CC BY
52
ФИЗИКА
УДК 547.963.3
Д. С. Ершов, И. М. Зырянова, С. В. Пастон, Н. А. Касьяненко
ИЗУЧЕНИЕ РАДИОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ КАТЕХИНА ПРИ ГАММА- И УФ-ОБЛУЧЕНИИ РАСТВОРОВ ДНК
Одной из важных задач радиобиологии является поиск веществ, способных эффективно защищать молекулу ДНК от радиационных повреждений. Известно, что био-флавоноиды, содержащиеся во многих растениях и входящие в состав чая, кофе, винограда и т. д., проявляют антиоксидантные свойства [1,2], а также способны подавлять развитие злокачественных новообразований [3,4]. Присутствие биофлавоноидов в растворе приводит к снижению выхода одно- и двунитевых разрывов и разрушений азотистых оснований при гамма-облучении ДНК [5], а также к уменьшению повреждающего действия УФ-облучения [6]. Важным преимуществом этих веществ является их нетоксичность, более того, они обладают рядом полезных свойств: введение в диету биофлавоноидов способствует лучшему усвоению витамина С, увеличению прочности стенок кровеносных сосудов, нормализации холестеринового обмена [7, 8]. В настоящей работе исследуются радиозащитные свойства одного из таких соединений -(+)-катехина.
Механизмы воздействия ионизирующего и неионизирующего излучений на биомакромолекулы различны. В первом случае реализуется в основном косвенное действие за счет реакций молекулы-мишени с продуктами радиолиза растворителя (воды), а во втором имеет место прямое действие - поглощение квантов хромофорными группами макромолекулы [9]. В настоящей работе изучается влияние ионизирующего (гам-ма-излучения) и неионизирующего (УФ с длиной волны X = 254 нм) излучения на молекулу ДНК в водно-солевых растворах, содержащих различные концентрации (+)-катехина, причем длина волны УФ-излучения находится вблизи максимумов поглощения ДНК (260 нм) и катехина (280 нм), что является условием резонансного поглощения. Несмотря на разные механизмы, могут наблюдаться сходные повреждения в молекуле ДНК под действием ионизирующей и неионизирующей радиации. Известно, что при гамма-облучении дозами до 30 Гр и на несколько порядков большими дозами УФ-облучения растворов ДНК умеренной ионной силы происходит уменьшение удельного объема макромолекулы без изменения ее термодинамической жесткости и вторичной структуры [10-12]. Таким образом, определяя характеристическую вязкость ДНК, пропорциональную ее удельному объему, можно фиксировать повреждающее действие излучения.
© Д. С. Ершов, И. М. Зырянова, С. В. Пастон, Н. А. Касьяненко, 2006
Материалы и методика эксперимента. Использовали тимусную ДНК фирмы «Sigma» молекулярной массы М-11,4 МДа, которую определяли по значению характеристической вязкости [т]] в растворе 0,15 моль/л NaCl [13]. Концентрацию ДНК в растворе (С) устанавливали по методу А. С. Спирина [14]. Оптическое поглощение растворов ДНК измеряли на спектрофотометре СФ-26 (Россия). Для всех исследованных систем оценивали молярный коэффициент эк-стинкции е2Ю(Р). Использовали растворы, для которых величина е260(Р) соответствовала нативному состоянию ДНК (е260(Р) < 6900).
Растворы ДНК подвергали воздействию у-излучения 137Cs в аэробных условиях на установке ЛМБ-у-1 в Институте цитологии РАН (С.-Петербург), Мощность дозы составляла 2,86 крад/мин. Концентрация ДНК в облучаемых растворах - 0,01 г/дл.
Источником УФ-излучения служила лампа ДРБ-8 мощностью 8 Вт. Растворы ДНК облучали в кварцевых кюветах толщиной 0,2 см. Концентрация ДНК во всех облучаемых растворах составляла с “ 0,01 г/дл. Интенсивность УФ-излучения на длине волны 254 нм составляла 3,4-104 ДжДкгс).
