CC BY
136
УДК 544.353.2; 543.422.3; 577.346
Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2012. Вып. 1
С. В. Пастон, О. А. Доммес
ИЗУЧЕНИЕ РАДИАЦИОННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК СПЕКТРАЛЬНЫМИ МЕТОДАМИ*
Введение. Известно, что под действием ионизирующей радиации в молекуле ДНК происходит разрушение, модификация и отщепление азотистых оснований (а.о.), а также локальное разрушение водородных связей (частичная денатурация) в местах образования указанных повреждений и на других участках макромолекулы [1]. Эти факторы оказывают противоположное влияние на спектр поглощения облучённой ДНК: частичная денатурация вызывает гиперхромный эффект, а разрушение а.о. приводит к уменьшению поглощения. Модификация а.о. вносит трудно предсказуемый вклад в спектр поглощения ДНК: к настоящему времени обнаружено множество соединений, возникающих в результате радиационно-химических превращений а.о., которые могут поглощать в том же спектральном диапазоне, что и ДНК [1, 2]. Таким образом понятно, что, измеряя только спектр поглощения облучённой ДНК, нельзя сделать вывода о степени нативности макромолекулы — необходимо попытаться оценить вклад в измеряемое поглощение макромолекулы указанных факторов.
Результаты многочисленных исследований показывают, что концентрация противо-ионов в растворе существенно влияет на степень радиационного поражения молекулы ДНК в растворе: с ростом ионной силы повреждения в структуре макромолекулы снижаются [3-5]. Однако однозначного объяснения механизма влияния ионов на радиационный эффект пока нет: слишком много факторов играют роль в этом явлении и учесть влияние каждого из них, разделить их вклад, весьма непросто. Прежде всего концентрация и тип противоионов определяют вторичную и третичную структуру нативной ДНК, состав и структуру её гидратных оболочек [6]. В частности, увеличение ионной силы раствора приводит к снижению объёма макромолекулярного клубка, а значит, к уменьшению размера мишени [7]. Структура гидратной оболочки ДНК влияет на радиационный эффект как минимум по двум причинам: из-за изменения вторичной структуры ДНК и изменения количества связанных с ДНК молекул воды, которые являются частью мишени [8-11]. Кроме того, продукты радиолиза молекул воды, связанных с ДНК и свободных (находящихся в растворе), различаются [12], так что варьирование ионной силы раствора приводит к изменению состава продуктов радиолиза воды.
Целью представленной работы было исследование влияния ионной силы раствора на изменения спектральных параметров молекулы ДНК под действием гамма-излучения, и попытка связать эти изменения со структурными повреждениями макромолекулы.
Материалы и методы. Использовали ДНК фирмы "Sigma" из тимуса телёнка молекулярной массой M = (11,2 ± 0,6) • 106 Да. Молекулярная масса ДНК определялась по значению характеристической вязкости [п] в растворе 0,15М NaCl [13]. Оптическое поглощение растворов ДНК измеряли на спектрофотометре СФ-56 (Россия). Молярный коэффициент экстинкции ДНК, который позволяет судить о степени нативности макромолекулы [14], рассчитывали по формуле
£260 = 3Ш26с/(0,099СТ),
* Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 09-08-01119-а). © С. В. Пастон, О. А. Доммес, 2012
*
я 1,21,00,80,60,40,20,0
0
30 Гр
• 50 Гр
—*— 100 Гр
• 300 Гр
—о— 500 Гр
700 Гр
900 Гр
1000 Гр
220 240
260 280 Я, нм
300 320
220 240
260 280 Я, нм
300 320
Рис. 1. Спектры УФ-поглощения ДНК при | = 0,003 (а) и 3,2М ^С1 (б): указаны дозы облучения
где ^260 — оптическая плотность раствора ДНК при \ = 260 нм; I — длина кюветы, см; 0,099 = 9,9 % — процентное содержание фосфора в ДНК; 31 — атомный вес фосфора; С — концентрация ДНК в растворе.
