CC BY
94
19. Johnson J.A., Davis J.O., Baumer J.S., Schneider E.G. Effect of hemorrhage and chronic sodium depletion on hepatic clearance of rennin //Amer. J. Physiol. — 1971. — Vol. 220, N6. — P. 16771682.
20. Kohler H., Nesse R.H., Pechet M.M. The metadolism of aldoste-rone Metadolic pathway, isolation, characterization and synthesis of metadolites // J. Biol. Crem. — 1964. — Vol. 239, N
12. — P. 4117-4123.
Информация об авторах: г. Кемерово, пр.Октябрьский, 22; тел. 8 905 900 57 63, рабочий телефон: 39-65-68; e-mail: [email protected]
Путинцев Александр Михайлович - заслуженный врач РФ, к.м.н., доцент, Шраер Теодор Израилевич - заслуженный деятель науки РФ, д.м.н. профессор, Сальмайер Александр Александрович - к.м.н., врач хирург, заведующий отделением, Струкова Оксана Анатольевна - врач сердечно-сосудистый хирург.
© КОНЬКОВА-РЕЙДМАН А.Б., ЗЛОБИН В.И. — 2011
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОВИДОВ БОРРЕЛИЙ В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ И БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМИ КЛЕЩЕВЫМИ БОРРЕЛИОЗАМИ В ЮЖНО-УРАЛЬСКОМ РЕГИОНЕ РОССИИ
Алёна Борисовна Конькова-Рейдман1, Владимир Игоревич Злобин2'3 ('Челябинская государственная медицинская академия, ректор — д.м.н., проф., чл.-корр. РАМН Н.И. Долгушин, кафедра инфекционных болезней, зав. — д.м.н., проф. Л.И. Ратникова;
2Иркутский государственный медицинский университет, ректор — д.м.н., проф. И.В. Малов, кафедра микробиологии, зав. — д.м.н., проф., акад. РАМН В.И. Злобин; 3ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, Москва, директор — д.м.н., проф., акад. РАМН Д.К. Львов)
Резюме. Изучен генетический спектр боррелий, циркулирующих в природных очагах Южно-Уральского региона России. Установлена спонтанная инфицированность клещей Ixodes persulcatus геновидами боррелий B. garinii и B. afzelii. Геновид B. garinii у основных переносчиков представлен двумя типами: 20047т и NT29. Бактериальная нагрузка составила 101-106 копий ДНК боррелий в клеще. Проведена диагностика иксодовых клещевых боррелио-зов (ИКБ) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) у 100 пациентов, находившихся на лечении ГКБ №8 г.Челябинска. На основании результатов исследований парных сывороток крови (обнаружение сероконверсии и выявление ДНК боррелий методом ПЦР с последующим генотипированием) в 40,9% случаев боррелиозная моноинфекция была этиологически связана с геновидом B. garinii, в 16,4% случаев — с геновидом B. afzelii и в 16,4 % случаев — с геновидом B. burgdorferi s.s. Обнаружение последнего у пациентов свидетельствует о необходимости дальнейшего поиска этого геновида в природных очагах инфекции.
Ключевые слова: иксодовые клещевые боррелизы, геновиды боррелий, полимеразная цепная реакция, диагностика.
THE STUDY OF GENOSPECIES OF BORRELIA IN NATURAL FOCI AND BIOLOGICAL MATERIAL OF PATIENTS SUFFERING
FROM IXODID BORRELIOSIS IN SOUTH URAL REGION. RUSSIA
A. B. Konjkova-Reidman1, V.I. Zlobin2-3 ('Chelyabinsk State Medical Academy, Chelyabinsk; 2Irkutsk State Medical University, Irkutsk;
3 D.I. Ivanovsky Institute of Virology, Moscow)
Summary. There has been studied the genetic spectrum of borrelia circulating in natural foci of the South-Ural region of Russia. There has been established the spontaneous infection of ticks Ixodes persulcatus genospecies Borrelia B. garinii and B. afzelii. Genospecies B. garinii from the major carriers is presented in two types: 20047t and NT29. Bacterial load was 101-106 copies of DNA of Borrelia in ticks. The diagnosis of ixodid tick borreliosis was put by polymerase chain reaction (PCR) in 100 patients treated at Clinical Hospital №8 Chelyabinsk. Based on the results of studies of paired sera (detection of seroconversion and detection of Borrelia DNA by PCR followed by genotyping) in 40.9% cases mono-infection has been etiologically associated with the genospecies B. garinii, in 16.4% cases — with the genospecies B. afzelii, and 16.4% of cases — with the genospecies B. burgdorferi s.s. The detection of the last one in a patient indicates the need for further search of this genospecies in natural foci of infection.
