CC BY
37
Р. Р. Рамазанов, Б. Ф. Щёголев, С. В. Сурма, Н. А. Касьяненко
ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ цис- И транс-ДДП С МОЛЕКУЛОЙ ДНК МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ И КВАНТОВОЙ ХИМИИ
Введение. Координационные соединения платины проявляют противоопухолевую активность, обусловленную их взаимодействием с молекулой ДНК. Наиболее известное и давно используемое соединение этого ряда - цис-диамминодихлорплатина (цис-ДДП) наряду с несомненными достоинствами (высокая эффективность, несомненные преимущества по сравнению с другими противоопухолевыми препаратами этого ряда) обладает побочными эффектами (токсичностью, неизбирательностью). Уменьшение токсичности достигается применением цис-ДДП в комбинации с другими лекарственными препаратами, однако кардинальное решение проблемы заключается в направленном синтезе новых соединений на основе платины, рутения и палладия, также способных образовывать координационные связи с молекулой ДНК.
В настоящее время накоплен огромный экспериментальный материал об условиях комплексообразования координационных соединений платины с молекулой ДНК in vitro и конформационных изменениях макромолекулы, индуцированных таким связыванием [1-6]. Вместе с тем, всё ещё продолжается дискуссия о молекулярном механизме противоопухолевого действия цис -ДДП и её аналогов. Не вызывает сомнений, что механизм противоопухолевой активности цис-ДДП основан на её связывании с ДНК. Для этого препарата характерно образование бидентатных связей с азотистыми основаниями макромолекулы при ярко выраженной избирательности к G-C парам, которые являются предпочтительными местами связывания большинства заряженных соединений, взаимодействующих в растворе с основаниями ДНК. В большой бороздке ДНК для катионных лигандов стерически доступным является атом азота N7 гуанина, который характеризуется повышенной электроотрицательностью. Расположенная рядом группа, содержащая атом кислорода Об, дает дополнительные преимущества для связывания по сравнению, например, с атомом азота N7 аденина, поскольку может образовывать дополнительную водородную связь с аминогруппой на цис-ДДП.
Комплексы платины(П) представляют собой плоские квадратные структуры с симметрией D2h. В координационной сфере цис -ДДП, как и у транс -ДДП, располагаются две молекулы NH3 и два иона Cl. Известны различные способы связывания этих соединений с ДНК. Для биологически значимых бидентатных комплексов с образованием двух координационных связей с ДНК возможно формирование однони-тевой или межнитевой сшивки между основаниями. В настоящее время нельзя однозначно говорить о преимуществах какого-либо способа связывания платины с макромолекулой. Реализация того или иного способа связывания, по-видимому, зависит от соотношения концентраций взаимодействующих веществ, условий среды и времени взаимодействия компонентов [7, 8]. По-видимому, преимущественным способом связывания, ответственным за биологический эффект, можно считать межните-вую сшивку, объясняющую наблюдаемое на опыте блокирование репликации ДНК. Изучение кинетики комплексообразования [8, 9] позволило предположить, что атака
© Р. Р. Рамазанов, Б. Ф. Щёголев, С. В. Сурма, Н. А. Касьяненко, 2010
комплексными соединениями платины позиции N7 гуанина является первичным химическим актом. При этом формируется одна координационная связь платины с основанием ДНК с потерей атома хлора или заместившей его молекулы воды из первой координационной сферы комплексообразующего иона. Принцип транс-влияния может в какой-то мере объяснить различие действия цис- и транс-ДДП в модельных системах и in vivo. Согласно этому принципу, лабильность атома хлора (или заместившей его молекулы воды) определяется инертностью лиганда, находящегося по отношению к нему в транс-положении. На второй стадии взаимодействия оставшийся лабильный атом хлора (или молекула воды) уходит, освобождая место второй входящей группе макромолекулы ДНК. Такая модель взаимодействия рассматриваемых соединений платины с ДНК и была принята при проведении молекулярного моделирования.
