CC BY
7
в группах по шкалам KOOS и ВАШ (р > 0,05), и её отсутствие при анализе KSS (р > 0,05). В 1 группе клинические результаты значимо хуже по шкалам KOOS и ВАШ за счёт большего количества интраоперационных переломов в зоне остеотомии и меньшей величины валь-гусной коррекции. Однако, количество переломов и величина вальгусной коррекции не имеют статистически значимой разницы (р > 0,05). При введении SVF регенерация хрящевой ткани наблюдается статистически значительно чаще, чем с PRP (р > 0,05), что может увеличивать сроки выживаемости результатов ВТО.
АДАПТАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ
ТРАНС-СПЛАЙСИНГА ДЛЯ СОЗДАНИЯ
КЛЕТОЧНЫХ МОДЕЛЕЙ
А.Л. Примак1, Н.А. Басалова1 2,
М.Н. Скрябина1, А.Е. Толстолужинская1 2,
А.Ю. Ефименко1, 2, М.Н. Карагяур1, 2
1 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Институт Регенеративной медицины, Медицинский научно-образовательный центр, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: primak.msu@mail.ru
Ключевые слова: клеточные модели, транс-сплайсинг,
пре-транс-РНК.
Экспериментальные клеточные модели являются удобным инструментом для установления функции отдельных молекул, механизмов работы сигнальных и метаболических каскадов, а также для выяснения патогенеза широкого спектра заболеваний и идентификации новых терапевтических мишеней. Генетические технологии (редактирование генома, «генная терапия» ex vivo и транс-сплайсинг) позволяют моделировать все более тонкие изменения в структуре генома и белков, и создавать модельные объекты, максимально приближенные к первичным клеткам.
Транс-сплайсинг представляет собой природный механизм сплайсинга нескольких пре-мРНК в единую зрелую мРНК. Данный механизм впервые был открыт у простейших рода Trypanosoma, которые с помощью данного механизма регулируют экспрессию собственных генов. К преимуществам данного подхода относятся небольшой размер генетической конструкции, кодирующей ПТР, высокая эффективность его доставки, а также высокая степень согласованности/конкордантности образования специфического продукта транс-сплайсинга с экспрессией целевого гена, что позволяет имитировать результат редактирования гена в его природном контексте при значительно большей эффективности. Технология транссплайсинга позволяет моделировать любые модификации кодирующей части целевых генов от точечных замен и замен отдельных экзонов до масштабных вставок и мечения целевых белков. В то же время, транс-сплайсинг по своей эффективности уступает цис-сплайсингу и нередко приводит к образованию сплайс форм мРНК, нехарактерных для физиологического сплайсинга, а, следовательно, к образованию новых не физиологичных форм белков.
Согласно данным литературы, оптимизация дизайна пре-транс-РНК (ПТР), дополнение его siRNA/shRNA к цис-формам РНК и новыми snRNA, направляющими процессы сплайсинга, позволяют значительно увеличить эффективность и специфичность механизма транс-сплайсинга. В данной работе нами была изучена возможность применения транс-сплайсинга для создания генетически
модифицированной линии клеток нейробластомы 1\1еиго2а, экспрессирующей изоформу рецептора урокиназного активатора плазминогена uPAR, неспособную взаимодействовать с белком внеклеточного матрикса витронек-тином. Мы предполагаем, что полученная клеточная модель может быть использована для изучения механизмов функционирования и внутриклеточной сигнализации Р1аиг в процессах нейритогенеза, навигации и роста нервного волокна. Для улучшения эффективности транс-сплайсинга нами была проведена оптимизация пре-транс-РНК.
Изучение механизмов транс-сплайсинга и его оптимизация может повысить эффективность создания клеточных моделей на основе трудно модифицируемых типов клеток, а также ключом к разработке новейших эффективных методов терапии/коррекции наследственных заболеваний, в том числе в рамках зрелого организма.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-15-00125.
