Значимость рекомбинантных белков западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi S. L. для серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

МИКРОБИОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616.98:579.834.114]-078

В.С. Караваев1, Е.С. Генина1,2, А.В. Рябченко1, А.Б. Беклемишев1

ЗНАЧИМОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ЗАПАДНОСИБИРСКИХ ИЗОЛЯТОВ BORRELIA BURGDORFERI S.L. ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОРРЕЛИОЗА

1ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН, 630117, Новосибирск; 2ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»», 630559, Новосибирская область, пос. Кольцово

Структурные белки OspC, FlaB, FlaA и DbpB возбудителя иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ) являются одними из основных антигенов, индуцирующих гуморальный иммунитет на начальных стадиях заболевания. В связи с этим мы поставили задачу оценить антигенную активность рекомбинантных белков OspC (OspC-Bg), фрагмента FlaB (f-FlaB), FlaA и DbpB геновида B.garinii и OspC (OspC-Ba) геновида B.afzelii западно-сибирских изолятов Borrelia burgdorferi s.l. для возможного их использования в качестве антигенов для серодиагностики ИКБ. Рекомбинантные белки OspC-Bg, OspC-Ba, f-FlaB, FlaA и DbpB исследованы методом иммуноферментного анализа (ИФА) на способность связывать антитела сывороток больных ИКБ с локализованной и диссеминированной стадией инфекции. Показано различие в их чувствительности как антигенов при определении специфических антител в сыворотке крови больных ИКБ. В сыворотке больных ИКБ с диссеминированной стадией уровень инфекции специфических IgM- и IgG-антител, реагирующих с OspC-Bg, OspC-Ba, f-FlaB, FlaA, DbpB, находился в пределах 15,7-52,6% для IgM и 36,8-63,2% для IgG. По результатам исследования сыворотки больных ИКБ методом ИФА на наличие IgM и IgG наивысшую антигенную активность определяли с антигенами OspC-Bg и f-FlaB. Результаты исследования позволяют рассматривать эти белки как перспективные компоненты для создания иммуноферментной тест-системы диагностики ИКБ.

Ключевые слова: иксодовый клещевой боррелиоз; рекомбинантный белок; Borrelia burgdorferi s.l.; иммунофер-ментный анализ; серодиагностика.

V.S. Karavayev1, E.S. Genina12, A.V. Ryabtchenko1, A.B. Beklemoschev1

THE IMPORTANCE OF RECOMBINANT PROTEINS OF WEST SIBERIAN ISOLATES OF BORRELIA BURGDORFERI S.L. FOR SEROLOGICAL DIAGNOSTIC OF IXODIC TICK BORRELIOSIS

1The research institute of biochemistry of the Sibirian branch of the Russian academy of medical sciences, 630117, Novosibirsk, Russia; 2The state research center of virology and biotechnology "Vector'; 630559, village of Koltsovo, the Novosibirsk oblast, Russia

The .structural proteins OspC, FlaB, FlaA and DbpB of agent of ixodic tick borreliosis are one ofmain antigens inducing humoral immunity at initial stages of disease. Owing to it, the task was stated to evaluate antigen activity of recombinant proteins OspC (OscP-Bg), fragment ofFlaB (f-FlaB) andDbpB of genospecies B.garinii and OspC (OscC-Ba) of genospecies ofB. afzelii ofWest Siberian isolates of Borrelia Burgdorferi S.L. for their possible application as antigens for serological diagnostic of ixodic tick borreliosis The recombinant proteins OscP-Bg, OscC-Ba, f-FlaB, FlaA and DbpB are analyzed using technique of enzymoimmunoassay to detect ability to bound antibodies of serums ofpatients with ixodic tick borreliosis with localized and disseminated stage of infection. The difference of their sensitivity as antigens during detection of specific antibodies in blood serum ofpatients with ixodic tick borreliosis was demonstrated. In serum of patients with ixodic tick borreliosis with disseminated stage of infection the level of specific IgM and IgG antibodies reacting with OscP-Bg, OscC-Ba, f-FlaB, FlaA and DbpB is within the limits 15.7-52.6% for IgG. The results of enzymoimmunoassay applied to patients with ixodic tick borreliosis for detection of IgM and IgG in serum demonstrated that OscP-Bg and f-FlaB determined the highest antigen activity with antigens. The study results make it possible to consider these proteins as perspective components for development of immune enzyme test system of diagnostic of ixodic tick borreliosis.