Моделирование подобных систем на основе экспериментальных данных может служить основанием не только для выбора оптимальной картины образования комплекса, но и являться средством для первичного анализа возможного механизма действия вновь синтезированных соединений, а также для постановки задачи при синтезе новых структур. Такой подход успешно использовался ранее для рассмотрения взаимодействия различных комплексов платины с молекулой ДНК [10, 11]. Используемое в данной работе сочетание метода молекулярной динамики с квантово-химическими расчётами рассматриваемых молекулярных систем позволяет получить соответствующую экспериментальным данным динамическую модель связывания координационных комплексов платины с ДНК.
Разработка методики моделирования изучаемых систем подразумевает два этапа исследования. Первый этап представляет собой получение структуры координационного соединения платины с необходимыми физико-химическими параметрами методом Хартри-Фока-Рутаана [12]. На втором этапе рассматривается конформационное пространство комплекса ДНК с координационным соединением в водном боксе с необходимым ионным окружением в модифицированном силовом поле методом молекулярной динамики [13].
Материалы и методы. Сравнение взаимодействия цис - и транс-ДДП с молекулой ДНК в рамках рассмотренной выше модели связывания разбивается на несколько задач. Это неэмпирические расчёты равновесной геометрии и электронного строения цис- и транс-ДДП с замещением атомов С1 на воду и расчёт распределения зарядовой плотности на атомах, определение всех силовых постоянных полученной системы по внутренним степеням свободы; построение модели двуспиральной ДНК; моделирование динамики образования монодентатных комплексов акватированных цис- и транс-ДДП с ДНК с целью установления механизма образования межнитевой сшивки с основаниями макромолекулы и, наконец, моделирование динамики образования бидентатных комплексов цис- и транс-ДДП с ДНК для исследования конформационного пространства системы.
Расчёт структуры цис- и транс-ДДП. Начальные координаты атомов рассматриваемых молекул были получены с помощью программы HyperChem v. 7.0 [14] в рамках полуэмпирических расчётов MNDO и PM3 [15, 16]. Полученные координаты атомов являлись стартовыми для неэмпирического расчёта равновесной геометрии этих молекул и распределения зарядовой плотности на атомах в программе PC GAMESS v. 7.1 [17]. Расчёт проводили в модифицированном базисе DH [18] для лёгких атомов и специальном ECP SBK [19] базисе для атома платины. Используемые базисные наборы позволяют получить плоскую структуру молекул цис- и транс-ДДП с межатомными
расстояниями, находящимися в хорошем согласии с данными рентгеноструктурного анализа [20]. Затем с использованием процедуры Hessian метода Хартри-Фока-Рутаана в программе PC GAMESS v. 7.1 определяли весь набор силовых постоянных молекул по внутренним степеням свободы. Топологические и параметрические файлы для цис- и транс-ДДП для дальнейшего использования в расчётах методом молекулярной динамики были получены с помощью пакета Xplo2d [21] с использованием силовых постоянных из квантово-химических расчётов.
Структура дуплекса ДНК. Модельная структура ДНК представляет собой дуплекс из 10 пар оснований (5’GTAT-GCATAC’3) с помещенным в центре GC участком, по которому происходит избирательное связывание платины. Дуплекс ДНК с помощью программы HyperChem помещался в кубический водный бокс, длина стороны которого составляла 36 A. Напротив каждой отрицательно заряженной фосфатной группы ДНК для компенсации заряда на расстоянии порядка 4 A размещался положительный противоион Na+. Молекулы воды, которые находились на расстоянии ближе, чем 2,6 A от дуплекса ДНК, удалялись. Параметрические данные для ДНК в водно-ионном окружении соответствуют стандартным значениям силового поля CHARMM [22].