Key words: Ixodes tick borreliosis, genospecies of Borrelia, polymerase chain reaction diagnosis.
На территории лесостепной и горно-лесной зоны Челябинской области широко распространены природные и антропоургические очаги иксодовых клещевых боррелиозов (ИКБ). Заболеваемость ИКБ в ЮжноУральском регионе России ежегодно в несколько раз превышает среднероссийский уровень. Несоответствие между частотой изоляции различных геновидов борре-лий в природных очагах и в биологическом материале от больных отмечается в Словении, Пермском крае, Новосибирской области [2,4,6,11]. Значимыми преимуществами диагностики для подтверждения диагноза ИКБ обладает один из наиболее широко используемых тестов молекулярной диагностики — полимеразная цепная реакция. Она позволяет не только осуществлять детекцию ДНК боррелий в острый период заболевания, но и идентифицировать возбудителей до геновидов [6],
а также осуществлять диагностику микст-инфекций [12]. Большой интерес в качестве биоматериала для ПЦР представляет кровь — она обеспечивает возможность быстрой диагностики, что особенно важно при безэри-темной форме ИКБ, с выявлением диссеминации возбудителя и случаев повторных заражений. К региональным особенностям клинического течения ИКБ относится высокий процент безэритемных форм заболевания (25%) [1]. По данным ряда авторов, особенности клинического течения ИКБ зависят от генетической структуры возбудителей [3,7,8,10]. Поэтому очевидно, что для своевременной диагностики и терапии ИКБ необходима достоверная информация о геновидовом разнообразии боррелий, циркулирующих на данной территории и установление вклада боррелий различных геновидов в развитие региональной инфекционной патологии.
Цель работы: определить генетический спектр бор-релий, циркулирующих в природных очагах ЮжноУральского региона России, и их соответствие этиологическому агенту в крови больных эритемными и безэри-темными формами ИКБ методом ПЦР при лабораторной диагностике данного заболевания.
Материалы и методы
Для детекции специфического фрагмента ДНК боррелий в клещах использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с набором реагентов для амплификации фрагмента 16SpРНК Borrelia burgdorferi sensu lato (Borrelia burgdorferi sensu stricto B. garinii, B.afzelii) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации с тест-системой «Amplisens Borrelia burgdorferi sensu lato-Eph» согласно инструкции производителя.
Для количественной оценки заражённости таёжных клещей боррелиями и количеств геном-эквивалентов в таёжных клещах при индивидуальных инфекциях исследовали 169 особей Ixodes persulcatus Schulze. Голодных имаго таёжного клеща собирали в мае 2009 г. с растительности в Каштакском бору вблизи поселка Каштак Челябинской области и в Еткульском районе Челябинской области (5509’ с.ш.,
61026’ в.д.). Нуклеиновые кислоты из индивидуальных клещевых суспензий выделяли с использованием набора РИБО-сорб производства «ИнтерЛабСервис» (г. Москва) в соответствии с инструкцией производителя. Детекцию ДНК боррелий проводили посредством ПЦР с тест-системой «Ампли-Лайм» (# КА-002-2) производства ООО «Омникс» (г. Санкт-Петербург) на амплификаторе «Терцик» производства «ДНК-технология» (г. Москва). Электрофорез продуктов ПЦР проводили в 2% агарозном геле в ТБЕ. ПЦР в реальном времени проводили с использованием RotorGene 6000 (Corbett Research, Австралия) в следующем режиме 940С 10 сек., 600С 60 сек. 50 циклов. Для количественных оценок ДНК борре-лий использовали праймеры и зонд, соответствующие гену основного белка жгутика flaB боррелий комплекса B.burgdorferi s.l. [9].