Keywords: ixodic tick borreliosis; recombinant protein; Borrelia Burgdorferi s.l.; enzymoimmunoassay; serum diagnostic

Введение. Иксодовый клещевой боррелиоз - ИКБ (лайм-боррелиоз, болезнь Лайма) - наиболее распространенное трансмиссивное, природно-очаговое заболевание, вызываемое спирохетами комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.). По уровню заболеваемости и тяжести клинического течения ИКБ представляет собой одну из наиболее актуальных проблем современной инфекционной патологии. По данным Роспотребнадзора заболеваемость ИКБ в 2010 г. по России составила 6,45 на 100 000 населения. По оценкам специали-

Для корреспонденции:

Караваев Виталий Семенович, науч. сотр. Адрес: 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2. E-mail: karavaev@soramn.ru.

стов, число зарегистрированных больных в 5-10 раз меньше реальной заболеваемости. Установление диагноза представляет определенные трудности из-за многообразия клинических проявлений и органных поражений при ИКБ, которые могут зависеть от индивидуальных особенностей организма и штаммовой принадлежности возбудителя.

В последние годы одним из наиболее распространенных и доступных лабораторных тестов на ИКБ является имму-ноферментный анализ (ИФА) с использованием в качестве антигена рекомбинантных белков боррелий или их полипептидных фрагментов из разных геновидов B. burgdorferi s.l. [6, 10, 19]. Лабораторная диагностика ИКБ существенно осложняется высокой антигенной вариабельностью представителей B. burgdorferi s.l., оказывающей негативное влияние на показатели чувствительности и специфичности диагно-

стических тест-систем. Большая протяженность территории России с запада на восток позволяет предполагать наличие значительного межвидового и внутривидового разнообразия генов, кодирующих иммунодоминантные белки B. burgdorferi s.l. на территории нашей страны. Это может послужить причиной недостаточной чувствительности иммуноферментных тест-систем, которые не содержат антигены, характерные для боррелий, циркулирующих на какой-либо конкретной территории. Для повышения чувствительности методов детекции антител к борре-лиям комплекса B. burgdorferi s.l. целесообразно использовать штаммы, эпидемически значимые для данной территории [4, 5, 11].

Структурные белки B. burgdorferi s.l., такие как OspC, FlaB, FlaA, DbpB, североамериканских и западно-европейских изолятов боррелий достаточно полно изучены и описаны [8, 9, 12, 15, 17, 18]. Белки OspC, FlaB, FlaA, DbpB присутствуют во всех без исключения патогенных штаммах B. burgdorferi s.l. и являются важными маркерами ИКБ [10, 13, 14, 16]. Информация об аналогичных белках спирохет комплекса B. burgdorferi s.l., циркулирующих на территории азиатской части России, отражена лишь в единичных работах [1, 2].

Целью настоящей работы является оценка антигенной активности рекомбинантных белков OspC, FlaB, FlaA и DbpB западно-сибирских изолятов B. burgdorferi s.l. в ИФА с сыворотками больных ИКБ для возможного их использования в диагностических целях на территории Западной Сибири.

Материалы и методы. Рекомбинантные антигены. В качестве антигена для ИФА были использованы рекомби-нантные белки OspC (OspC-Bg), фрагмент FlaB (f-FlaB), FlaA и DbpB геновида B. garinii, а также рекомбинантные белки OspC (OspC-Ba) геновида B. afzelii. с мол. массой 19, 20, 27, 38 и 20 кД соответственно. Источником генов, кодирующих эти белки, служили западно-сибирские изоляты B. garinii 20047т и NT29 и B. afzelii. Изоляты спирохет получены из клещей, отловленных в лесопарковой зоне Новосибирска [7]. Препараты ДНК изолятов использованы для амплификации методом ПЦР кодирующих областей генов белков OspC-Bg, OspC-Ba, FlaA, f-FlaB и DbpB. Установленные ну-клеотидные последовательности фрагментов генов OspC-Bg, OspC-Ba, FlaA, f-FlaB и DbpB западно-сибирских изолятов B. burgdorferi s.l. и кодируемые этими генами аминокислотные последовательности депонированы в Международную электронную базу данных «GenBank» под номерами: OspC-Bg - EU979626, OspC-Ba - EU979627, FlaA - EU979629, f-FlaB - EU979630 и DbpB - EU979628 соответственно. Рекомбинантные белки получали из биомасс культур клеток E. mli (штаммы BL21 и Rosetta 2), содержащих вектора на основе конструкции pET-m. Выделение и очистку рекомбинантных белков из биомассы клеток E. coli осуществляли с помощью аффинной хроматографии лизата клеток на колонке с Ni-NTA-сефарозой CL-6B. Количество белка определяли методом Лоури, используя для построения калибровочной кривой бычий сывороточный альбумин и IgG собаки. Чистота белков по данным SDS составляла не менее 90%. Антигены хранили в буферном растворе, содержащем 10 мМ трис -HCL, рН 7,5, 300 мМ NaCl, 20 мМ 2-меркаптоэтанол и 0,05% NaN3.