Гидролиз ДНК проводили, добавляя 3 мл 6% НС104 к 1 мл раствора ДНК, затем полученный раствор выдерживали в течение 20 мин на кипящей водяной бане, после чего резко охлаждали при 0 °С. Гиперхромный эффект ДНК вычисляли по формуле
Н
ё260{ку<1г) - £260(попкуск) е2бо (куск)
• 100 %
(2)
где Е2бо(попЬуйг) — молярный коэффициент экстинкции ДНК в исходном растворе; £26о(^у^г) — молярный коэффициент экстинкции ДНК после гидролиза.
Концентрацию ДНК (т. е. концентрацию а.о.) в растворе (С) определяли по методу Спирина [15] из спектра УФ-поглощения полученных гидролизатов:
С
10,1(Д270 - £>290)^2 0,19 VI:
(3)
где ^270 и ^290 — оптические плотности гидролизата при Х4 = 270 нм и Х2 = 290 нм; V — объём исходного раствора ДНК; V — объём гидролизата. Используя найденное значение С в растворе после облучения, по формуле (1) определяли новое, исправленное значение молярного коэффициента экстинкции ДНК.
Растворы ДНК подвергали воздействию у-излучения 60 Со в аэробных условиях на установке «Исследователь» в Петербургском институте ядерной физики им. Б. П. Константинова. Мощность дозы составляла 20 Гр/мин. Концентрация ДНК в облучаемых растворах составляла С = 0,004 + 0,006 г/дл. Использовали соль МаС1 марки х.ч.
Результаты и обсуждение. В работе получены спектры УФ-поглощения ДНК, гамма-облучённой дозами П = 0 + 1000 Гр, в растворах ионной силы | = 0,003, 0,15, 1, 3,2М ^С1. На рис. 1 показаны для примера серии спектров при | = 0,003 и 3,2М ^С1. В растворах малой ионной силы хорошо заметно монотонное снижение интенсивности в максимуме спектра (рис. 1, а). При увеличении ионной силы этот эффект
бя 1,8-, 1,61,41,21,00,80,60,40,20,0 -0,2-
ц = 0,003М ЫаС1 Б = 0 Н = 32 %
- негидролизованная ■гидролизованная
220 240
260 280 Я, нм
300 320
бя 1,00,8 0,6 0,4 0,2 0,0
ц = 0,003М ЫаС1 Б = 500 Гр Н = 11 %
220 240
260 280 Я, нм
300 320
бя 1,6-,
1,41,21,00,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2
ц = 3,2М ЫаС1 Б = 0 Н = 36 %
220 240
260 280 Я, нм
300 320
бя 1,6-,
1,41,21,00,8 0,6 0,4 0,2 0,0 -0,2
ц = 3,2М ЫаС1 Б = 500 Н = 33 %
220 240
260 280 Я, нм
300 320
Рис. 2. Спектры УФ-поглощения ДНК до и после гидролиза: указаны доза облучения и ионная сила
исчезает (рис. 1, б). Для нативной молекулы ДНК подробно изучен гипохромный эффект: значение оптической плотности двунитевой ДНК при X = 260 нм примерно на 40 % ниже, чем суммарная оптическая плотность всех нуклеотидных звеньев, взятых в виде смеси мономеров той же концентрации С. Обратное явление называется ги-перхромным эффектом [16]. Гипохромный (гиперхромный) эффект пропорционален количеству нуклеотидов, находящихся в спиральном состоянии, поэтому он позволяет судить о степени нативности ДНК.
На рис. 2 показаны спектры поглощения ДНК в растворах ц = 0,003 и 3,2М ^С1, необлучённой и гамма-облучённой дозой 500 Гр до и после гидролиза, приведённые к одной и той же концентрации С. Видно, что гиперхромный эффект для необлучённой ДНК в этих растворах составляет 32 и 36 % соответственно (максимальный гиперхро-мизм Н = 40 % не достигается, т. к. в ходе гидролиза не происходит полного разделения ДНК на мономеры, остаются однонитевые полимерные фрагменты). После облучения наблюдается снижение гиперхромизма, более заметное в растворе малой ионной силы (рис. 2, б, г).
