CC BY
75
Ю. В. Космотынская, Р. Т. Иманбаев, А. А. Богданов, Н. А. Касьяненко
АНАЛИЗ СОВМЕСТНОГО ДЕЙСТВИЯ РАДИАЦИИ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ ПЛАТИНЫ НА СТРУКТУРУ И СВОЙСТВА МОЛЕКУЛЫ ДНК В РАСТВОРЕ
Введение. Одним из первых противоопухолевых соединений на основе платины, нашедшим своё применение в медицине, стала цис-диаминдихлорплатина (цис-ДДП) [1, 2], которая широко используется при лечении, например, рака яичников, карциномы и ряда других опухолей [3, 4]. Однако клинические исследования показали, что, наряду с противоопухолевыми свойствами, цис-ДДП обладает высокой токсичностью и вызывает ряд побочных эффектов [5]. Поэтому большое внимание уделяется поиску и изучению новых соединений платины, обладающих противоопухолевой активностью и оказывающих более щадящее воздействие на организм [6, 7]. Для этого, в частности, широко используется комбинированное действие препаратов платины с веществами, способными улучшить терапевтический эффект [8-10]. Применяется и последовательное лечение пациентов разными препаратами платины, особенно после развития резистентности к одному из соединений. Так как некоторые препараты плохо растворимы в воде, на практике используют различные растворители, хорошо смешиваемые с водой, например ДМСО [11].
В связи с этим представляет интерес исследование взаимодействия препаратов платины с молекулой ДНК при изменении состава растворителя. Совместное использование на практике химиотерапии и у-облучения тканей требует изучения взаимного влияния этих двух факторов на основную мишень — молекулу ДНК. В последнее время большой интерес проявляется к комплексам платины с серосодержащими лигандами. Так как цис-ДДП после введения в плазму крови встречается с большим количеством серосодержащих соединений, они могут играть определённую роль при транспорте препаратов платины в организме [12]. Существует мнение, что модификация комплексов на основе платины путём введения в их первую координационную сферу лигандов, содержащих серу, может уменьшить токсический эффект [13, 14]. Перспективным соединением является ДМСО. Он малотоксичен (используется в пищевой и косметической промышленности), хорошо проникает через биологические мембраны [15].
Методы исследования и материалы.
Вискозиметрия. В представляемой работе использовали модифицированный низкоградиентный вискозиметр типа Зимма—Крозерса [16], а также градиенты скорости д в диапазоне 0,4-2,0 с-1. Характеристическую вязкость определяли экстраполяцией концентрационной зависимости приведённой вязкости к нулевой концентрации ДНК:
[г|] = 1™ -—= Иш ^г' \
5^0 п0с 9^0 С
0^0 0^0
где п и по — вязкости раствора и растворителя; С — концентрация раствора, цг — его относительная вязкость. Согласно Флори, характеристическая вязкость макромолекулы связана с её параметрами соотношением
© Ю.В.Космотынская, Р.Т.Иманбаев, А.А.Богданов, Н.А.Касьяненко, 2011
где Фо — константа Флори для данной системы полимер—растворитель (зависит от качества растворителя и жёсткости макромолекул [17-19]); М — молекулярная масса; а — коэффициент линейного набухания макромолекулы, равный отношению среднеквадратичных расстояний между концами реальной и идеальной молекулы:
\J h2/4-
Молекулярную массу ДНК определяли по значению характеристической вязкости в 0,15 М NaCl по формуле [п] = 6,9 • 10-4M0,7 (дл/г).
Динамическое двойное лучепреломление (ДЛП). В работе использовали установку ДЛП с полутеневым эллиптическим компенсатором [20]. Зависимость двойного лучепреломления Дп растворов ДНК от градиента скорости потока д позволяет найти величину (Дп/(дСцо))д^0. Динамооптическая постоянная определяется из выражения
Дп
п = пт ------.
д^0 дСцо
о^о
Отношение экспериментально определяемых величин [п]/[п] пропорционально оптической анизотропии макромолекулы (yi — 72), где yi и у2 — главные поляризуемости макромолекулы, которой приписывается одноосная симметрия оптических свойств. При отсутствии эффекта формы величина (Дп/д)д^0/(ц — по), определяемая при конечных концентрациях полимера в растворе, совпадает с отношением характеристических величин [п]/[п] и позволяет определить оптическую анизотропию статистического сегмента.
Спектральные методы. В работе использовали автодихрограф “Mark IV” (Jovin Ivon, Франция). Все измерения проводили в кювете длиной l = 5 см.