Сыворотки. В работе использовали охарактеризованные сыворотки крови больных ИКБ с мигрирующей эритемой (локализованная стадия инфекции; n = 36) и без мигрирующей эритемы (диссеминированная стадия инфекции; n = 19). Сыворотки больных ИКБ получены из инфекционной клинической больницы № 1 и областного диагностического центра Новосибирска. Диагноз у больных ИКБ с локализованной стадией инфекции установлен на основе анамнеза (укус кле-

Таблица 1

данные по выявлению в сыворотках больных ИкБ специфических IgM и IgG к рекомбинантным белкам В. burgdorferi s.l. в ИФА

Антигены Геновиды Количество положительных сывороток, %

IgM IgG

I стадия (n = 36) II стадия (n = 19) I стадия (n = 36) II стадия (n = 19)

DbpB B. garinii 5 (13,9) 3 (15,7) 5 (13,9) 7 (36,8)

FlaA B. garinii 15 (41,6) 6 (31,6) 14 (38,8) 8 (42,1)

f-FlaB B. garinii 18(50,0) 7 (36,8) 17 (47,2) 11 (57,9)

OspC-Bg B. garinii 20 (55,5) 10 (52,6) 17 (47,2) 12 (63,2)

OspC-Ba B. afzelii 16 (44,4) 8(42,1) 14 (38,8) 11 (57,9)

OspC-Bg + f-FlaB B. garinii 25 (69,4) 12 (63,2) 26 (72,2) 15 (79,0)

OspC-Bg + OspC-Ba B. garinii и B. afzelii 23 (63,9) 13 (68,4) 27 (75,0) 15 (79,0)

Примечание. I стадия - больные ИКБ с мигрирующей эритемой (стадия локализованной инфекции); II стадия - больные ИКБ без мигрирующей эритемы (стадия диссеминированной инфекции); в обоих случаях сыворотка взята в период 4-8 нед с начала заболевания; п - количество исследуемых образцов сывороток.

ща), наличия мигрирующей эритемы и данных клинического обследования. У больных ИКБ с диссеминированной стадией инфекции в анамнезе отмечен укус клеща и наблюдалась моно- или полиорганная симптоматика, характерная для дис-семинированной формы заболевания. Диагноз у всех больных ИКБ лабораторно подтвержден методом ИФА с использованием коммерческих иммуноферментных тест-систем «ЛаймБест-IgM» и «ЛаймБест-IgG» (ЗАО «Вектор-Бест»). При комплексном исследовании образцов сывороток больных ИКБ методом ИФА не обнаружено специфических IgM или IgG к спирохетам Tripanema pallidum и вирусу клещевого энцефалита. Образцы сывороток собраны в период с 3-й по 8-ю неделю после начала заболевания. Для определения неспецифических перекрестных реакций в качестве отрицательного контроля использовали образцы сывороток здоровых доноров (n = 30), больных сифилисом (n = 20) и больных ревматоидным артритом (n = 12). Образцы сывороток до исследования хранили при температуре -70°С.

Иммуноферментный анализ. Для оценки антигенной активности и специфичности рекомбинантных белков OspC-Bg, OspC-Ba, FlaA, f-FlaB и DbpB использовали метод твердофазного ИФА. Постановку IgM- и IgG-ИФА осуществляли в оптимальных режимах для каждого из антигенов, выявленных в предыдущих опытах [1, 2]. Выбор оптимальной концентрации антигенов проводили, исследуя взаимодействие их различных разведений с полистироловым носителем, с последующей регистрацией результатов ИФА с панелью сы-

Таблица 2

реактивность контрольных сывороток с рекомбинантными белками B. burgdorferi s.l. в ИФА

Антигены Количество сывороток с положительными результатами (%)

больные больные здоровые

сифилисом ревматоидным доноры

(n = 20) артритом (n = 12) (n = 30)

IgM IgG IgM IgG IgM IgG

DbpB 0 0 0 0 0 0

FlaA 2 (10,0) 2 (10,0) 1 (8,3) 1 (8,3) 0 0

f-FlaB 1 (5,0) 1 (5,0) 1 (8,3) 1 (8,3) 0 0

OspC-Bg 0 0 1 (8,3) 1 (8,3) 0 0

OspC-Ba 0 0 1 (8,3) 1 (8,3) 0 0

Примечание. n - количество исследованных проб сывороток.