Вискозиметрия. Относительные вязкости Г|г растворов ДНК разной концентрации измеряли в модифицированном низкбградиентном магнитном ротационном вискозиметре [15] при разных градиентах скорости потока g и экстраполировали к g - 0. Значение характеристической вязкости [г|] находили экстраполяцией по формуле
Согласно уравнению Флори [16], величина [г|] связана с параметрами макромолекулы:
фицие инейного набухания макромолекулы в хорошем растворителе, Ф - коэффициент Флори, Ь - гидродинамическая длина макромолекулы, А - длина статистического сегмента, М -молекулярная масса ДНК. Таким образом, [г)] определяется как ближними взаимодействиями в цепи ДНК, т. е. жесткостью макромолекулы (А), так и дальними - ее полиэлектролитным набуханием.
Двойное лучепреломление в потоке (ДЛП). Зависимость величины ДЛП Ап растворов ДНК от градиента скорости потока g измеряли на оптической установке с эллиптическим компенсатором и фотоэлектрической регистрацией [17] в титановом динамооптиметре с внутренним ротором. Динамооптическая постоянная определяется по формуле
в которой г|0 - вязкость растворителя. Независимо от модельных представлений отношение [и]/[л] пропорционально оптической анизотропии макромолекулы, которая складывается из собственной анизотропии и анизотропии формы, возникающей в случае асимметричных частиц с показателем преломления, отличным от показателя преломления растворителя. В работах [18, 19] показано, что в отсутствие эффекта формы удельная анизотропия раствора конечной концентрации равна отношению [и]/[г|]. Последнее, согласно формуле Куна, пропорционально оптической анизотропии сегмента (аг - #2):
ч
/
М
М
(1)
В (1)
У1
- среднеквадратичное расстояние между концами невозмущенной цепи, а - коэф-
/
!?0 С
ч
/
(Ап/ё)^0_[п]_ 4п (п]+ 2)2 _
(Пг-1)^0 [Т7] 45^Г п5 1
Здесь £ - постоянная Больцмана, Г - абсолютная температура, пг - показатель преломления растворителя, оптическая анизотропия сегмента
(ог1-ог2) = (ог|-а1)5,
где (а1 - а 1) - разность поляризуемостей мономерного остатка в направлении оси спирали ДНК и перпендикулярно к ней; 5 - число мономерных остатков в статистическом сегменте, которое можно выразить через длину сегмента А и длину мономерного остатка /: 5 = А /1. Соотношение (2) справедливо для ДНК, так как в растворах ДНК эффект макроформы пренебрежимо мал в сравнении с собственной анизотропией макромолекулы [20].
Результаты и их обсуждение. Исследование необлученных растворов ДНК в присутствии (+)-катехина показало, что изучаемое вещество не образует устойчивых комплексов с макромолекулой. Как показал опыт, спектральные свойства ДНК в растворе не меняются при добавлении катехина (спектр водно-солевых растворов ДНК, содержащих катехин, являлся суммой спектров ДНК и катехина при тех же концентрациях) (рис. 1). Полосы поглощения ДНК и катехина перекрываются, максимум поглощения катехина приходится на 280 нм.
Ох
Рис. 1. Спектры поглощения ДНК (С = 0,002%) (1), (+)-катехина (Сгат= 6-10"5 М) (2) и раствора, содержащего ДНК и катехин тех же концентраций (3).
Квадратами показана сумма спектров 1 и 2.
Была определена относительная вязкость растворов ДНК с разным содержанием (+)-катехина. Опыт показал (рис. 2, кривая 1), что относительная вязкость растворов ДНК не меняется при концентрациях катехина в растворе до 2-10-3 М, т. е. при соотношении около 13 молекул катехина на пару оснований ДНК (Сднк = 0,01 г/дл = 1,5-10 4 М (Ьр)). Вязкость растворителя при этом не зависела от концентрации катехина и практически совпадала с вязкостью воды. Характеристическая вязкость ДНК, измеренная в растворе с Ст = 1,3-10"3 М (в качестве растворителя использовался водно-солевой раствор катехина такой же концентрации) совпала со значением, полученным в растворе в отсутствие катехина. Приведенные данные позволяют предположить, что катехин не взаимодействует с молекулой ДНК в растворе. Отметим, что в литературе существуют данные, согласно которым (+)-катехин не интеркалирует в двойную спираль ДНК [21].