Спектральные исследования выполнялись на спектрофотометрах СФ-26, СФ-56, “Specord UV VIS”.
Гамма-облучение производилось в аэробных условиях при комнатной температуре на установке ЛМБ-y-I (137Cs) с мощностью дозы облучения 40 Гр/мин и энергией квантов 0,662 МэВ в Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург), а также на установке «Исследователь» (60Co) с мощностью дозы 20 Гр/мин и энергией квантов 1,332 МэВ в Санкт-Петербургском институте ядерной физики им. Б. П. Константинова. Концентрация ДНК во всех растворах лежала в пределах от 0,01 до 0,015 %. Доза облучения составила 1 крад.
Материалы. В работе использовалась тимусная ДНК фирмы «Sigma» (M = = 7,5 млн Да (11000 пар оснований)). Соединения платины синтезированы в Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии К. И. Яковлевым и в Санкт-Петербургском технологическом университете В. Н. Спеваком:
NH
NH
Pt
Cl NH
Cl Cl
Pt
Cl
NH
-nh2 Cl
CH \ zCI
1 2 Pt
CH2 / \
NH
Cl
NH2
CH 2
Cl
' 2 /Pt\ 'CH
NH2 O CH3
CH
NO
а
3
(1 — цис-ДДП; 2 — транс-ДДП; 3 — Pten; 4 — Pten(ДМСО).) 206
Применяли диметилсульфоксид (СНз)280 фирмы «Реактив» (ММ = 78,13), а также соли металлов марки х.ч. Все измерения проводили при температуре 21 °С.
Экспериментальные результаты и их обсуждение. Клиническое использование препаратов платины, как и действие ионизирующего излучения, основано на повреждении ДНК опухолевых клеток. На практике часто встречается последовательное сочетание радиационной терапии с применением противоопухолевых препаратов. В связи с этим представляет большой интерес вопрос о совместном влиянии этих факторов на генетический аппарат клетки. Рассмотрим последовательное и совместное действие гамма-облучения и комплексообразования с координационными соединениями платины на молекулярном уровне, контролируя конформацию молекулы ДНК.
Известно, что соединения цис- и транс-ДДП образуют комплекс с молекулой ДНК только в растворах малой ионной силы [21, 22]. Авторы работы в качестве поддерживающего электролита использовали 0,005М ^С1.
В работах [23, 24] было показано, что при гамма-облучении дозой 1 крад происходит уменьшение объёма молекулы ДНК без изменения её термодинамической жёсткости. Существует мнение, что облучение влияет на зарядовые свойства макромолекулы, уменьшая заряд её фосфатных групп из-за взаимодействия с продуктами радиолиза воды [25, 26]. Это существенно изменяет взаимодействие ДНК с заряженными лигандами в растворе. Отсюда, надо полагать, связывание ДНК с цис- и транс-ДДП может измениться, если заряд макромолекулы играет важную роль при взаимодействии компонентов. Действительно, в растворе 1М ^С1 цис- и транс-ДДП с ДНК не взаимодействуют [21, 22]. Однако существует мнение, что большие концентрации ^С1 в растворе препятствуют акватации цис- и транс-ДДП, которая является необходимым звеном для реализации координационной связи платина—ДНК. Таким образом, проведённые исследования интересны не только с точки зрения изучения особенностей применения препаратов платины после поражений ДНК, вызванных гамма-облучением, но и для понимания механизма поражающего действия радиации.
В работе использовали тимусную ДНК (11000 пар оснований). При облучении растворов концентрация ДНК составляла 0,01-0,015 %. Мы использовали одинаковые концентрации препаратов платины С = 5 • 10~5М.
Эксперимент показал, что гамма-облучение растворов приводит к уменьшению величины [п]. Эти данные хорошо согласуются с результатами работы [22]. Образование комплексов цис-ДДП и транс-ДДП с необлучённой ДНК приводит к одинаковому падению значения характеристической вязкости макромолекулы [21, 22]. Комплексооб-разование соединений платины с облучённой ДНК вызывает падение её объёма для цис- и транс-ДДП. Следовательно, соединения платины так же хорошо связываются с гамма-облучённой ДНК, как и с нативной. Если изменение зарядовых свойств ДНК и происходит, это не отражается на взаимодействии макромолекулы с препаратами платины. Степень связывания, по-видимому, также одинакова для взаимодействия цис- и транс-ДДП с облучённой и необлучённой ДНК. Таким образом, мы не можем говорить о полном подавлении электростатических взаимодействий в рассматриваемых условиях, так как для реализации координационной связи соединения платины должны с помощью электростатических сил приблизиться к макромолекуле на расстояние, при котором возможно вовлечение группы ДНК в первую координационную сферу платины. Изучение влияния у-облучения на сформированный комплекс ДНК с цис-и транс-ДДП показало, что связывание препарата платины не препятствует действию облучения на ДНК, хотя характеристическая вязкость при этом падает меньше, чем при облучении свободной ДНК (рис. 1; таблица).