Таблица 3

показатели абсолютной чувствительности рекомбинантных белков B. burgdorferi s.l. в ИФА по экспериментальной панели сывороток

Оптическая плотность Рекомбинантный белок

OspC-Ba OspC-Bg f-FlaB FlaA DbpB

Для IgM 2.83 ± 0,24 3,16 ± 0,19 2,89 ± 0,23 2,61 ± 0,23 2,26 ± 0,21 Для IgG 2,99 ± 0,18 3,22 ± 0,22 3,01 ± 0,21 2,76 ± 0,24 2,37 ± 0,21

вороток крови от больных ИКБ (положительный контроль P; n = 10). В качестве отрицательного контроля (N) использовали панель сывороток здоровых доноров (n = 10). За оптимальную концентрацию для каждого антигена принимали такую, при которой наблюдалось наибольшее различие в показателях оптической плотности положительного и отрицательного контролей, что соответствовало наибольшему значению их отношения (P/N). Параметр P определяли как среднее арифметическое для положительных сывороток, а значение N - как среднее арифметическое для отрицательных сывороток. Исследуемые белки использовали в концентрации 1-4 мкг/мл, достаточной для эффективной сорбции на полистироле. Для определения специфического комплекса антиген-антитело использовали пероксидазные конъюгаты на основе мышиных моноклональных антител против IgM и IgG человека. Рабочие разведения этих реагентов составили: для анти-IgG-антител 1:4000, для анти-^М-антител 1:3000.

Для подсчета критической оптической плотности (ОП ит) использовали 40 отрицательных образцов сывороток здоровых доноров. ОП ит устанавливали статистически как среднее значение ОП для группы здоровых доноров и двух стандартных отклонений, что соответствовало верхней границе 95% доверительного интервала для возможных значений показателя. Исходя из критических величин ОП с каждым из антигенов проводили анализ результатов тестирования исследуемых сывороток. Образцы считали положительными, если результат превышал пороговое значение ОП ит в двух из трех независимых зкспериментов.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы Excel для Windows XP. Вычисление величин среднеквадратической ошибки и другие определения достоверности результатов измерения проводили по критерию Стъюдента.

Результаты и обсуждение. На первом этапе работы ре-комбинантные белки OspC-Bg, OspC-Ba, FlaA, f-FlaB и DbpB исследованы с помощью вестерн-блот-анализа со смесью сывороток крови больных ИКБ в титре 1:100. В качестве отрицательного контроля использовали лизаты клеток E. coli BL21, несущих вектор без вставки генов OspC-Bg, OspC-Ba, FlaA, f-FlaB и DbpB. Для снижения фона, создаваемого связыванием иммуноглобулинов сывороток с белками E. coli BL21, перед внесением исследуемой сыворотки ее инкубировали с экстрактом белков E. coli BL21 в течение 10 мин. Вестерн-блот-анализ продемонстрировал высокую специфичность связывания антител сывороток больных ИКБ с рекомбинантными белками OspC-Bg, OspC-Ba, FlaA, f-FlaB и DbpB. В аналогичном зксперименте эти рекомбинантные белки не реагировали с антителами сывороток здоровых доноров.

Полученные результаты позволили приступить к решению основной задачи данного исследования - к сравнительной оценке антигенной активности и специфичности реком-бинантных белков OspC-Bg, OspC-Ba, FlaA, f-FlaB и DbpB по их способности взаимодействовать с антителами сывороток крови больных ИКБ, здоровых доноров, больных сифилисом и ревматоидным артритом. Результаты исследований сывороток больных ИКБ по выявлению специфичных IgM- и IgG-антител к OspC-Bg, OspC-Ba, FlaA, f-FlaB и DbpB методом ИФА представлены в табл 1.

При исследовании 36 образцов сывороток больных

ИКБ с локализованной стадией инфекции на наличие специфических IgM- и IgG-антител к антигенам OspC-Bg, OspC-Ba, FlaA, f-FlaB и DbpB положительные результаты получены с одним или несколькими антигенами. По результатам исследований образцов сывороток больных ИКБ с локализованной стадией инфекции наивысшую антигенную активность определяли с антигенами OspC-Bg и f-FlaB. Антигенная активность OspC-Bg при выявлении специфических как IgM-, так и IgG-антител несколько выше, чем у антигена OspC-Ba. Специфические IgM-антитела к антигену OspC-Bg выявлены в 20 (55,5%) исследованных образцах сывороток и к антигену OspC-Ba - в 16 (44,4%). При исследовании в ИФА сывороток больных ИКБ с локализованной стадией инфекции специфические IgG-антитела к антигенам OspC-Bg и OspC-Ba выявлены в 17 (47,3%) и в 14 (38,8%) образцах сывороток соответственно. Такое различие можно объяснить большей встречаемостью в клещах Ixodes persulcatus на территории Новосибирской области геновида B. garinii по сравнению с встречаемостью B. afzelii, что отражается и на инфицировании людей соответствующими геновидами боррелий [3].

