согласно [2]. Получение электрокомпетентных клеток Escherichia coli BL21(DE3) и их трансформацию методом электропорации плазмидными ДНК, лигированными с ампликонами гена dbpB, проводили согласно инструкции фирмы-производителя электропоратора EasyJect prima (Peqlab Biotechnology GmbH, Германия). Плазмидную ДНК из выросших рекомбинант-ных клонов E.coli выделяли методом кипячения и анализировали на наличие вставок гена dbpB методом ПЦР в присутствие праймеров PR162 и PR163. Спектр белков в лизатах и субклеточных фракциях рекомбинантных клонов, индуцированных 1мМ изопропил^^-1-тиогалактопиранозидом, определяли с помощью электрофореза в денатурирующем 12% полиакриламидном геле. Субклеточные фракции из анализируемых клонов выделяли по [14]. Один из отобранных клонов, продуцирующий рекомбинантный белок DbpB, использовали в дальнейшей работе для наработки и аффинной очистки целевого полипептида с помощью аффинной хроматографии на колонке с Ni2+-NTA-сефарозой CL-6B в нативных условиях. Количество очищенного белка определяли методом Лоури, используя для построения калибровочной кривой бычий сывороточный альбумин и IgG собаки.

Для изучения антигенных свойств рекомбинантного белка DbpB методом твердофазного иммуноферментного анализа использовали образцы сывороток крови больных ИКБ с мигрирующей эритемой (стадия локализованной инфекции) и без мигрирующей эритемы (стадия диссеминированной инфекции). Сыворотки больных были получены из муниципальной инфекционной клинической больницы № 1 и областного диагностического центра Новосибирска. Диагноз ИКБ у больных с мигрирующей эритемой установлен на основе эпидемического анамнеза (присасывание клеща), наличия мигрирующей эритемы и данных клинического обследования. У больных ИКБ без мигрирующей эритемы в анамнезе был отмечен укус клеща и наблюдалась моно- или полиорганная симптоматика, характерная для диссеминированной стадии инфекции. У обеих групп больных диагноз ИКБ лабораторно подтвержден с использованием коммерческих иммуноферментных тест-систем «ЛаймБест-IgM» и «ЛаймБест-IgG» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск), предназначенных для определения IgM и IgG к спирохетам B.burgdorferi s.l., соответственно. При комплексном исследовании сывороток больных ИКБ методом ИФА не было обнаружено специфических IgM или IgG к спирохетам Treponema pallidum. Забор сывороток проводили в период со 2 по 8 неделю после начала заболевания. В качестве контроля использовали образцы сывороток больных сифилисом, больных ревматоидным артритом и

здоровых доноров. Образцы сывороток крови хранили при —70°С. В работе использовали пероксидазные конъюгаты на основе мышиных моноклональных антител к IgM или IgG человека.

Пороговое значение критической оптической плотности (ОПкрит) устанавливали статистически как среднее значение оптической плотности (ОП) при 450 нм отрицательных сывороток (здоровые доноры) и 2 стандартных отклонений, что соответствовало верхней границе 95% доверительного интервала для возможных значений показателя. Исходя из ОПкрит проводили анализ результатов тестирования исследуемых сывороток. Образцы признавали положительными при превышении ОПкрит и отрицательными при значении, меньшем или равном ОПкрит.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы «Excel» для Windows XP.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Одной из задач исследования было получение рекомбинантного белка DbpB новосибирского изолята B.garinii 20047. Ампликон кодирующей области гена dbpB встраивали в экспрессирующий вектор pETm (модифицированный вариант плаз-миды pET36b(+), содержащий синтетический полилинкер) по сайтам KpnI и XhoI и клонировали в клетках штамма E.coli BL21(DE3). Получение рекомбинантных клонов E.coli и анализ экспрессии в них гена dbpB проводили, как описано выше. Клон, продуцирующий рекомбинантный антиген dbpB, использовали в дальнейшей работе для определения нуклеотидной последовательности гена dbpB, количественного содержания синтезируемого белка DbpB в индуцированных клетках E.coli и выявления его локализации в клетке.