Н, % 35
30
25
20
15
10
5
Рис. 3. Зависимость гиперхромно-го эффекта от дозы облучения
бя
0,4
а
0,003М <► 0,15М
60 Б, Гр
0 0,
30 Гр 0,
50 Гр 100 Гр
300 Гр 0,3
500 Гр 0,3
700 Гр 900 Гр
1000 Гр 0,2-1
220 240
260 280 Я, нм
300 320
220 240
260 280 Я, нм
300 320
Рис. 4. Спектры УФ-поглощения ДНК, гидролизованной после гамма-облучения в растворе 0,003М (а) и 3,2М (б): указаны дозы облучения
Зависимость гиперхромного эффекта от дозы облучения показана на рис. 3. В литературе упоминается индуцированная радиацией «потеря гиперхромизма» ДНК, которую авторы связывали с разрушением хромофорных групп [3, 17]. Действительно, после гидролиза растворов, в ходе которого вторичная структура макромолекулы оказывается полностью разрушенной и поглощение определяется только количеством и составом хромофоров, также наблюдается монотонное снижение интенсивности в максимуме спектра с ростом дозы облучения, более заметное при меньшей ионной силе (рис. 4).
Если пренебречь вкладом в поглощение гидролизованной ДНК модифицированных а.о. (учесть который на данном этапе исследования не представляется возможным), можно определить концентрацию хромофоров в облучённых растворах из спектров гид-ролизатов по методу Спирина [15] (формула (3)). Полученные результаты представлены
(С0 - С.)/С0 ^ 0,003М <► 0,15М
0,6
0,4
0,2
0,0
20
40
В, Гр
60
100
Рис. 5. Дозовые зависимости относительного уменьшения концентрации хромофоров в облучённых растворах ДНК:
С — концентрация а.о. при данной дозе облучения, Со — концентрация а.о. в необлучённом растворе; указаны ионные силы растворов
1,6-|
1,51,41,31,21,1 1,00,9
20
40 60 В, Гр
100
Рис. 6. Дозовые зависимости относительного изменения молярного коэффициента экстинкции облучённой ДНК:
£260(Р) и 6260(Р)о — значения для облучённой и необлучённой ДНК соответственно
0
на рис. 5. Видно, что количество разрушенных а.о. существенно снижается с ростом ионной силы облучаемого раствора. Используя найденные значеннния концентраций а.о. после облучения, мы можем оценить молярный коэффициент экстинкции облучённой ДНК по спектрам поглощения негидролизованных облучённых растворов (пример таких спектров — рис. 1). Полученные значения представлены на рис. 6. Опыт показывает, что радиационные нарушения во вторичной структуре макромолекулы (частичная денатурация) также снижаются с ростом
Таким образом, результаты свидетельствуют о том, что радиочувствительность ДНК снижается с увеличением ионной силы раствора. Следует отметить, этот эффект не может быть обусловлен только уменьшением объёма макромолекулярного клубка с ростом | раствора: известно, что объём ДНК в растворах 0,15М, 1М и 3,2М МаС1 практически одинаков [7, 18], тогда как радиационное поражение макромолекулы в этих растворах существенно различается (см. рис. 3, 5, 6). Можно предположить, что
наблюдаемое снижение радиочувствительности ДНК с ростом ц раствора обусловлено изменениями в гидратной оболочке макромолекулы, а именно, уменьшением степени гидратации ДНК.
Как уже упоминалось, данные многих работ свидетельствуют, что снижение степени гидратации ДНК ведёт к уменьшению её радиочувствительности [8—11]. Безусловно, вторичная структура нативной ДНК в изучаемых нами системах соответствовала В-форме [6], так что её первичная гидратная оболочка, состоящая для В-формы двойной спирали из 20 молекул воды на нуклеотид, по-видимому, не изменялась при варьировании ионной силы раствора в условиях проведённого эксперимента. Следовательно, можно допустить, что изменения затрагивали вторичную гидратную оболочку макромолекулы, в состав которой входят и противоионы [6, 19].