ЛуД / ЛудО
Рис. 2. Относительное изменение приведенной вязкости раствора ДНК (Сднк“ 0,005 г/дл) при варьировании концентрации катехина в растворе.
Системы: 1 - необлученные, 2 - гамма-облученные дозой 10 Гр,
3 - УФ-облученные дозой 6,0-107 Дж/кг системы.
Для исследования радиозащитных свойств катехина измеряли относительное изменение величины приведенной вязкости Т1пр = ——растворов ДНК с разными концентрациями катехина при гамма-облучении дозой 10 Гр (рис. 2, кривая 2) и УФ-облуче-нии дозой 6,0-107 Дж/кг (рис. 2, кривая 3). Видно, что присутствие катехина в облучаемом растворе уменьшает радиационный эффект как гамма-, так и УФ-облучения.
Более надежно фиксировать радиационное повреждение ДНК в растворе можно путем измерения ее характеристической вязкости, пропорциональной удельному объему макромолекулы. Ранее было показано, что при гамма-облучении дозами до 30 Гр и
УФ-облучении дозами до 108 Дж/кг растворов ДНК умеренной ионной силы, происходит уменьшение удельного объема макромолекулы без изменения ее термодинамической жесткости и вторичной структуры [10-12]. Полученные в работе дозовые зависимости характеристической вязкости ДНК в водных растворах и в присутствии (+)-катехина позволяют заключить, что последний обладает способностью защищать молекулу ДНК от воздействия как гамма-, так и УФ-излучения (табл. 1, рис. 3). Однако полной защиты ДНК от радиационного поражения при данных условиях эксперимента не наблюдается.
Таблица 1. Относительное изменение характеристической вязкости ДНК
при гамма-облучении
Доза у-облучения, [Л]/[Л10±0,05 [Л]/[л]0±0,05
Гр (1 О (С»,-1,3-10-» М)
0 1 1,00
10 0,24 0,61
30 0,08 0,50
Примечание. [л]0 - характеристическая вязкость интактной, [т|] - облученной макромолекулы.
/МО-7, Дж/кг
Рис. 3. Дозовая зависимость характеристической вязкости ДНК при УФ-облучении в отсутствие (1) ив присутствии (2) катехина в растворе (Сгат = 1,3-10_3 М).
Следует отметить, что заметные изменения в спектре поглощения ДНК при облучении начинают проявляться при существенно больших дозах, чем в случае изменений, фиксируемых вискозиметрически [11,22,23] (рис. 4, = 0). Проведенный опыт пока-
зывает, что уже при С^ = МО-4 М молярный коэффициент экстинкции (е260(Р)) ДНК не претерпевает изменений при гамма-облучении дозами вплоть до 200 Гр (рис. 4, кривая 2). Отметим, что УФ-облучение при используемой в работе интенсивности источ-
▲ 1 92 а3 Доза, Гр
Рис. 4. Зависимость коэффициента молярной экстинкции ДНК от дозы гамма-облучения.
1-С =0 \2-С =Ы0-4М ;3-С = 1,3-Ю'3 М.
кат ’ кат 1 кат '
ника не приводило к заметным изменениям спектральных свойств ДНК при облучении дозами до МО9 Дж/кг. Сравнение динамического двойного лучепреломления в растворах необлученной ДНК и ДНК, гамма-облученной дозой 30 Гр, показало, что присутствие катехина в растворе в обоих случаях не вызывает изменений оптической анизотропии макромолекулы (табл. 2). Эти результаты позволяют заключить, что конформационные изменения молекулы ДНК при дозах облучения до 30 Гр не затрагивают ее равновесную жесткость и вторичную структуру, а вызваны только изменением дальних взаимодействий в макромолекуле.