При исследовании методом ИФА 19 образцов сывороток больных ИКБ с диссеминированной стадией инфекции наибольшую реактивность сывороток определяли с антигеном OspC-Bg. При этом специфические IgG-антитела к каждому из исследуемых антигенов выявлены более чем в 35% сывороток. В сыворотках больных ИКБ с диссеминированной стадией инфекции специфические IgG-антитела к антигенам FlaA и f-FlaB выявляли примерно с одинаковой частотой. Следует отметить относительно высокую частоту положительных результатов при исследовании методом ИФА сывороток больных ИКБ на наличие специфических IgG-антител к антигену DbpB. Частота выявления специфических IgG-антител к антигену DbpB у больных ИКБ с диссеминирован-ной стадией инфекции составила 36,8%.

При определении антигенной активности рекомбинант-ных белков OspC-Bg, OspC-Ba, FlaA, f-FlaB и DbpB становится очевидным, что добиться максимальной выявляемости специфических антител к возбудителю боррелиоза в сыворотках крови от больных ИКБ с помощью одного боррелиоз-ного антигена не представляется возможным. Использование в ИФА в качестве иммуносорбента комбинации из двух белков - OspC-Bg и f-FlaB - позволило определить максимальное количество положительных сывороток больных ИКБ, в том числе в сыворотках больных ИКБ, содержащих антитела к обоим антигенам на подпороговом значении ОП (в силу суммирования оптических плотностей). Даже использование двух антигенов не способно выявить все положительные сыворотки больных ИКБ. Чем больше специфических антигенов будет вовлечено в исследование, тем выше будут надежность и достоверность такого анализа.

Специфичность рекомбинантных белков OspC-Bg, OspC-Ba, FlaA, f-FlaB и DbpB оценивали по результатам исследования контрольных отрицательных сывороток (здоровых доноров, больных сифилисом и ревматоидным артритом) в ИФА (табл. 2). Сыворотки больных сифилисом реагировали с антигенами FlaA и f-FlaB. Наибольшее количество неспецифических реакций они давали с антигеном FlaA. Полученные результаты можно объяснить наличием антигенного родства у Trippоnema pallidum и возбудителей клещевых боррелиозов, что подтверждается данными, полученными при изучении генома этих спирохет [18]. С антигенами OspC-Bg и OspC-Ba сыворотки больных ревматоидным артритом давали неспецифические реакции крайне редко, а с антигеном DbpB не получено ни одного положительного результата. Сыворотки доноров не проявили реактивности в ИФА ни с одним из исследуемых антигенов.

По результатам исследования методом ИФА сывороток больных ИКБ, здоровых доноров, больных сифилисом и ревматоидным артритом на наличие специфических IgM- и

IgG-антител создана панель положительных и отрицательных сывороток. С использованием панели положительных и отрицательных сывороток для каждого антигена определены средние арифметические значения оптической плотности положительных (ОПс +) и отрицательных (ОПс -) сывороток, а также соотношение средних арифметических значений оптической плотности положительных и отрицательных сывороток (ОПс +/ОПс -), что позволило оценить степень абсолютной чувствительности антигенов. При сравнительной характеристике антигенов предпочтение отдавалось тем из них, которые давали наибольшее значение соотношения ОП положительного и отрицательного контролей (табл. 3). Антиген OspC-Bg имеет самый высокий показатель соотношения ОП положительного и отрицательного контролей по сравнению с OspC-Ba, FlaA, f-FlaB и DbpB, а значит, и большую абсолютную чувствительность. Значения соотношений ОП положительного и отрицательного контролей рекомбинант-ных белков OspC-Ba и f-FlaB существенно между собой не различались.

Заключение. Результаты проведенных исследований свидетельствуют об антигенной активности рекомбинантных белков OspC-Bg, OspC-Ba, f-FlaB, FlaA и DbpB западносибирских изолятов B. garinii и B. afzeii, что дает основание рассматривать эти белки как перспективные компоненты при создании иммуноферментных тест-систем для диагностики ИКБ на территории Западной Сибири.

