CC BY
7
в кардиальную дифференцировку. После окончания протокола дифференцировки кардиомиоциты были рассажены в редкой плотности, на 34-36 день клетки фиксировались и окрашивались антителами к маркёрам кардиомиоцитов. Площадь клеток определяли в результате анализа изображений с помощью пакета ImageJ. Полученные данные статистически обрабатывали с помощью пакета программ R.
В результате данной работы путём направленной дифференцировки ИПСК в кардиомиоциты была получена линия клеток с мутацией p.Asn515del в гене MYBPC3 с достоверным увеличением площади кардиомиоцитов. Данная линия в дальнейшем может быть использована как тканевая модель гипертрофической кардиомиопатии in vitro. Работа поддержана грантом РНФ № 22-15-00271.
СИСТЕМА ЛАЗЕРНОЙ ТРАНСФЕКЦИИ КЛЕТОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЛОЕВ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА ДЛЯ КОНТРОЛИРУЕМОЙ ДОСТАВКИ ГЕНОВ
ТЕПылаев1, 2, Е.С. Авдеева1, 2, Н.Г. Хлебцов2, 3
1 ФГБОУ ВО Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Минздрава России, Саратов, Россия
2 Институт биохимии и физиологии растений
и микроорганизмов — обособленное структурное подразделение ФИЦ СНЦ РАН, Саратов, Россия
3 ФГБОУ ВО Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов, Россия
e-mail: pylaev.te@staff.sgmu.ru
Ключевые слова: трансфекция, клеточные культуры, золотые нанозвезды, оптопорация, генотерапия, внутриклеточная доставка.
Разработка надежных технологий для получения биомедицинских клеточных продуктов с репрограммиро-ванным геномом является одной из приоритетных задач современной биоинженерии. Активно идут разработки новых и исследования существующих систем доставки [1] на основе различных носителей и/или с применением физического воздействия [2]. Тем не менее, до сих пор не существует технологии, одновременно безопасной и совместимой с различными клеточными типами и доставляемыми агентами. Отдельно следует упомянуть о невозможности масштабирования и автоматизирования некоторых существующих систем, что крайне важно на этапах продвижения в реальную практическую плоскость, в том числе для задач регенеративной медицины.
Мы предлагаем новую технологию плазмон-индуциро-ванной оптопорации клеток для эффективной и безопасной доставки целевых генов, совместимую с различными типами клеток [3]. Принцип работы системы состоит в кратковременном увеличении проницаемости мембран клеток, выращенных на монослоях золотых наночастиц (ЗНЧ), за счет кратковременного локального нагрева частиц, индуцируемого лазерным облучением резонансной длины волны. Монослои ЗНЧ получены непосредственно на культуральном пластике (планшетах либо чашках Петри), что является прекрасным биосовместимым субстратом для адгезионных клеток [4]. Главным преимуществом системы является возможность тонкой настройки под индивидуальные особенности клеток и доставляемых агентов путем регулировки режимов облучения и параметров монослоев ЗНЧ. Мы протестировали возможности системы для целого ряда контрастных по свойствам
клеток млекопитающих (HeLa, A431, CHO, RAW 264.7) и доставляемых агентов широкого размерного диапазона: от молекулярных красителей (пропидий иодид, 700 Да), контрольных плазмид (3-10 т.п.н.) до меченых декстранов с массой от 10 до 100 кДа. Возможность настройки режимов облучения на используемой импульсной 1064-нм на-носекундной лазерной установке с узкосфокусированным пучком позволила получить обнадеживающие результаты для всех протестированных линий в сравнении с коммерческими агентами для липофекции.
Таким образом, предлагаемая система является крайне перспективным вариантом трансфекции клеток in vitro, и может быть адаптирована для сложных объектов, таких как первичные и стволовые клетки. Кроме того, возможность масштабирования открывает перспективы для практического внедрения нашей технологии плаз-монной оптопорации для решения задач персонифицированной медицины и клеточной биоинженерии.