На клинической базе кафедры инфекционных болезней ГКБ №8 г. Челябинска под нашим наблюдением находилось 267 больных ИКБ. Острое течение инфекционного процесса (1-я стадия заболевания) наблюдалась у 220 (82,4%) больных. Подострое течение инфекционного процесса с ранними органными поражениями (2-я стадия) наблюдалось у 34 больных (12,7%), хроническое течение (3-я стадия заболевания) в процессе динамического наблюдения была зарегистрирована у 16 (5,9%) больных. Манифестные эритемные формы наблюдались у 200 больных. Среди обследованных мужчин было — 113 (42,3%), женщин — 87 (32,5%). Средний возраст среди мужчин и женщин был сопоставим и составил 44,8±1,8 и 44,4±2,5 соответственно. Для ИФА использовали тест-системы «Боррелиоз-ИФА-IgM» и «Боррелиоз-ИФА-IgG» производства НПФ «Хеликс» (г. Санкт-Петербург) с композицией рекомбинантных белков разных геновидов боррелий, сорбированных на внутренней поверхности лунок полистироловых стрипов. Для изучения генетической вариабельности боррелий в биологическом материале от больных нами использовалась тест-система «Векто-Лам-ДНК-ампли-100», производства «Вектор-Бест», Новосибирск.с системой праймеров к fla-гену Borrelia burgdorferi sensu lato. Материал для исследования: сыворотка крови.
Результаты и обсуждение
В 2005-2006 гг. с целью обнаружения ДНК боррелий в клещах нами была применена ПЦР. ДНК боррелий
обнаружена в 20-31,5% клещей I. persulcatus. Из 353 исследованных методом ПЦР в 2007 г. клещей в 35,4% (абс. 125) случаев обнаружена ДНК B. burgdorferi sensu lato. Соотношение разных геновидов боррелий, выделенных от переносчиков, представлено в таблице 1.
Как следует из данных таблицы, наиболее часто выделяли геновид В. даппп (30,98% — В. даппп ЫТ 29; 30,98%- В. даппп 20047), реже В. аfzelii — в 27,02%. Микст-зараженность различными геновидами наблюдалась в 9,8% случаев. Таким образом, в природных очагах Южного Урала практически повсеместно распространены и совместно циркулируют спирохеты В. даппп и В. afzelii. Геновид В. даппп представлен двумя типами: 20047т и ЫТ29.
В 2009 г. нами был проведен количественный анализа содержания ДНК боррелий в клещах. ДНК борре-лий детектировали в 36,6% анализируемых образцов от клещей. Определены нуклеотидные последовательности продуктов ПЦР для межгенного спейсера генов 58-238 рРНК, на основании гомологии которых с известными нуклеотидными последовательностями из базы данных GenBank и филогенетического анализа образцы ДНК отнесены к двум видам ВоггеНа afzelii и ВоггеНа даппп. При детекции в ПЦР в реальном времени с праймерами и зондом, соответствующими гену АаВ белка жгутика (часть результатов представлена на рис. 1, пороговые циклы в диапазоне 23,4-46,3 соответствовали приблизительно 1-105 геном-эквивалентам в реакционных смесях, что с учётом аликвоты суммарной ДНК из каждого клеща в реакционной смеси позволило оценить количества 101106 копий ДНК боррелий в клеще. При этом среди 76,5% клещей наблюдали низкие бактериальные нагрузки с пороговыми циклами более 35.