ЛИТЕРАТУРА

1. Караваев В.С., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Иммунохими-ческий анализ рекомбинантных белков OspC западносибирских изолятов Borrelia garinii и Borrelia afzelii. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010; 1: 20-3.

2. Караваев В.С., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Иммунохими-ческий анализ рекомбинантного белка FlaA западносибирского изолята Borrelia garinii. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011; 4: 66-71.

3. Мамаев А.Л., Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Исследование зараженности иксодовых клещей, отловленных весной 2008 г. в рекреационной зоне г. Новосибирска, спирохетами Borrelia burgdorferi sensu lato. Бюллетень Сибирского отделения РАМН. 2010; 30 (2): 13-6.

4. Рябченко А.В., Караваев В.С., Беклемишев А.Б. Сравнительный структурный и иммунохимический анализ рекомбинантных антигенов OspC новосибирских изолятов спирохет Borrelia garinii и Borrelia afzelii. Бюллетень Сибирского отделения РАМН. 2010; 2: 6-12.

5. Фоменко Н.В., Мельникова О.В., Черноусова Н.Я., Епихина Т.И. Выявление антител к боррелиям комплекса Borrelia burgdorferi sensu.lato. Бюллетень сибирской медицины. 2008; Прил. 1: 78-84.

6. Aguero-Rosenfeld M.E., Wang G., Schwartz I., Wormser G.P. Diagnosis of lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18 (3): 484-509.

7. Beklemishev A.B., Dobrotvorsky A.K., Piterina A.V. et al. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato genospecies in Ixodes persulcatus ticks in West Siberia, Russia. FEMS Microbiol. Lett. 2003; 227 (2): 157-61.

8. Heikkilä T., Seppälä I., Saxen H., Panelius J., Peltomaa M., Huppertz H.I., Lahdenne P. Cloning of the gene encoding the decorin-binding protein B (DbpB) in Borrelia burgdorferi sensu lato and characterisation of the antibody responses to DbpB in Lyme borreliosis. J. Med. Microbiol. 2002; 51 (8): 641-8.

9. Kenedy M.R., Lenhart T.R., Akins D.R. The role of Borrelia burgdorferi outer surface proteins. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2012; 66 (1): 1-19.

10. Magnarelli L.A., Ijdo J.W., Padula S.J., Flavell R.A, Fikrig E. Se-rologic diagnosis of lyme Borreliosis by using enzyme-linked im-munosorbent assays with recombinant antigens. J. Clin. Microbiol. 2000; 38 (5): 1735-9.

11. Mavin S., Evans R., Milner R.M., Chatterton J.M., Ho-Yen D.O. Local Borrelia burgdorferi sensu stricto and Borrelia afzelii strains in a single mixed antigen improves western blot sensitivity. J. Clin. Pathol. 2009; 62: 552-4.

12. Neuvonen J., Viljanen M.K., Hytonen J. Binding hroperties of deco-

rin-binding proteins from three different Borrelia genospecies. 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Helsinki, Finland, 16-17 May 2009.

13. Padula S.J., Dias F., Sampieri A., Craven R.B., Ryan R.W. Use of recombinant OspC from Borrelia burgdorferi for serodiagnosis of early Lyme disease. J. Clin. Microbiol. 1994; 32: 1733-8.

14. Panelius J., Lahdenne P., Saxen H., Heikkilä T., Seppälä I. Recombinant flagellin A proteins from Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, and B. garinii in serodiagnosis of Lyme borreliosis. J. Clin. Microbiol. 2001; 39 (11): 4013-9.

15. Panelius J., Sillanpää H., Seppälä I., Sarvas H., Lahdenne P. Antibodies to recombinant decorin-binding proteins A and B in the cerebro-spinal fluid of patients with Lyme neuroborreliosis. Scand. J. Infect. Dis. 2007; 39 (9): 775-80.

16. Rauer S., Spohn N., Rasiah C., Neubert U., Vogt A. Enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant OspC and the internal 14-kDa flagellin fragment for serodiagnosis of early Lyme disease. J. Clin. Microbiol. 1998; 36: 857-61.

17. Salo J., Loimaranta V., Lahdenne P., Viljanen M.K., Hytönen J. Decorin binding by DbpA and B of Borrelia garinii, Borrelia afzelii, and Borrelia burgdorferi sensu Stricto. J. Infect. Dis. 2011; 204 (1): 65-73.

18. Wallich R., Moter S.E., Simon M.M., Ebnet K., Heiberger A., Kramer M.D. The Borrelia burgdorferi flagellum-associated 41-kilodalton antigen (flagellin): molecular cloning, expression, and amplification of the gene. Infect. Immun. 1990; 58 (6): 1711-9.