Литература:
1. Stewart M.P., Langer R., Jensen K.F. Chem. Rev. 2018. V. 118. P. 7409.
2. Pylaev T.E., Avdeeva E.S., Khlebtsov N.G. J. Innov. Opt. Health Sci. 2021. V. 14. Art. 2130003.
3. Pylaev T., Vanzha E., Avdeeva E. et al. J. Biophoton. 2019. V. 12. Art. e201800166.
4. Pylaev T.E., Efremov Yu.M., Avdeeva E.S. et al. ACS Appl. Nano Mater. 2021 V. 4. P. 13206.
ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НОВОГО БИЦИСТРОННОГО ГЕНОТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ПЛАЗМИДЫ С ГЕНАМИ VEGF165 И HGF ЧЕЛОВЕКА
А.В. Раднаева2, П.И. Макаревич2, М.А. Болдырева1, Е.В. Парфёнова1, 2
1 Институт экспериментальной кардиологии, НМИЦ Кардиологии Минздрава России им. Е.И. Чазова, Москва, Россия
2 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: arina.radnaeva05@gmail.com
Ключевые слова: генная терапия, критическая ишемия нижней конечности, бицистронный плазмидный вектор, ан-гиогенез, миогенез, нейрогенез, VEGF, HGF
В последние годы для лечения критической ишемии нижней конечности (КИНК) наиболее перспективным направлением является терапевтический ангиогенез с применением методов генной терапии. Среди векторных систем преимуществом с точки зрения безопасности обладают плазмиды. Представленная в данном исследовании бицистронная плазмида pHGF/VEGF позволяет одновременно доставлять гены двух ангиогенных факторов роста (АФР), комбинация которых на данных момент является одной из самых эффективных [1]. Благодаря наличию в составе плазмиды двух независимых экс-прессионных кассет при эффективности трансфекции в 71,96%±0,3% достигается практически эквимолярная концентрация целевых белков — 1:1,62 (HGF/VEGF165), что благоприятно для активации ангиогенеза.
Предыдущие исследования плазмиды pHGF/VEGF доказали ее высокую эффективность относительно уменьшения распространения площади некроза
в ишемизированной скелетной мышце и активации анги-огенеза [2]. В изучении возможного миогенного эффекта выяснилось, что pHGF/VEGF не обладает выраженным влиянием на образование и рост новых миофибрилл в ишемизированной скелетной мышце. С другой стороны, данный факт свидетельствует о безопасности плаз-мидного вектора относительно митогенной активности.
Также в данной работе было впервые исследовано влияние экспрессируемых факторов (VEGF165 и HGF) на ак-сональный рост в средах после трансфекции HEK293T плазмидой pHGF/VEGF. Было установлено, что выраженный рост и ветвление аксонов не наблюдается при воздействии АФР по сравнению со всеми отрицательными контролями, однако, с другой стороны, и не подавляется.
Для клинической картины КИНК характерно наличие воспалительных процессов. По результатам исследования, один из контролей которого — препарат сравнения «Неоваскулген» (ПАО «Институт стволовых клеток человека», Россия), pHGF/VEGF способствует уменьшению воспаления путем снижения инфильтрации макрофагов в ишемизированной мышце. Особенно выражен этот эффект в сравнении с «пустым» вектором (pVAX2), для которого характерно развитие иммунного ответа. Фенотипирование макрофагов позволило детально проанализировать инфильтрацию ишемизированной мышцы: оценивалась как вся популяция CD68+, так и только М2+ субпопуляция. В результате генной терапии с использованием pHGF/VEGF количество M2+ макрофагов в повреждённой ткани значительно возрастало по сравнению со всеми контрольными группами, а также препаратом сравнения «Неоваскулген», что свидетельствует в пользу противовоспалительного действия исследуемого вектора.
Работа поддержана грантом РФФИ № 20-01500181 "Выяснение механизма участия факторов роста эндотелия (VEGF) и гепатоцитов (HGF) при регенерации ишемизированных скелетных мышц.