Norm Ruoro
"'О *5 l10 'iS 120 125 15 *35 *40 ^5 Сёт
Рис.1 Результаты ПЦР в реальном времени с праймерами и TaqMan зондом, соответствующими гену flaB боррелий, и ДНК, выделенными из клещей Ixodes persulcatus
Таблица 1
Геновиды боррелий, выделенные от переносчиков
Количество исследованных клещей Количество клещей, содержащих боррелии комплекса B. burgdorferi sensu lato % (M±m) клещей, зараженных боррелиями Геновиды боррелий Абс. %
B.afzelii 20 28,1±0,2
B garinii NT 29 22 30,98±0,1
B garinii 20047 22 30,98±0.1
353 125 35,4± 1,5 B.afzelii+ B garinii 20047 5 6,75±2,6
B garinii NT 29+ B garinii 20047 1 1,35±3.2
B.afzelii+ B garinii NT 29+ B garinii 20047 1 1,35±3.2
Всего: 71 100
Для ИКБ характерна, как известно, гематогенная дис-семинация возбудителя с непродолжительной и неинтенсивной спирохетонемией. При развитии локализованной стадии первоначальное накопление возбудителя происходит в месте его первичного проникновения, чему способствуют многочисленные факторы специфической и неспецифической резистентности макроорганизма. По всей видимости, в этом кроется вероятная причина редкости детекции ДНК B. burgdorferi s.l. в крови в первую неделю от начала заболевания. Ее наиболее часто удается обнаружить в крови больных на 8-14 день заболевания, что совпадает с оптимальными сроками изоляции бор-релий из крови пациентов культуральным методом [5]. Нами изучен генетический спектр боррелий, обнаруженных в крови 61 больного ИКБ на 8-14 день заболевания.
Как следует из данных таблицы 2, боррелиозная моноинфекция зарегистрирована в 45 (73,7%) случа-
Таблищ 1
Геновиды боррелий, выделенные от переносчиков
Количество исследованных сывоpоток %(±m)
сеpопозитивныx сывоpоток, DNA(-) Геновиды боppелий Абс. %
B.afzelii 10 16,4±2,6
B garinii 25 40,9±1,9
B.b.s.s. 10 16,4±2,6
100 39 ± 2,7 B.afzelii+ B garinii 7 11,4±4,1
B garinii + B.b.s.s 6 9,8±3,4
B.afzel i i + B,b.s.s 3 4,9± 3,9
Bсего: 61 100
ях, в т.ч. вызванная B. afzelii у 10 (16,4%), B. garinii — у 25 (40,9%) и B. burgdorferi s.s. — у 10 (16,4%) пациентов. Одновременное инфицирование несколькими разными геновидами боррелий было выявлено у 16 (26,3% от всех больных с боррелиозной инфекцией). У 39 (39,0%) больных методом ПЦР не удалось обнаружить генетический материал боррелий, несмотря на положительные результаты серодиагностики (ИФА).
1. Конькова-Рейдман А.Б., Злобин В.И., Тарасов В.Н. и др. Этиопатогенетические и клинические особенности иксодовых клещевых боррелиозов в природных очагах Южного Урала // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. — 2010. — №5. — С. 24-34
2. Коренберг Э.И., Воробьева Н.Н., Сумливая ОН. и др. Инфекции, передающиеся клещами в Пермском крае (этиология, эпидемиология, патогенез, клиника, диагностика, лечение, профилактика): Метод. рек. — Пермь: Урал-Пресс, 2007. — 136 с.
3. Миноранская Н.С., Андронова Н.В., Миноранская Е.И.Особенности клинического течения иксодовых клещевых боррелиозов в Красноярском крае. // Сибирский медицинский журнал. — 2008. — №7. — С. 123-124.
4. Нефедова В.В., Коренбкрг Э.И., Горелова Н.Б. Генетическая гетерогенность В. дагіпіі в природном очаге Среднего Урала // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. — 2007. — №3. — С.139-142.
5. ТетеринВ.Ю., Коренбнрг Э.И., Воробьева Н.Н. Результаты применения метода полимеразной цепной реакции для лабораторного иксодовых клещевых боррелиозов // Эпидемиология и вацинопрофилактика.- 2010. — №5. — С. 35-40.
6. Фоменко Н.В., Ливанова Н.Н., Романова Е.В. Выявление ДНК боррелий, циркулирующих в Новосибирской области // Журн. микробиологии. — 2006. — №7. — С. 22-28.