19. Wilske B., Fingerle V., Schulte-Spechtel U. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2007; 49: 13-21.

REFERENCES

1. Karavaev V.S., Ryabchenko A.V., Beklemishev A.B. An immunochemical analysis of the recombinant protein OspC West Siberian isolates of Borrelia garinii and Borrelia afzelii. Zhurnal mikrobi-ologii, epidemiologii i immunobiologii. Moscow 2010; 1: 20-3 (in Russian).

2. Karavaev V.S., Ryabchenko A.V., Beklemishev A.B. An immunochemical analysis of the recombinant protein FlaA West Siberian isolate Borrelia garinii. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i im-munobiologii. Moscow. 2011; 4: 66-71 (in Russian).

3. Mamaev A.L., Ryabchenko A.V., Beklemishev A.B. The study of infestation of ticks caught in the spring of2008 in the recreational area of Novosibirsk, spirochete Borrelia burgdorferi sensu lato Byulleten' Sibirskogo otdeleniya RAMN. Novosibirsk. 2010; 30 (2): 13-6 (in Russian).

4. Ryabchenko A.V., Karavaev V.S., Beklemishev A.B. Comparative structural and immunochemical analysis of recombinant antigens OspC Novosibirsk isolates spirochetes Borrelia garinii and Borrelia afzelii. Byulleten'Sibirskogo otdeleniya RAMN. Novosibirsk. 2010; 2: 6-12 (in Russian).

5. Fomenko N.V., Mel'nikova O.V., Chernousova N.Ya., Epikhina T.I. Detection of antibodies to a complex of Borrelia Borrelia burgdor-feri sensu.lato. Byulleten'sibirskoy meditsiny. Tomsk. 2008; Pril. 1: 78-84 (in Russian).

6. Aguero-Rosenfeld M.E., Wang G., Schwartz I., Wormser G.P. Diagnosis of lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18 (3): 484-509.

7. Beklemishev A.B., Dobrotvorsky A.K., Piterina A.V. et al. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato genospecies in Ixodes persulcatus ticks in West Siberia, Russia. FEMS Microbiol. Lett. 2003; 227 (2): 157-61.

8. Heikkilä T., Seppälä I., Saxen H., Panelius J., Peltomaa M., Huppertz H.I., Lahdenne P. Cloning of the gene encoding the decorin-binding protein B (DbpB) in Borrelia burgdorferi sensu lato and characterisation of the antibody responses to DbpB in Lyme borreliosis. J. Med.. Microbiol. 2002; 51 (8): 641-8.

9. Kenedy M.R., Lenhart T.R., Akins D.R. The role of Borrelia burg-dorferi outer surface proteins. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2012; 66 (1): 1-19.

10. Magnarelli L.A., Ijdo J.W., Padula S.J., Flavell R.A., Fikrig E. Se-rologic diagnosis of lyme Borreliosis by using enzyme-linked im-munosorbent assays with recombinant antigens. J. Clin. Microbiol. 2000; 38 (5): 1735-9.

11. Mavin S., Evans R., Milner R.M., Chatterton J.M., Ho-Yen D.O. Local Borrelia burgdorferi sensu stricto and Borrelia afzelii strains in a single mixed antigen improves western blot sensitivity. J. Clin. Pathol. 2009; 62: 552-4.

12. Neuvonen J., Viljanen M.K., Hytonen J. Binding hroperties of deco-rin-binding proteins from three different Borrelia genospecies. 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Helsinki, Finland, 16-17 May 2009.

13. Padula S.J., Dias F., Sampieri A., Craven R.B., Ryan R.W. Use of recombinant OspC from Borrelia burgdorferi for serodiagnosis of early Lyme disease. J. Clin. Microbiol. 1994; 32: 1733-8.

14. Panelius J., Lahdenne P., Saxen H., Heikkilä T., Seppälä I. Recombinant flagellin A proteins from Borrelia burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, and B. garinii in serodiagnosis of Lyme borreliosis. J. Clin. Microbiol. 2001; 39 (11): 4013-9.

15. Panelius J., Sillanpää H., Seppälä I., Sarvas H., Lahdenne P. Antibod-

ies to recombinant decorin-binding proteins A and B in the cerebro-spinal fluid of patients with Lyme neuroborreliosis. Scand. J. Infect. Dis. 2007; 39 (9): 775-80.