Литература:
1. Makanevich P.I. et al. PLOS ONE. 2018. Vol. 13 № 5. P. 1-25.
2. Slobodkina E. et al. Pharmaceutics. 2020. Vol. 12. № 12.
P. 1-23.
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ МСК КРЫС И ЧЕЛОВЕКА И ИХ КОНДИЦИОНИРОВАННЫХ СРЕД ПРИ МЕСТНЫХ ЛУЧЕВЫХ ПОРАЖЕНИЯХ НА МОДЕЛИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
A.А. Расторгуева. Т.А. Астрелина,
B.А. Брунчуков. Ю.Б. Сучкова. И.В. Кобзева. Д.Ю. Усупжанова, Е.Е. Ломоносова. В.А. Никитина. В.А. Брумберг. А.М. Комлев. А.С. Самойлов
Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России, Москва, Россия
e-mail: rastorgueva.ann@gmail.com
Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, местные лучевые поражения, кондиционированная среда, клеточные технологии, рентгеновское излучение.
Местные лучевые поражения (МЛП) могут возникать не только в чрезвычайных ситуациях, но и в рядовых случаях, например у человека, проходящего лучевую терапию. Использование клеточной терапии для лечения МЛП базируется на восстановлении погибших клеток ба-зального слоя эпидермиса, куда входят в том числе про-лиферирующие клетки кожи [1-3].
Цель: изучение процессов регенерации при лечении МЛП кожи МСК и их кондиционированной средой на лабораторных животных.
Материалы и методы: в исследование включено 120 белых крыс-самцов линии Wistar рандомизированых на 6 групп: контроль (К), животные не получали терапию; контроль с введением концентрата культуральной среды (КС) трехкратно на 1,14,21 сутки; введение МСК слизистой десны человека (ДЧ) в дозе 2 млн на 1 кг трехкратно на 1,14,21 сутки; введение концентрата кондиционированной среды МСК слизистой десны человека (ДЧКС) в расчетной дозе трехкратно; введение МСК слизистой десны крысы (ДК) в дозе 2 млн на 1 кг трехкратно; введение концентрата кондиционированной среды МСК слизистой десны крысы (ДККС) в расчетной дозе 2 млн клеток на 1 кг трехкратно. Проводились гистологическое и иммуногистохимическое исследования. Культивировали МСК по стандартной методике до 3-5 пассажа, осуществляли забор кондиционированной среды и концентрировали ее в 10 раз.
Результаты: на 112-е сутки отмечалось полное заживление язвы кожи у 40 % животных в группе КС, у 60 % в группе ДЧ, у 20 % животных в группах ДЧКС, ДККС, в группах К и ДК не было ни одного животного с затянувшейся раневым дефектом.
Заключение: таким образом, все использованные методы лечения были эффективны при МЛП и приводили к уменьшению площади поражения, сокращению времени заживления язвы, улучшению регенеративных процессов. Положительная экспрессия маркера VEGF отмечалась в группах К и КС на 28-е сутки и в опытных группах (ДЧ, ДЧКС, ДК, ДККС) на 112-е сутки. Статистически значимое увеличение маркера CD68 отмечено в группах К, ДК и ДККС, а в остальных группах отмечено уменьшение количества макрофагов.
Литература:
1. Брунчуков В.А., Астрелина Т.А., Никитина В.А. и др. Гены и клетки. 2019, т.14 Приложение с. 41
2. Zheng K, Wu W, Yang S, Huang L, Chen J et al. 2015. Mol Med Rep 12(5): 7065-7071.
3. Расторгуева А.А., Астрелина Т.А., Брунчуков В.А. и др. Медицинская радиология и радиационная безопасность. 2021. Т. 66. № 4. С.5-12.
РАЗРАБОТКА НОВОЙ ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ ГЕННО-ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА «НЕОВАСКУЛГЕН» ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕНТАЛЬНОЙ ИМПЛАНТАЦИИ
Т.С. Расулов1, П.С. Тимашев2, П.И. Котенева2, Н.В. Кошелева2, А.Л. Файзуллин2, Т.В. Брайловская1, 2, А.П. Ведяева1, 2
1 ФГБУ НМИЦ ЦНИИС и ЧЛХ Минздрава России, Москва, Россия
2 ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. ИМ. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), Москва, Россия
e-mail: nasulov.doc@gmail.com
Ключевые слова: тканеинженерная конструкция, мультипо-тентные мезенхимные стромальные клетки, «Неоваскулген», дентальная имплантация
Дефицит костных и мягких тканей десны снижает эффективность дентальной имплантации особенно в эстетически