220 240 260 280 300
Рис. 1. Спектры КД ДНК в комплексах с препаратом Гівп в 0,005М при совместном и последовательном действии комплексообразова-ния и гамма-облучения
Результаты гидродинамических исследований комбинированного действия препаратов платины и гамма-облучения на молекулу ДНК в растворе 0,005М NaCl
Комплекс И, дл/г (А'їднк = 7,5 млн. Да) Ата - „я 2
д(цг - 1) ло
ДНК необл. 78 ±3 23 ± 2
ДНК обл. 1 крад 33 ±3 23 ± 2
(ДНК+чмс-ДДП) необл. 60 ±2 15 ±2
(ДНК обл. 1 крад + цис-ДДП) 25 ±2 15 ±2
(ДНК+чмс-ДДП)обл. 1 крад 36 ±3 -
(ДНК+трамс-ДДП) необл. 60 ±2 28 ± 2
(ДНК обл. 1 крад + трамс-ДДП) 25 ±3 30 ± 2
(ДНК+трамс-ДДП) обл. 1 крад 36 ±3 -
(ДНК обл. 1 крад + Р1еп обл. 1 крад) 24 ±2 -
(ДНК обл. 1 крад + Р1еп) 24 ±2 15 ±2
(ДНК обл. 1 крад + РіепДМСО) 24 ±2 20 ± 2
(ДНК + РіепДМСО) обл. 1 крад 37 ±3 22 ±2
(ДНК + Р1еп) обл. 1 крад 34 ±3 19 ±2
(ДНК + Р1еп) необл. 62 ±2 15 ±2
(ДНК + РіепДМСО) необл. 60 ±2 19 ±2
При использовании соединений Р1еп и РІеп(ДМСО) были получены аналогичные результаты. В таблице приведены также данные для комплексов облучённой ДНК с облучённым заранее той же дозой препаратом Р1еп и результат облучения сформированных комплексов ДНК с Р1еп и РІеп(ДМСО). Эти данные совпали с рассмотренными выше зависимостями. Следовательно, облучение не влияет на возможность соединений платины связываться с ДНК. При облучении комплексов ДНК с РІеп(ДМСО) величина [п] падает несколько меньше, что отличается от рассмотренных выше результатов для цис- и транс-ДДЦ, а также от результата действия облучения на свободную ДНК.
Исследования показали, что спектры УФ-поглощения соединений меняются незначительно при облучении, так же как и спектр УФ-поглощения ДНК и её комплексов с препаратами платины. Дестабилизации ДНК при гамма-облучении её комплексов не
происходит. Результаты, полученные методом КД, подтверждают выводы, сделанные при анализе данных спектрофотометрии. Ранее было показано [25, 26], что Р1еп образует две координационные связи с ДНК, а Р1еп(ДМСО) связывается монодентатно. Облучение не влияет на вид спектров КД ДНК, тогда как связывание ДНК с Р1еп при используемых концентрациях платины приводит к увеличению и сдвигу положительного максимума, а связывание с Р1еп(ДМСО) — к его понижению без сдвига. Спектры КД ДНК при комплексообразовании с Р1еп и Р1еп(ДМСО) различаются, что отражает разный способ связывания этих соединений с макромолекулой. Предварительное облучение ДНК не меняет характер взаимодействия изучаемых препаратов с ДНК, облучение комплексов также существенно не меняет вид спектров КД ДНК. И эти данные согласуются с результатами, полученными для препаратов цис- и транс-ДДП.
В работах [23, 24] с помощью методов ДЛП в потоке и вискозиметрии подробно исследованы конформационные изменения молекулы ДНК при гамма-облучении её растворов в области ионных сил 0,003М ^ ц ^ 0,1М ^С1. Было показано, что отношение динамооптической постоянной [и] к характеристической вязкости [п] ДНК, облучённой дозами 10-30 Гр, оставалось постоянным и равным значению, полученному для необлучённой ДНК, что указывало на неизменность жёсткости и вторичной структуры макромолекулы. Мы получили результаты, согласующиеся с этими выводами. Комплексообразование ДНК с соединениями платины вызывает изменение оптической анизотропии ДНК, зависящее от типа препарата. Облучение комплексов, как и взаимодействие соединений с облучённой ДНК, вызывают такие же изменения оптической анизотропии ДНК.