Первичная структура кодирующей области клонированного гена dbpB изолята B.garinii 20047 была определена на капиллярном секвенаторе ABI 3730XL Genetic Analyser (Applied Biosystems, США. Установленная нуклеотидная последовательность гена dbpB и выведенная из нее соответствующая аминокислотная последовательность белка были депонированы в GenBank под номером EU979628. Сравнение аминокислотной последовательности белка DbpB изолята B.garinii 20047, установленной в настоящей работе, с первичными структурами белков DbpB спирохет B. burgdorferi s.l., представленных в базе данных GeneBank, показало высокое сходство между ними у различных штаммов геновида B.garinii — гомология составила 98,4%. Гомология между белком DbpB изолята B.garinii 20047 и белками DbpB геновидов B. afzelii и B.sensu stricto составила 77 и 73%, соответственно.

Рекомбинантный белок DbpB выделяли из биомассы клеток E.coli с помощью аффинной хроматографии лизата индуцированных клеток на Ni2+-NTA сефарозе 6В. Размер рекомбинантного белка DbpB, судя по электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле, составляет около 19 кДа, что соответствует расчетному размеру полипептида, кодируемому клонированным геном dbpB. Чистота белка по данным ПААГ составляла не менее 90% (рис.). Количество синтезируемого рекомбинантного белка DbpB было оценено с использованием программы «ImageScan» и составляло около 30% от суммарного клеточного белка E.coli. Синтезированный белок DbpB накапливался в растворимой форме в цитоплазме рекомбинантных клеток E.coli, что способствовало его выделению с помощью аффинной хроматографии в неденатурирующих условиях.

При исследовании сывороток здоровых доноров на наличие IgM и IgG к ре-комбинантному белку DbpB методом твердофазного ИФА была предварительно определена ОПкрит.. Кроме того, с использованием положительных и отрицательных сывороток были определены средние значения ОП и отношение средних арифметических ОП положительных и отрицательных сывороток.

Антигенные свойства рекомбинантного белка DbpB оценивали методом ИФА

■гД*

Рекомбинантный белок DbpB новосибирского изолята B.garinii 20047 (электрофореграмма в ПААГ).

по его способности специфически взаимодействовать с антителами сывороток больных ИКБ с мигрирующей эритемой и без мигрирующей эритемы, неспецифическими заболеваниями (сифилис, ревматоидный артрит) и здоровых доноров. Результаты этих исследований показали, что ^М к DbpB обнаружены менее чем в 16 % сывороток больных ИКБ с мигрирующей эритемой и без нее. IgG, специфичные к DbpB, были выявлены в 20,0 и в 43,8% сывороток больных ИКБ с мигрирующей эритемой и без нее, соответственно. Сыворотки больных сифилисом, ревматоидным артритом и здоровых доноров не реагировали с белком DbpB.

При исследовании сывороток больных ИКБ методом ИФА на присутствие ^М и IgG к белку DbpB были определены средние значения ОП положительных сывороток (ОПср.+) и отношение средних значений ОП положительных сывороток к ОПкрит. (ОПср.+ / ОПкрит.) (табл.). Из табл. видно, что коэффициенты позитивности (Кп) сывороток больных ИКБ с мигрирующей эритемой, определенные в ИФА на наличие ^М и IgG специфичных к антигену DbpB, отличались между собой незначительно. При исследовании образцов сывороток больных ИКБ без мигрирующей эритемы на наличие ^М и IgG к антигену DbpB коэффициент позитивности сывороток был существенно выше в случае определения IgG, что свидетельствует о более высокой антигенной активности DbpB у этой группы больных.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее антигенный потенциал DbpB спирохет В^ш^огГеп 8.1. в серодиагностики ИКБ был оценен только в нескольких исследованиях. Так, в [7] приведены результаты исследований сывороток больных ИКБ из Италии с помощью вестерн-