Структура комплекса лиганда с ДНК. Методы молекулярной механики не дают возможности наблюдать в динамике образование ковалентных (или близких к ним по энергии координационных) связей, поэтому моделирование динамики ком-плексообразования соединений платины с ДНК выполняется только на конечной стадии. Как отмечалось выше, цис-ДДП акватируется в растворе и в такой форме вступает в реакцию с ДНК. В данной работе процесс акватации (замена иона хлора на молекулу воды в первой координационной сфере платины) не рассматривается, моделируется лишь конечная стадия связывания платины с группой N7 гуанина, расположенной в большой бороздке ДНК. Рассматривается два последовательных этапа взаимодействия: монодентатное и бидентатное связывание. В каждом случае связь Pt-N задаётся в структуре комплекса с использованием силовых постоянных, модифицированных на основании квантово-химических расчётов и данных исследований других авторов [10, 23]. Поскольку в данной работе прямой расчёт силовых постоянных для связи Pt-N7 не проводился, был проведён анализ подобных расчётов в литературе. Проводили также сравнение значений силовых постоянных Pt-N7 и Pt-O в акватированном комплексе цис- и транс-ДДП. Расчёт методом молекулярной механики проводился в программной системе Xplor v. 3. 1. [24]. При рассмотрении ДНК в водном боксе в окружении ионов Na+ крайние по цепочке фосфаты ДНК фиксировались, имитируя протяженность всего дуплекса. Далее следовал ряд этапов минимизации энергии системы до достижения локального минимума полной энергии. После 1000 шагов оптимизации структуры водного бокса при фиксированных атомах натрия и дуплекса осуществляли 1000 шагов оптимизации структуры ДНК при фиксированных молекулах воды и натрия в боксе. Заключительные 5000 шагов оптимизации всей системы осуществляли без фиксированных элементов. Далее проводили процедуру молекулярной динамики по алгоритму Verlet [25] с шагом At = 1 фс на время t =10 пс при температуре от 273 до 310 К. Подобный ряд вычислений проводили для цис- и транс-ДДП на двух этапах взаимодействия согласно модели последовательного образования моно- и бидентатных связей с атомами N7 гуанинов.
Результаты и обсуждение. В результате неэмпирических расчётов были получены равновесные структуры и определены параметры электронного строения молекул цис-ДДП и транс-ДДП с замещёнными атомами Cl на молекулы воды.
Рис. 1. Строение цис-ДПП (а) и транс-ДДП (б) с замещением атомов хлора на молекулы воды
Рассматриваемые соединения имеют плоскую структуру с симметрией (рис. 1), что согласуется с имеющимися представлениями о геометрии таких комплексов. В табл. 1 представлено полученное в расчётах распределение зарядовой плотности на атомах соединений платины, рассчитанное по Маллике-ну [26]. Расчёт силовых постоянных для валентных связей и углов проводили по внутренним степеням свободы молекул цис- и транс-ДДП, находящихся в газовой фазе (данные для цис-ДДП приведены в табл. 2). Для 15 атомов цис-ДДП (или транс-ДДП) необходимо было рассчитать 39 внутренних координат. Полученные значения укладываются в погрешность порядка 10 % при сравнении с результатами расчётных работ других исследователей [10, 23].
Таблица 2
Расчёт силовых постоянных по внутренним валентным степеням свободы для цис-ДДП
№ Степень свободы Значение силовой постоянной Длина связи, À Угол, град
ккал/моль-À2 кка л/моль- рад2
1 Р^1 310 - 2,073 -
2 Р^5 310 - 2,073 -
3 Рі-ОІ 200 - 2,130 -
4 Р1-02 200 - 2,130 -
5 N1-116 800 - 1,011 -
6 N1-117 800 - 1,011 -
7 N1-118 800 - 1,011 -
8 N5-119 800 - 1,011 -
9 N5-1110 800 - 1,011 -
10 N5-1111 800 - 1,011 -
11 01-Н12 1000 - 0,956 -
Таблица 1
Распределение зарядовой плотности на атомах цис- и транс -ДДП
Атом Заряд атома
Цис-ДДП Транс-ДДП
Pt 1,012 1,079
N1 -1,053 -1,078
N5 -1,053 -1,078
01 -0,945 -0,945
02 -0,945 -0,945
Н6 0,462 0,454
Н7 0,462 0,454
Н8 0,462 0,454
Н9 0,462 0,454
НЮ 0,462 0,454
НИ 0,551 0,454
Н12 0,551 0,557
Н13 0,551 0,557