Ионизирующая радиация может вызывать различные структурные повреждения ДНК, наиболее опасными из них являются двунитевые разрывы [27]. Введение в биологические объекты перед облучением молекул-примесей, способных конкурировать с макромолекулами за активные продукты радиолиза воды, приводит к снижению радиационного поражения макромолекул. Существует мнение, что ДМСО является одним из таких соединений, — он способен перехватывать ОН-радикалы и в меньшей степени гидратированные электроны, несмотря на то, что взаимодействие ДМСО с ОН-ра-дикалами может привести к образованию СНз-радикалов [28, 29]. Как было показано выше, при облучении комплексов ДНК с препаратами платины меньшее падение характеристической вязкости фиксируется при использовании Р1еп(ДМСО). Это косвенным образом может указывать на протекторные свойства диметилсульфоксида, входящего в состав первой координационной сферы платины.
Мы провели изучение влияния облучения на молекулу ДНК в присутствии ДМСО. На рис. 2 показана зависимость от С (ДМСО) характеристической вязкости необлучён-ной ДНК 1 и ДНК 2, облучённой дозой 1 крад, при разных концентрациях ДМСО в растворе. Ионная сила растворов составляла 0,005М ^С1. Видно, что при облучении растворов ДНК, содержащих ДМСО, наблюдается защита макромолекулы от действия радиации. Об этом свидетельствует совпадение значений характеристической вязкости необлучённой и облучённой в присутствии ДМСО ДНК в некоторой области С(ДМСО). При этом оптическая анизотропия ДНК, облучённой дозой 1 крад в присутствии разных концентраций ДМСО, совпадает со значением, полученным для необлучённой ДНК в присутствии ДМСО. Исследования показали, что ДМСО связывается с облучённой ДНК в растворе, но вызывает меньшее изменение объёма ДНК. Зависимость характеристической вязкости растворов облучённой ДНК с последующим добавлением разных концентраций ДМСО сходна с зависимостью для необлучённых растворов. Таким образом, наши исследования подтвердили предположение о том, что
С(ДМСО), М
Рис. 2. Зависимость характеристической вязкости необлучённой ДНК в присутствии разных концентраций ДМСО (1) и ДНК в присутствии разных концентраций ДМСО после облучения дозой 1 крад (2) от концентрации ДМСО в растворе; зависимость характеристической вязкости ДНК облучённой дозой 1 крад, с последующим добавлением разных концентраций ДМСО от С(ДМСО) в растворе (3)
ДМСО является перехватчиком свободных радикалов, образующихся при радиолизе воды, и защищает ДНК от поражающего действия радиации.
Литература
1. Rosenberg B., Van CampL., Krigas T. Inhibition of cell division in Escherichia Coli by electrolysis products from a platinum electrode // Nature. 1965. Vol. 205. P. 698-699.
2. Rosenberg B., Van CampL., Trosko J. E, Mansour V. N. Platinum compounds: a new class of potent antitumour agents // Nature. 1969. Vol. 222. P. 385-386.
3. Oliver T, MeadG. Testicular cancer // Curr. Opin. Oncol. 1993. Vol. 5. P. 559-567.
4. Stathopoulos G. P., Rigatos S., MalamosN. A. Paclitaxel combined with cisplatin as second-line treatment in patients with advanced non-small cell lung cancers refractory to cisplatin // Oncol. Rep. Vol. 6. 1999. P. 797-800.
5. HillJ. M., Speer R. J. Organo-platinum complexes as antitumor agents (review) // Anticancer Res. Vol. 2. 1982. P. 173-186.
6. Wong E, Giandomenico C. M. Current status of platinum-based antitumor drugs // Chem. Rev. 1999. Vol. 99. P. 2451-2466.
7. WeissR. B., ChristianM. C. New cisplatin analogs in development: a review // Drugs. 1993. Vol. 46. P. 360-377.
8. Overgaard J., Khan A. R. Selective enhancement of radiation responce in a C3H mammary carcinoma by cisplatin // Cancer Treat. Rep. 1981. Vol. 65. P. 501-503.
9. BartelinkH., KallmanR. F., Rapacchietta D., Hart G. A. M. Therapeutic enhancement in mice by clinically relevant dose and fractionation schedules of cis-diamminedichloroplatinum(II) and irradiation // Radiother. Oncol. 1985. Vol. 6. P. 61-74.