Коэффициенты позитивности сывороток больных ИКБ

Антитела Больные ИКБ с мигрирующей эритемой Больные ИКБ без мигрирующей эритемы

ОПср.+ ОПкрит. Кп ОПср.+ ОПкрит. Кп

^М 0,58+0,03 0,34+0,04 1,71+0,02 0,52+0,04 0,34+0,04 1,53+0,04

до 0,54+0,04 0,30+0,04 1,8+0,04 0,78+0,04 0,30+0,04 2,6+0,04 77

блотт анализа. Показано, что IgG к DbpB спирохет геновида B. burgdorferi s.s. были выявлены только в 13 % сывороток больных ИКБ c мигрирующей эритемой и в 16 % сывороток больных с поздней стадией ИКБ. При исследовании методом ИФА сывороток больных Лайм-артритом из Западной и Северной Европы на наличие IgG к DbpB с параллельным использованием в качестве антигена белков DbpB спирохет трех геновидов B. afzelii, B. garinii и B. burgdorferi s.s. чувствительность теста составила 73%. При этом, максимальное число сывороток прореагировало с антигеном DbpB геновида B.garinii (60%) [9]. Именно этот геновид боррелий является самым распространенным среди спирохет B. burgdorferi s.l., вызывающих ИКБ в Европе [10]. Позднее в аналогичных исследованиях сывороток больных нейроборрелиозом из Финляндии с использованием антигенов DbpB из геновидов B. burgdorferi s.s., B. afzelii и B. garinii были получены положительные результаты в 70% сывороток [12].

В настоящем исследовании приведены данные об антигенных свойствах ре-комбинантного белка DbpB спирохет геновида B.garinii, циркулирующих на территории Западной Сибири. По данным десятилетнего мониторинга зараженности клещей Ixodes persulcatus, проводимого нами на территории лесопарковой зоны Новосибирского научного центра, 70 — 75% популяции клещей инфицировано спирохетами геновида B.garinii [1, 3, 6]. Таким образом, существует наибольшая вероятность заражения людей возбудителем ИКБ данного геновида, а следовательно, представляется целесообразным использовать в диагностических тестах антигены преимущественно именно этого геновида. Результаты оценки антигенной активности белка DbpB B.garinii 20047 в IgM ИФА с сыворотками больных ИКБ с мигрирующей эритемой и без мигрирующей эритемы показали низкую вы-являемость IgM к DbpB. Следует отметить, что в аналогичных исследованиях при обнаружении IgG к белку DbpB в сыворотках больных ИКБ без мигрирующей эритемы количество позитивных результатов было значительно выше и составило 43,8%. В наших исследованиях мы наблюдали высокие показатели видоспецифич-ности рекомбинантного белка DbpB. В частности, при исследовании сывороток больных сифилисом, ревматоидным артритом и здоровых доноров методом твердофазного ИФА на наличие IgM и IgG к рекомбинантному DbpB, используемому в качестве антигена, не было получено ни одного положительного результата.

Таким образом, полученные нами данные указывают на целесообразность использования рекомбинантного белка DbpB западносибирского изолята B.garinii 20047 в качестве антигена для серодиагностики диссеминированной стадии ИКБ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Мамаев А.Л., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Исследование зараженности иксодовых клещей, отловленных весной 2008 г. в рекреационной зоне г. Новосибирска, спирохетами Borrelia burgdorferi sensu lato. Бюлл. СО РАМН. 2010, 30 (2): 13-16.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. М., 1984.

3. Рябченко А.В., Ивлева И.В., Беклемишев А.Б. Комплексная оценка зараженности клещей Ixodes persulcatus, распространенных в рекреационной зоне Новосибирского Научного центра, спирохетами B.burgdorferi s.l. Журн. инфекц. патологии. 2004, 11 (3 — 4): 107-110.

4. Фоменко Н.В., Мельникова О.В., Черноусова Н.Я. и др. Выявление антител к борре-лиям комплекса Borrelia burgdorferi sensu.lato. Бюлл. сибирской медицины. 2008, Прил. 1: 78-84.