16. Rauer S., Spohn N., Rasiah C., Neubert U., Vogt A. Enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant OspC and the internal 14-kDa flagellin fragment for serodiagnosis of early Lyme disease. J. Clin. Microbiol. 1998; 36: 857-61.

17. Salo J., Loimaranta V., Lahdenne P., Viljanen M.K., Hytönen J. Decorin binding by DbpA and B of Borrelia garinii, Borrelia afzelii, and Borrelia burgdorferi sensu Stricto. J. Infect. Dis. 2011; 204 (1): 65-73.

18. Wallich R., Moter S.E., Simon M.M., Ebnet K., Heiberger A., Kramer M.D. The Borrelia burgdorferi flagellum-associated 41-kilodalton antigen (flagellin): molecular cloning, expression, and amplification of the gene. Infect. Immun. 1990; 58 (6): 1711-9.

19. Wilske B., Fingerle V., Schulte-Spechtel U. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2007; 49: 13-21.

Поступила 20.11.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616.31-022.07-078

Т.А. Петрушанко, В.В. Череда, Г.А. Лобань

СКРИНИНГОВАЯ ДИАГНОСТИКА МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ПОЛОСТИ РТА

Высшее государственное учебное заведение Украины, Украинская медицинская стоматологическая академия, г. Полтава

Предложеный авторами способ скрининговой оценки колонизационной резистентности полости рта позволил выявить ее снижение при поражении твердых тканей зубов кариесом и развитии катарального гингивита. Весной степень несостоятельности первичного барьерного механизма слизистой оболочки полости рта возрастает.

Ключевые слова: полость рта; колонизационная резистентность. T.A. Petrushanko, V.V. Tchereda, G.A. Loban

THE SCREENING DIAGNOSTIC OF MICRO ECOLOGICAL DISORDERS OF ORAL CAVITY The Ukrainian medical stomatological academy, Poltava, Ukraine

The original mode of screening evaluation of colonizational resistance of oral cavity made it possible to detect its decreasing under caries of teeth solid tissue and development of catarrhal gingivitis. In springtime, the degree of failure ofprimarily barrier mechanism of oral mucous membrane increases.

Keywords: oral cavity; colonizational resistance

Полость рта представляет собой экологическую систему, колонизируемую различными микроорганизмами, которые объединены в биопленку. Резидентная микрофлора как неотъемлемая часть этой микроэкосистемы совместно со слизистой оболочкой полости рта выполняет барьерно-защитную функцию и обеспечивает ее колонизационную резистентность. Совокупность защитных факторов организма и конкурентных защитных свойств нормальной микрофлоры создают микроэкологическую стабильность полости рта и предупреждают колонизацию слизистых оболочек посторонними микроорганизмами [1-3]. Важное значение в формировании колонизационной резистентности принадлежит резидентной микрофлоре, эпителиоцитам слизистой оболочки и их рецепторам, комплементарным адгезинам бактерий, которые формируют микробиоценоз конкретного биотопа [3, 5].

В результате исследований отечественных и зарубежных авторов показано, что в основе микроэкологических нарушений лежит угнетение колонизационной резистентности [2, 6, 7]. В случае снижения колонизационной резистентности уве-

Для корреспонденции:

Лобань Галина Андреевна, д-р мед. наук, проф., зав. каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии Адрес: 36024, Украина, Полтава, ул. Шевченко, 23 E-mail: galina.loban@gmail.com

личивается количество и расширяется спектр потенциально патогенных микроорганизмов, что в значительной мере определяет риск формирования и прогрессирования заболеваний твердых тканей зубов, пародонта и слизистой оболочки полости рта (СОПР) [4, 10].

Прогнозирование и ранняя диагностика микроэкологических нарушений СОПР имеют важное значение для осуществления мониторинга стоматологического здоровья. Широкое распространение кариеса и воспалительных заболеваний па-родонта особенно у лиц молодого возраста свидетельствует о том, что применяемые методы ранней диагностики несовершенны. Актуален поиск быстрых, доступных и эффективных скрининговых диагностических методов оценки функционального состояния полости рта, которые могут быть выполнены практическим врачом в условиях стоматологического приема.

Цель работы - повышение эффективности ранней диагностики микроэкологических нарушений СОПР путем использования способа скрининговой оценки ее колонизационной резистентности у больных кариесом и катаральным гингивитом в разные сезоны года.

Материалы и методы. В исследовании, проведеном в осенний (октябрь-ноябрь) и весенний (март-апрель) сезоны года, приняли участие 182 молодых пациента в возрасте 19-29 лет (93 мужчины и 89 женщин). Группы формировали осенью. Контрольную группу составили 22 пациента (11