10. Kallman R. F., Bedarida G., Rapacchietta D. Experimental studies on shedule dependence in the treatment of cancer with combinations of chemotherapy and radiotherapy // Radiotherapy/chemotherapy interactions in cancer therapy / ed. by J. L. Meyer, J. M. Vaeth. Karger., 1992.
11. Yakovlev G. M., Vinogradsky O. V., Pekshev A. P. New medications // Express information. 1980. Vol. 10. P. 2-5.
12. Barnham K. J., DjuranM. I., Murdoch P. S. et al. l-Methionine increases the rate of reaction of 5-guanosine monophosphate with anticancer drug cisplatin: mixed-ligand adducts and reversible methionine binding // J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1995. P. 3721-3726.
13. Reedijk J. Why does cisplatin reach guanine-N7 with competing S-donor ligands available in the cell? // Chem. Rev. 1999. Vol. 99. P. 2499-2510.
14. ReedijkJ., Teuben J. M. Platinum-sulfur interactions involved in antitumor drugs, rescue agents, and biomolecules in cisplatin // Chemistry and Biochemistry of a Leading Anticancer Drug / ed. by B. Lippert. Zurich, 1999. P. 339-362.
15. Busby W. F. Jr., Ackermann J. M., Crespi C. L. Effect of methanol, ethanol, dimethyl sulfoxide, and acetonitrile on in vitro activities of cDNA-expressed human cytochromes P-450 // Drug Metab. and DISP. 1998. Vol. 27. P. 246-249.
16. Frisman E. V., Schagina L. V., Vorobyev V. I. A glass rotation viscometer // Biorheology. 1965. Vol. 2. P. 189-194.
17. ПтицынО. Б., Эйзнер Ю. Е. Гидродинамика растворов полимеров. IV. О влиянии объёмных эффектов на рассеяние света и константу трения макромолекул в растворе // Высоко-мол. соед. 1959. Т. 1. № 7. С. 966-977.
18. ПтицынО. Б., Эйзнер Ю. Е. Гидродинамика растворов полимеров. II. Гидродинамические свойства макромолекул в хороших растворителях // Журн. техн. физики. 1959. Т. 29. С. 1117-1134.
19. YamakawaH., FujiiM. Intrinsic viscosity of wormlike chains determination of the salt factor // Macromol. 1974. Vol. 7. № 1. P. 128-135.
20. Цветков В. Н., ЭскинВ. Е., Френкель С. Я. Структура макромолекул в растворах. М., 1964.
21. Касьяненко Н. А., Карымов М. А., Дьяченко С. А. и др. Исследование взаимодействия молекулы ДНК с координационными соединениями двухвалентной платины(П). Влияние природы и расположения лигандов в первой координационной сфере платины // Молекуляр. биология. 1995. Т. 29. С. 585-594.
22. КасьяненкоН. А., Фрисман Э. В., Валуева С. В. и др. Исследование взаимодействия молекулы ДНК с координационными соединениями двухвалентной платины^). Взаимодействие цис-ДДП с молекулой ДНК // Молекуляр. биология. 1995. Т. 29. С. 345.
23. Зарубина О. П. Влияние у-излучения на молекулярные параметры ДНК в водно-солевых растворах: дис. ... канд. физ.-мат. наук. Л., 1987.
24. Frisman E. V., Zarubina O. P. Effect of y-irradiation on the conformation of the native DNA molecule // Biophys. Chem. 1993. Vol. 46. P. 37-46.
25. Космотынская Ю. В. Влияние состава растворителя и гамма-облучения на взаимодействие молекулы ДНК с координационными соединениями платины: дис. ... канд. физ.-мат. наук. СПб., 2006.
26. КасьяненкоН. А., Богданов А. А., КосмотынскаяЮ. В, СпевакВ.Н. Комплексы ДНК с соединениями двухвалентной платины в присутствии диметилсульфоксида // Журн. физ. химии. 2002. Т. 76. № 11. С. 2043-2048.
27. ГазиевИ. Повреждение ДНК в клетках под действием ионизирующей радиации // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39. № 6. С. 630-638.
28. LimoliC., Kaplan M., Giedzinski E., Morgan W. F. Attenuation of radiation-induced genomic instability by free radical scavengers and cellular proliferation // Free Radical Biol. and Med. 2001. Vol. 31. N 1. P. 10-19.
29. Bardouki H., Barcellos da RosaM., Mihalopoulos N. et al. Kinetics and mechanism of the oxidation of dimethylsulfoxide (DMSO) and methanesulfinate (MSI-) by OH radicals in aqueous medium // Atmospheric Environment. 2002. Vol. 36. P. 4627-4634.
Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.