МОДЕЛИРОВАНИЕ ГИПЕРТРОФИЧЕСКОЙ КАРДИОМИОПАТИЯ С ПОМОЩЬЮ НАПРАВЛЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ИПСК С МУТАЦИЕЙ P.ASN515DEL В ГЕНЕ MYBPC3 В КАРДИОМИОЦИТЫ IN VITRO
К.А. Проняева1, Л.Ш. Шаяхметова1 2, Е.В. Дементьева1, С.В. Павлова1
1 ФГБНУ ФИЦ Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, Новосибирск, Россия
2 Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия
e-mail: ks_pronyaeva@mail.ru
Ключевые слова: гипертрофическая кардиомиопатия, клиническое значение мутаций, индуцированные плюрипотент-ные стволовые клетки, кардиомиоцит.
Гипертрофическая кардиомиопатия (ГКМП) является распространённой сердечно-сосудистой патологией, приводящей к прогрессирующей сердечной недостаточности, аритмиям, а также увеличивающей риск внезапной сердечной смерти. ГКМП характеризуется структурными изменениями миокарда, которые приводят к диастоличе-ским дисфункциям. Более 1000 различных мутаций в генах, в основном кодирующих саркомерные белки, могут быть ответственны за развитие наследственной формы данного заболевания. Однако не для всех выявленных мутаций доказана их способность вызывать ГКМП, а так же лишь для ограниченного их числа понятен механизм действия. Изучение взаимосвязи между мутациями в сар-комерных белках и нарушением структуры кардиомиоци-тов, а также их электрической стабильности ограничено сложностью получения образцов сердечной ткани.
Целью данного исследования ставилось создание клеточной модели гипетрофической кардиомиопатии с помощью направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с де-лецией p.Asn515del в гене MYBPC3 в кардиомиоциты.
Ранее в лаборатории были получены ИПСК пациента HCM14 (ICGi029-A, Европейский реестр стволовых клеток человека). Так же были получены изогенные линии с мутацией p.Asn515del в гене MYBPC3 в геноме условно здорового пациента К7(ICGi022-A). ИПСК трех линий пациента НСМ14, трех линий с внесёнными мутациями ^-515del, линии изогенного контроля К7 и условно здоровых пациентов К6 (ICGi021-A) и К9 были запущены
в кардиальную дифференцировку. После окончания протокола дифференцировки кардиомиоциты были рассажены в редкой плотности, на 34-36 день клетки фиксировались и окрашивались антителами к маркёрам кардиомиоцитов. Площадь клеток определяли в результате анализа изображений с помощью пакета ImageJ. Полученные данные статистически обрабатывали с помощью пакета программ R.
В результате данной работы путём направленной дифференцировки ИПСК в кардиомиоциты была получена линия клеток с мутацией p.Asn515del в гене MYBPC3 с достоверным увеличением площади кардиомиоцитов. Данная линия в дальнейшем может быть использована как тканевая модель гипертрофической кардиомиопатии in vitro. Работа поддержана грантом РНФ № 22-15-00271.
СИСТЕМА ЛАЗЕРНОЙ ТРАНСФЕКЦИИ КЛЕТОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЛОЕВ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА ДЛЯ КОНТРОЛИРУЕМОЙ ДОСТАВКИ ГЕНОВ
ТЕПылаев1, 2, Е.С. Авдеева1, 2, Н.Г. Хлебцов2, 3
1 ФГБОУ ВО Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Минздрава России, Саратов, Россия
2 Институт биохимии и физиологии растений
и микроорганизмов — обособленное структурное подразделение ФИЦ СНЦ РАН, Саратов, Россия
3 ФГБОУ ВО Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов, Россия
e-mail: pylaev.te@staff.sgmu.ru
Ключевые слова: трансфекция, клеточные культуры, золотые нанозвезды, оптопорация, генотерапия, внутриклеточная доставка.
Разработка надежных технологий для получения биомедицинских клеточных продуктов с репрограммиро-ванным геномом является одной из приоритетных задач современной биоинженерии. Активно идут разработки новых и исследования существующих систем доставки [1] на основе различных носителей и/или с применением физического воздействия [2]. Тем не менее, до сих пор не существует технологии, одновременно безопасной и совместимой с различными клеточными типами и доставляемыми агентами. Отдельно следует упомянуть о невозможности масштабирования и автоматизирования некоторых существующих систем, что крайне важно на этапах продвижения в реальную практическую плоскость, в том числе для задач регенеративной медицины.