5. Baranton G., De Martino S.J. Borrelia burgdorferi sensu lato diversity and its influence on pathogenicity in humans. Curr. Probl. Dermatol. 2009, 37: 1-17.

6. Beklemishev A.B., Dobrotvorsky A.K., Piterina A.V. et al. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato genospecies in Ixodes persulcatus ticks in West Siberia, Russia. FEMS Microbiol. Lett. 2003, 227 (2): 157-161.

7. Cinco M., Ruscio M., Rapagna F. Evidence of Dbps (decorin binding proteins) among European strains of Borrelia burgdorferi sensu lato and in the immune response of LB patient sera. FEMS Microbiol. Lettt. 2000, 183 (1): 111-114.

8. Crowder C.D., Matthews H.E., Schutzer S. et al. Genotypic variation and mixtures of Lyme Borrelia in Ixodes ticks from North America and Europe. PLoS One. 2010, 14; 5 (5): e 10650.

9. Heikkila T., Seppala I., Saxen H. et al. Cloning of the gene encoding the decorin-binding protein B (DbpB) in Borrelia burgdorferi sensu lato and characterisation of the antibody responses to DbpB in Lyme borreliosis. J. Med. Microbiol. 2002, 51: 641-648.

10. Junttila J., Peltomaa M., Soini H. et al. Prevalence of Borrelia burgdorferi in Ixodes ricinus ticks in urban recreational areas of Helsinki. J. Clin. Microbiol. 1999, 37 (5): 1361-1365.

11. Mavin S., Evans R., Milner R. M. et al. Local Borrelia burgdorferi sensu stricto and Borrelia afzelii strains in a single mixed antigen improves western blot sensitivity. J. Clin. Pathol. 2009, 62: 552-554.

12. Panelius J., Sillanpää H., Seppälä I. et al. Antibodies to recombinant decorin-binding proteins A and B in the cerebrospinal fluid of patients with Lyme neuroborreliosis. Scand. J. Infect. Dis. 2007, 39 (9): 775-780.

13. Postic D., Assous M.V., Grimont P.A.D. et al. Diversity of Borrelia burgdorferi sensu lato evidenced by restriction fragment length polymorphism of rrf (5S)-rrl (23s) intergenic spacer amplicons. Int. J. Syst. Bacteriol. 1994, 44 (4): 743-752.

14. Randall L.L., Hardy S.J.S. Correlation of competence for export with lack oftertiary structure of the mature species: a study in vivo of maltose-binding protein in E. coli. Cell. 1986, 46 (6): 921-928.

15. Stanek G, Reiter M. The expanding Lyme Borrelia complex—clinical significance of genomic species? Clin. Microbiol. Infect. 2011, 17(4): 487-493.

Поступила 23.10.12

Контактная информация: Караваев Виталий Семенович,

630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2, р.т. (383)306-44-71

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013

Н.Р.Телесманич, Е.А.Меньшикова, В.В.Агафонова, Ю.М.Ломов, А.Б.Мазрухо, И.В.Архангельская, В.Д.Кругликов, Л.В.Ларионова, Д.И.Симакова, Е.М.Курбатова, А.В.Миронова

СЕРОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ХОЛЕРНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ АНТИГЕННЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ

Ростовский-на-Дону противочумный институт

Цель. Оценка показателей качества сконструированных холерных антигенных полимерных диагностикумов с помощью комплекса специфичных противохолерных сывороток. Материалы и методы. Сенситином для экспериментальных препаратов являлись клеточные лизаты штаммов Vibrio cholerae cholerae 1395, V. eltor Огава 2044, V. eltor Инаба 13020, V. cholerae О139 16064. В качестве контроля использовали 3 сыворотки от больных холерой, нормальную человеческую сыворотку, холерные О1 (Огава, Инаба) коммерческие лошадиные, холерные О139 коммерческие кроличьи и гетерологичные сыворотки к ши-геллам, сальмонеллам, эшерихиям и иерсиниям, а также экспериментальные холерные кроличьи сыворотки О1 и О139. Результаты. В ходе исследования установили, что по