Н14 0,551 0,557
Н15 0,551 0,557
№ Степень свободы Значение силовой постоянной Длина связи, А Угол, град
ккал/моль-А2 кка л/моль- рад 2
12 01-Н13 1000 - 0,956 -
13 02-Н14 1000 - 0,956 -
14 02-Н14 1000 - 0,956 -
15 - 20 - 92
16 Ш-Р^01 - 15 - 180
17 Ш-02-Р1 - 70 - 45
18 р^т-не - 10 - 110
19 р^т-т - 10 - 111
20 р^т-ш - 10 - 110
21 Р1-Ш-Н9 - 10 - 110
22 Р1-Ш-Н10 - 10 - 111
23 Р1-Ш-Н11 - 10 - 111
24 Р1-01-Н12 - 10 - 124
25 Р1-01-Н13 - 10 - 124
26 Р1-02-Н14 - 10 - 124
27 Р1-02-Н15 - 10 - 124
28 Ш-Ш-Р^СЛ - 0,49 - -175
29 Р^-Ш-РТ-02 - 7,6 - -180
30 ш-рт-т-ш - 10 - 180
31 ш-рт-т-ш - 10 - -60
32 ш-рт-т-ш - 10 - 60
33 т-рт-ш-ню - 10 - -60
34 т-рт-ш-ню - 10 - -180
35 N1-PT-N5-H10 - 10 - 60
36 Nl-PT-01-H12 - 1,16 - 75
37 Nl-PT-01-H12 - 1,16 - -78
38 ]Ч1-РТ-02-Н14 - 1,16 - 102
39 ]Ч1-РТ-02-Н14 - 1,16 - -102
На первом этапе расчётов динамики молекулярной системы в рамках выбранной модели рассматривали образование монодентат-ной связи платины с ДНК. После ряда этапов минимизации по энергии проводили моделирование молекулярной динамики, и система в водно-ионном окружении релаксиро-вала порядка £ = 7 + 8 пс, после чего достигала равновесного состояния. Было показано, что в среднем на протяжении всего времени моделирования необходимое для образования второй координационной связи платины с ДНК расстояние между локализованным в большой бороздке атомом платины и второй входящей группой ДНК (N7 на противолежащем гуанине) значительно превышает длину связи Р^7 (г = 2,07 А), полученную в квантово-химическом расчёте (рис. 2). Это
Рис. 2. Монодентатный комплекс цис-ДДП с фрагментом дуплекса в большой бороздке ДНК
Рис. 3. Зависимость расстояния К между
и противолежащим атомом N7 гуанина ДНК от времени при моноден-татном связывании для цис-ДДП (а) и для транс-ДДП (б):
линия, параллельная оси времени, даёт расстояние Р^7, по данным квантовохимических расчётов 2,07 А
Я, А
г, пс
наблюдается для транс - и для цис -ДДП на протяжении £ = 10 пс (рис. 3). Возможно, что за счёт внутренних сил отталкивания фосфатов при наличии водородных связей и стэкинг-взаимодействий между азотистыми основаниями создается барьер для образования второй координационной связи платины с противолежащим гуанином по
позиции N7.
На втором этапе расчётов проводилось моделирование образования биден-татного комплекса ДНК с цис- и транс-ДДП. Для получения комплекса из координационной сферы цис- и транс-ДДП удаляли молекулы воды, которые заменяли связями с группами N7 соседних гуанинов разных нитей ДНК (рис. 4). Далее проводили ряд этапов минимизации по полной потенциальной энергии системы, как уже было описано выше. Необходимо отметить, что начальная структура комплекса ДНК - платина имеет значительное напряжение в области связей N7-^, поскольку при начальном расстоянии между атомами порядка 3,8 А, квантово-химически рассчитанное равновесное расстояние 2,07 А. Это обстоятельство обусловливало трудность сходимости решения в процессе проведения оптимизации системы по энергии и в дальнейшем расчёте молекулярной динамики. Для решения этой проблемы в промежутке времени £ = 1,5 + 2 пс использовался алгоритм динамики Ланжевена [27] с введением диапазона значений силы трения атомов (коэффициент трения = 10 + + 100 с целью преодоления избыточного
Рис. 4. Связывание цис-ДДП с двуни-тевой спиралью ДНК в окончательной фазе моделирования
Рис. 5. Зависимости расстояния К между и N7 для бидентатного комплекса ДНК--■цис-ДДП от времени моделирования:
линия с точками — связь по первой цепочке дуплекса ДНК, сплошная линия — связь по второй цепочке дуплекса ДНК
локального напряжения в системе посредством диссипации энергии. В остальное время моделирование проводилось без введения сил диссипации. На рис. 5 видно, что система пришла в состояние равновесия за время £ = 2,1 + 2, 3 пс, когда амплитуда колебания значений расстояния N7-^ по двум цепочкам дуплекса ДНК достигла стационарного режима в окрестности равновестного значения 2,07 А.