Таблица 2. Оптическая анизотропия ДНК в необлученных и гамма-облученных растворах
Доза уоблучения, Гр с ,м кат’ <Ди/Я>- 1/(01,- 1)Л0)-Ю8, СМ'С2/Г
0 22 ± 2
0
1,3-10~3 20 + 2
0 22 ±2
30
1,3-Ю'3 19 + 2
к
Ershov D. S., Zyrianova I. М., Paston S. V, Kasyanenko N. A. Investigation of radioprotective properties of cathechin at the gamma- and UV-irradiation of DNA solutions.
The result of gamma- and UV-irradiation on DNA in diluted solution of ionic strenghth ц = 0,003 M NaCl with different concentrations of (+)-cathehin is studied. It is shown that under the experimental conditions cathehin cannot form stable complexes with DNA in solution. Dose dependences of DNA intrinsic viscosity in water and water-cathehin solutions obtained in the work permit to make a conclusion that (+)-cathehin protects DNA from gamma- and UV-radiation. However the complete DNA radioprotection is not observed even at the small dose of 10 Gy. The DNA absorption spectra is not changed after gamma-irradiation in doses till 200 Gy at the cathehin concentration 10~4 M. DNA conformation alterations observed at the doses till 30 Gy caused only by changes in long-range interactions in macromolecule, not in its equilibrium rigidity or secondary structure.
Литература
1. Kashima M. // Chem. Pharm. Bull. 1999. Vol. 47 (2). P. 279—283. 2. Mackenzie G. G., Carrasquedo F., Delfino G.M. et al. // The FASEB Journal. 2004. Vol. 18. P. 167—169. 3. Yanaga H., Fudjii H., Koga T. et al. //Intern. J. of Mol. Medicine. 2002. Vol. 10. P. 311—315. 4. Deguchi H., FudjiiH., Nakagawa Sh. et al. // Intern. J. of Oncology. 2002. Vol. 21. P. 1301—1305. 5. Anderson R., Fisher L., Hara Y. et al. // Carcinogenesis. 2001. Vol. 22, N 8. P. 1189—1193.6. Ottaviani J., Carrasquedo F., Keen C. etal.//Archives of Biochemistry and Biophysics. 2002. Vol. 406. P. 203—208.7. Запрометов М. H. Основы биохимии фенольных соединений. М., 1974. 8. Запрометов М. Н. Биохимия катехинов. М., 1964. 9. Кудряшов Ю. Б. Радиационная биофизика. М., 2004.10. Фрисман Э. В., Зарубина О. П. //Докл. АН СССР. 1988. Т. 298, № 2. С. 491-494. 11. Frisman Е. V., Zarubina О. Р. // Biophys. Chem. 1993. Vol. 46. P. 37—46. 12. Пастон С. В., Зырянова И. М. // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 4: Физика, химия. 2000. Вып. 1 (№ 4). С. 50—59. 13. EignerJ., Doty P. // J. Mol. Biology. 1965. Vol. 12. P. 549— 580. 14. Спирин А. С. // Биохимия. 1958. T. 23. C. 656—662. 15. Фрисман Э. В., Щагина JI. В., Воробьев В. И. // Коллоидн. журн. 1965. Т. 27. С. 130—133. 16. Flory P. Principles of the polymer chemistry. New York, 1953.17. Цветков В. H., Эскин В. Е., Френкель С. Я. Структура макромолекул в растворе. М., 1964. 18. Фрисман Э. В., Сибилева М. А., Красноперова А. В. // Высокомол. соединения. 1959. Т. 1. С. 597—606. 19. PeterlinA. А. Ц J. Polym. Sci. 1954. Vol. 12. P. 45-51. 20, Фрисман Э. В., Воробьев В. И., Щагина Л. В. // Высокомол. соединения. 1964. Т. 29. С. 884-290. 21. Webb М., EbelerS. // Biochem. J. 2004. Vol. 384. P. 527-541.22. RafiA. A., WheelerC. M. // Int. J. Radiat. Biology. 1973. Vol. 24, N 3. P. 321—323. 23. GeorgakilasA.G., Sakelliou L., SiderisE. G. etal. // Rad. Res. 1998. Vol. 150. P. 488-491.
Статья принята к печати 23 ноября 2006 г.