Мы предлагаем новую технологию плазмон-индуциро-ванной оптопорации клеток для эффективной и безопасной доставки целевых генов, совместимую с различными типами клеток [3]. Принцип работы системы состоит в кратковременном увеличении проницаемости мембран клеток, выращенных на монослоях золотых наночастиц (ЗНЧ), за счет кратковременного локального нагрева частиц, индуцируемого лазерным облучением резонансной длины волны. Монослои ЗНЧ получены непосредственно на культуральном пластике (планшетах либо чашках Петри), что является прекрасным биосовместимым субстратом для адгезионных клеток [4]. Главным преимуществом системы является возможность тонкой настройки под индивидуальные особенности клеток и доставляемых агентов путем регулировки режимов облучения и параметров монослоев ЗНЧ. Мы протестировали возможности системы для целого ряда контрастных по свойствам
клеток млекопитающих (HeLa, A431, CHO, RAW 264.7) и доставляемых агентов широкого размерного диапазона: от молекулярных красителей (пропидий иодид, 700 Да), контрольных плазмид (3-10 т.п.н.) до меченых декстранов с массой от 10 до 100 кДа. Возможность настройки режимов облучения на используемой импульсной 1064-нм на-носекундной лазерной установке с узкосфокусированным пучком позволила получить обнадеживающие результаты для всех протестированных линий в сравнении с коммерческими агентами для липофекции.
Таким образом, предлагаемая система является крайне перспективным вариантом трансфекции клеток in vitro, и может быть адаптирована для сложных объектов, таких как первичные и стволовые клетки. Кроме того, возможность масштабирования открывает перспективы для практического внедрения нашей технологии плаз-монной оптопорации для решения задач персонифицированной медицины и клеточной биоинженерии.
Литература:
1. Stewart M.P., Langer R., Jensen K.F. Chem. Rev. 2018. V. 118. P. 7409.
2. Pylaev T.E., Avdeeva E.S., Khlebtsov N.G. J. Innov. Opt. Health Sci. 2021. V. 14. Art. 2130003.
3. Pylaev T., Vanzha E., Avdeeva E. et al. J. Biophoton. 2019. V. 12. Art. e201800166.
4. Pylaev T.E., Efremov Yu.M., Avdeeva E.S. et al. ACS Appl. Nano Mater. 2021 V. 4. P. 13206.
ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НОВОГО БИЦИСТРОННОГО ГЕНОТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ПЛАЗМИДЫ С ГЕНАМИ VEGF165 И HGF ЧЕЛОВЕКА
А.В. Раднаева2, П.И. Макаревич2, М.А. Болдырева1, Е.В. Парфёнова1, 2
1 Институт экспериментальной кардиологии, НМИЦ Кардиологии Минздрава России им. Е.И. Чазова, Москва, Россия
2 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: arina.radnaeva05@gmail.com
Ключевые слова: генная терапия, критическая ишемия нижней конечности, бицистронный плазмидный вектор, ан-гиогенез, миогенез, нейрогенез, VEGF, HGF
В последние годы для лечения критической ишемии нижней конечности (КИНК) наиболее перспективным направлением является терапевтический ангиогенез с применением методов генной терапии. Среди векторных систем преимуществом с точки зрения безопасности обладают плазмиды. Представленная в данном исследовании бицистронная плазмида pHGF/VEGF позволяет одновременно доставлять гены двух ангиогенных факторов роста (АФР), комбинация которых на данных момент является одной из самых эффективных [1]. Благодаря наличию в составе плазмиды двух независимых экс-прессионных кассет при эффективности трансфекции в 71,96%±0,3% достигается практически эквимолярная концентрация целевых белков — 1:1,62 (HGF/VEGF165), что благоприятно для активации ангиогенеза.
Предыдущие исследования плазмиды pHGF/VEGF доказали ее высокую эффективность относительно уменьшения распространения площади некроза