В результате расчётов было показано значительное конформационное изменение молекулы ДНК при связывании с цис-ДДП и разрушение системы в целом при связывнии с транс-ДДП. Связывание цис-ДДП межнитевым способом обуславливает локальное раскручивание двойной спирали макромолекулы в области GC пар с разрывом водородных связей, противолежащие цитозины, не связанные водородными связями с комплементарными гуанинами, выходят из большой бороздки наружу. Транс-ДДП при подобных условиях проведения численного эксперимента нарушает структуру комплекса и делает двойную спираль ДНК нестабильной, что хорошо согласуется с экспериментальными данными [8, 28].
По-видимому, процесс разрушения комплекса в случае с транс-ДДП связан со сте-реохимической невозможностью установить связь межнитевым способом, что позволило бы системе в процессе минимизации «спуститься» в потенциальную энергетическую яму. Этот результат коррелирует с отсутствием противоопухолевой активности у транс-ДДП, если считать межнитевой способ связывания ответственным за биологический эффект. Отмечая невозможность образования второй связи Р1-^ при моделировании монодентатного связывания и принимая во внимание устойчивое состояние системы бидентатного комплекса ДНК с цис-ДДП, можно заключить, что системе необходимо затратить определённое количество внешней энергии на преодоление существующего энергетического барьера. Такая возможность может быть реализована либо в случае локального нарушения двунитевой структуры В-формы ДНК, предшествующего процессу взаимодействия с цис-ДДП, либо при изменении ионного
окружения ДНК в растворе. Кроме того, поступление энергии может быть обеспечено ферментативной активностью на ДНК, если иметь в виду внутриклеточное взаимодействие.
Литература
1. Huang H., Zhu L., Reid B. R. et al. Solution structure of a cisplatin-induced dna interstrand cross-link // Science. 1995. Vol. 270. N 5243. P. 1842-1845.
2. Bose R. N. Biomolecular targets for platinum antitumor drugs // Mini Rev. Med. Chem. 2002. Vol. 2. N 2. P. 103-111.
3. Kelland L. R., Murrer B. A., Abel G. et al. Ammine/amine platinum(IV) dicarboxylates: a novel class of platinum complex exhibiting selective cytotoxicity to intrinsically cisplatin-resistant human ovarian carcinoma cell lines // Cancer Res. 1992. Vol. 52. N 4. P. 822-828.
4. Fuertes M. A., Castilla J., Alonso C., Pirez J. M. Novel concepts in the development of platinum antitumor drugs // Curr. Med. Chem. Anticancer Agents. 2002. Vol. 2. N 4. P. 539-551.
5. Wang D., Lippard S. J. Cellular processing of platinum anticancer drugs // Nat. Rev. Drug. Discov. 2005. Vol. 4. N 4. P. 307-320.
6. Reedijk J. New clues for platinum antitumor chemistry: kinetically controlled metal binding to DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003. Vol. 100. N 7. P. 3611-3616.
7. Касьяненко Н. А., Фрисман Э. В., Валуева С. В. и др. Исследование взаимодействия молекулы ДНК с координационными соединениями двухвалентной платины. I. Взаимодействие цис-ДДП с молекулой ДНК // Молекуляр. биология. 1995. T. 29. C. 345-353.
8. Касьяненко Н. А., Карымов М. А., Дьяченко С. А. и др. Исследование взаимодействия молекулы ДНК с координационными соединениями двухвалентной платины. II. Влияние природы и расположения лигандов в первой координациолнной сфере платины // Молекуляр. биология. 1995. T. 29. C. 585-594.