Таким образом, полагаем, что наблюдаемое нами снижение радиационного эффекта с увеличением ионной силы облучаемого раствора ДНК связано с изменениями структуры и состава вторичной гидратной оболочки макромолекулы.
Авторы выражают глубокую благодарность Майе Александровне Сибилёвой, Августину Ивановичу Сибилёву, Анатолию Викторовичу Важову и Валерию Николаевичу Вербенко за помощь при проведении гамма-облучения исследованных систем в Петербургском институте ядерной физики им. Б.П.Константинова.
Литература
1. Кудряшов Ю. Б. Радиационная биофизика (ионизирующие излучения). М., 2004. 442 с.
2. Sonntag C. von Free-Radical-Induced DNA Damage and Its Repair: A Chemical Perspective. Berlin—Heidelberg, 2006. 528 p.
3. РябченкоН. И. Радиация и ДНК. М., 1979. 190 c.
4. Frisman E, Zarubina O. Effect of gamma-irradiation on the conformation of the native DNA molecule // Biophys. Chem. 1993. Vol. 46. P. 37-46.
5. Фрисман Э. В., Зарубина О. П. К вопросу о природе радиационного поражения молекулы ДНК при гамма-облучении её растворов // Докл. АН СССР. 1988. Т. 298. С. 2.
6. ЗенгерВ. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М., 1987. 584 с.
7. Фрисман Э. В. Оптическое и гидродинамическое поведение ДНК и её комплексов с биологически активными молекулами // Сб. докл. симпозиумов IV Международного биофизического конгресса. Пущино, 1973.
8. Ito T., Baker S. C., Stickley C. D. et al. Dependence of the yield of strand breaks induced by gamma-rays in DNA on the physical conditions of exposure: water content and temperature // Int. J. Radiat. Biol. 1993. Vol. 63. P. 289-296.
9. SwartsS. G., Sevilla M. D., Becker D. et al. Radiation-Induced DNA Damage as a Function of Hydration // Rad. Res. 1992. Vol. 129. P. 333-344.
10. Folkard M., Prise K. M., Brocklehurst B., MichaelB. D. DNA damage induction in dry and hydrated DNA by synchrotron radiation // J. Phys. (B). 1999. Vol. 32. P. 2753-2761.
11. Eschenbrenner A., Hervé du Penhoat M.-A., Boissiere A. et al. Strand breaks induced in plasmid DNA by ultra soft X-rays: Influence of hydration and packing // Int. J. Radiat. Biol. 2007. Vol. 83. P. 687-697.
12. Milano M. T., Bernhard W. A. The Effect of packing and conformation on free radical yields in films of variably hydrated DNA // Rad. Res. 1999. Vol. 151. P. 39-49.
13. EignerJ., Doty P. Native, denatured and renatured states of deoxyribonucleic acid //J. Mol. Biol. 1965. Vol. 12. P. 549-580.
14. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия: в 3-х т. М., 1984. Т. 2. 496 c.
15. Спирин А. С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. 1958. Т. 23. С. 656-662.
16. Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот / под. ред. Ю. С. Ла-зуркина. М., 1967. 325 с.
17. RafiA. A., Wheeler C. M. On the radiation-indused hyperchromicity of DNA // Int. J. Radiat. Biol. 1973. Vol. 24. P. 321-323.
18. ФрисманЭ. В., КасьяненкоН. А. Гидродинамическое и оптическое поведение молекулы ДНК в растворах большой ионной силы // Молек. биология. 1990. Т. 24. С. 301-317.
19. HudN. V., PolakM. DNA-cation interactions: the major and minor grooves are flexible ionophores // Current Opinion in Structural Biology. 2001. Vol. 11. P. 293-301.
Статья поступила в редакцию 27 сентября 2011 г.