Инфекционный процесс с иммунологическтим ответом, характеризующимся образованием специфических антител к боррелиям, наблюдался у 255 больных. Особенностью ИКБ являлся относительно медленный и слабый антителогенез. В подавляющем большинстве случае (80% наблюдений) специфические IgM обнаруживались у больных с манифестными эритемными формами не ранее 2-3 недели от начала заболевания. Коэффициент серопозиттивности составлял (Ме 2,6) с квартильными размахами от 1,1 до 4,04. Переключение синтеза ранних антител на IgG у больных с легкими доброкачественными формами заболевания наблюдалось через 1-1,5 месяца. Поздние антитела обнаруживались в более высоких титрах — коэффициент серопозитив-ности (Me 4,6) с квартильными размахами от 4,1 до 8,1. У 40% больных с ранними органными поражениями не наблюдалось адекватного гуморального иммунного ответа — не было переключения синтеза специфических ранних антител на поздние. В процессе динамического наблюдения у таких больных в течение 3-6 месяцев обнаруживались ранние антитела. Общий процент подтверждения диагноза методом ИФА составил 95%. Длительное выявление специфических антител (как IgM, так и IgG) часто не позволяет на основании результатов серологических методов судить об элиминации боррелий после проведенного лечения, что становится причиной гипердиагностики хронических форм ИКБ.
Таким образом, в природных и антропургических очагах на территории Челябинской области установлена спонтанная инфицированность клещей Ixodes persulcatus геновидами боррелий B. garinii и B. afzelii. Геновид B. garinii у основных переносчиков представлен двумя типами: 20047т и NT29. Бактериальная нагрузка составила 101-106 копий ДНК боррелий в клеще. На основании результатов исследований парных сывороток крови (обнаружение сероконверсии и выявление ДНК боррелий методом ПЦР с последующим генотипированием) в 40,9% случаев боррелиозная моноинфекция была этиологически связана с геновидом B. garinii, в 16,4% случаев — с геновидом B. afzelii и в 16,4% случаев — с геновидом
B. burgdorferi s.s. Обнаружение последнего у пациентов свидетельствует о необходимости дальнейшего поиска этого геновида в природных очагах инфекции. ПЦР позволяет диагностировать иксодовый клещевой боррели-оз в остром периоде, до формирования специфического гуморального ответа, или диагностировать его серонегативные формы.
7. Aguero-Rosenfeld M.E., Wang G., Schwartz I., et al. Diagnosis of Lyme borreliosis // Clin. Microbiol. Rev. — 2005. — V. 18. — P. 484-509.
8. Grab D.J. Borrelia burgdorferi, Host-Derived Proteases, and the Blood- Brain Barrier // Infection and Immunity. — 2005. — Vol. 73, № 2. — Р. 1014-1022.
9. Haass A. Неврологические симптомы, вызванные подвидом Borrelia burgdorferi // Неврологич. вестн. — 2001. — Т.33, №1-2. — C. 53- 55.
10. Hodzic E., Feng S., Freet K. Borrelia burgdorferi Population Dynamics and Prototype Gene Expression during Infection of Immunocompetent and Immunodeficient Mice // Infection and immunity. — 2003. — Vol. 71. — №9. — Р 5042-5055.
11. Narasimhan, S., Melissa Camaino J. Borrelia burgdorferi transcriptome in the central nervous system of non-human primates // Proc Natl Acad Sci USA. — 2003. — Vol. 100, №26. — Р15953-15958.
12. Rufzic-Sabljc E. Characterization of B.b.s.l. strains isolated from human material in Slovenia // Wein Klin Wochenschr. — 2002. — Vol.114. — P. 544-550.
13. Swanson J., Neitzel D., ReedK.D., et al. Coinfections asquired from Ixodes ticks // Clin. Microbiol. Rev. — 2006. — V. 19. — P. 708-727.
Информация об авторах: 664003, Иркутск, ул. Красного Восстания,1, ИГМУ, кафедра микробиологии,
e-mail: [email protected],
Злобин Владимир Игоревич - заведующий кафедрой, акад. РАМН, д.м.н., проф., Конькова-Райдман Алена Борисовна - ассистент, к.м.н.