9. Kostova I. Platinum complexes as anticancer agents // Recent Pat. Anticancer Drug Discov. 2006. Vol. 1. N 1. P. 1-22.
10. Scheeff E. D., Briggs J. M., Howell S. B. Molecular modeling of the intrastrand guanine-guanine DNA adducts produced by cisplatin and oxaliplatin // Mol. Pharmacol. 1999. Vol. 56. N 3. P. 633-643.
11. Duan Y., Wilkosz P., Crowley M., Rosenberg J. M. Molecular dynamics simulation study of DNA dodecamer d(CGCGAATTCGCG) in solution: conformation and hydration // J. Mol. Biol.
1997. Vol. 272. N 4. P. 553-572.
12. Клементи Э. Электронная структура ароматических соединений // Журн. структ. химии. 1969. T. 19. № 2. C. 354-399.
13. Alder B. J., Wainwright T. E. Studies in molecular dynamics. I. General method // J. Chem. Phys. 1959. Vol. 31. N 2. P. 459-466.
14. HyperChem. Release 7.0 for Windows, Molecular Modeling System. 2002.
15. Reynolds C. H., Dewar M. J. S. An Improved Set of MNDO Parameters for Sulfur // J. Comp. Chem. 1986. Vol. 2. P. 140-157.
16. Stewart J. J. P. Optimization of parameters for semiempirical methods. III. Extension of PM3 to Be, Mg, Zn, Ga, Ge, As, Se, Cd, In, Sn, Sb, Te, Hg, Tl, Pb, and Bi // J. Comp. Chem.
1991. Vol. 12. N 3. P. 320-341.
17. Granovsky A. A. PC GAMESS/Firefly version 7.1.F. // http://classic.chem.msu.su/gran/ /gamess/index.htm.
18. Hay P. J., Dunning T. H. // In Modern Theoretical Chemistry / ed. by H. F. Schaefer, New-York: Plenum, 1976. P. 1-28.
19. Krauss J., Stevens W., Basch H. Compact Effective Potentials and Efficient Shared-Exponent Basis-Sets for the 1ST-row and 2ND-row Atoms // J. Chem. Phys. 1984. Vol. 81. P. 6026-6033.
20. Mulburn G. H. W., Truter M. R. The crystal structures of cis- and trans-dichlorodiammi-
neplatinum(II) // J. Chem. Soc. 1966. Vol. A. P. 1609-1611.
21. Kleywegt G. J., Jones T. A. Databases in protein crystallography // Acta Crystallogr. (D).
1998. Vol. 54. P. 1119-1131.
22. MacKerell A. D., Banavali N., Foloppe N. Development and current status of the CHARMM
force field for nucleic acids // Biopolymers. 2000. Vol. 56. N 4. P. 257-265.
23. Sharma S., Peng Gong, Temple B. et al. Molecular dynamic simulations of cisplatin- and
oxaliplatin-d(GG) intrastand cross-links reveal differences in their conformational dynamics // J. Mol. Biol. 2007. Vol. 373. N 5. P. 1123-1140.
24. Brunger A. T. X-PLOR. A System for X-ray crystallography and NMR. Yale: Univ. Press,
1992.
25. Frenkel D. Understanding molecular simulation: from algorithms to applications // Computational science series / ed. by D. Frenkel, B. Smit. San Diego: Academic Press, 2002. P. 638.
26. Mulliken R. S. Electronic population analysis on LCAO-MO molecular wave function I // J. Chem. Phys. 1955. Vol. 23. P. 1833-1840.
27. Schlick T. Molecular modeling and simulation: an interdisciplinary guide // Interdisciplinary appl. mathematics. New-York et al.: Springer, 2002. Vol. 21. P. 435-438.
28. Eastman A., Barry M. A. Interaction of trans-diamminedichloroplatinum(II) with DNA: formation of monofunctional adducts and their reaction with glutathione // Biochemistry. 1987. Vol. 26. N 12. P. 3303-3307.
Статья поступила в редакцию 22 декабря 2009 г.
