CC BY
9
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
193
в кардиальную дифференцировку. После окончания протокола дифференцировки кардиомиоциты были рассажены в редкой плотности, на 34-36 день клетки фиксировались и окрашивались антителами к маркёрам кардиомиоцитов. Площадь клеток определяли в результате анализа изображений с помощью пакета ImageJ. Полученные данные статистически обрабатывали с помощью пакета программ R.
В результате данной работы путём направленной дифференцировки ИПСК в кардиомиоциты была получена линия клеток с мутацией p.Asn515del в гене MYBPC3 с достоверным увеличением площади кардиомиоцитов. Данная линия в дальнейшем может быть использована как тканевая модель гипертрофической кардиомиопатии in vitro. Работа поддержана грантом РНФ № 22-15-00271.
СИСТЕМА ЛАЗЕРНОЙ ТРАНСФЕКЦИИ КЛЕТОК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЛОЕВ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА ДЛЯ КОНТРОЛИРУЕМОЙ ДОСТАВКИ ГЕНОВ
ТЕПылаев1, 2, Е.С. Авдеева1, 2, Н.Г. Хлебцов2, 3
1 ФГБОУ ВО Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Минздрава России, Саратов, Россия
2 Институт биохимии и физиологии растений
и микроорганизмов — обособленное структурное подразделение ФИЦ СНЦ РАН, Саратов, Россия
3 ФГБОУ ВО Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов, Россия
e-mail: pylaev.te@staff.sgmu.ru
Ключевые слова: трансфекция, клеточные культуры, золотые нанозвезды, оптопорация, генотерапия, внутриклеточная доставка.
Разработка надежных технологий для получения биомедицинских клеточных продуктов с репрограммиро-ванным геномом является одной из приоритетных задач современной биоинженерии. Активно идут разработки новых и исследования существующих систем доставки [1] на основе различных носителей и/или с применением физического воздействия [2]. Тем не менее, до сих пор не существует технологии, одновременно безопасной и совместимой с различными клеточными типами и доставляемыми агентами. Отдельно следует упомянуть о невозможности масштабирования и автоматизирования некоторых существующих систем, что крайне важно на этапах продвижения в реальную практическую плоскость, в том числе для задач регенеративной медицины.
Мы предлагаем новую технологию плазмон-индуциро-ванной оптопорации клеток для эффективной и безопасной доставки целевых генов, совместимую с различными типами клеток [3]. Принцип работы системы состоит в кратковременном увеличении проницаемости мембран клеток, выращенных на монослоях золотых наночастиц (ЗНЧ), за счет кратковременного локального нагрева частиц, индуцируемого лазерным облучением резонансной длины волны. Монослои ЗНЧ получены непосредственно на культуральном пластике (планшетах либо чашках Петри), что является прекрасным биосовместимым субстратом для адгезионных клеток [4]. Главным преимуществом системы является возможность тонкой настройки под индивидуальные особенности клеток и доставляемых агентов путем регулировки режимов облучения и параметров монослоев ЗНЧ. Мы протестировали возможности системы для целого ряда контрастных по свойствам
клеток млекопитающих (HeLa, A431, CHO, RAW 264.7) и доставляемых агентов широкого размерного диапазона: от молекулярных красителей (пропидий иодид, 700 Да), контрольных плазмид (3-10 т.п.н.) до меченых декстранов с массой от 10 до 100 кДа. Возможность настройки режимов облучения на используемой импульсной 1064-нм на-носекундной лазерной установке с узкосфокусированным пучком позволила получить обнадеживающие результаты для всех протестированных линий в сравнении с коммерческими агентами для липофекции.
Таким образом, предлагаемая система является крайне перспективным вариантом трансфекции клеток in vitro, и может быть адаптирована для сложных объектов, таких как первичные и стволовые клетки. Кроме того, возможность масштабирования открывает перспективы для практического внедрения нашей технологии плаз-монной оптопорации для решения задач персонифицированной медицины и клеточной биоинженерии.
Литература:
1. Stewart M.P., Langer R., Jensen K.F. Chem. Rev. 2018. V. 118. P. 7409.
2. Pylaev T.E., Avdeeva E.S., Khlebtsov N.G. J. Innov. Opt. Health Sci. 2021. V. 14. Art. 2130003.
3. Pylaev T., Vanzha E., Avdeeva E. et al. J. Biophoton. 2019. V. 12. Art. e201800166.
4. Pylaev T.E., Efremov Yu.M., Avdeeva E.S. et al. ACS Appl. Nano Mater. 2021 V. 4. P. 13206.
ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НОВОГО БИЦИСТРОННОГО ГЕНОТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ПЛАЗМИДЫ С ГЕНАМИ VEGF165 И HGF ЧЕЛОВЕКА
А.В. Раднаева2, П.И. Макаревич2, М.А. Болдырева1, Е.В. Парфёнова1, 2
1 Институт экспериментальной кардиологии, НМИЦ Кардиологии Минздрава России им. Е.И. Чазова, Москва, Россия
2 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: arina.radnaeva05@gmail.com
Ключевые слова: генная терапия, критическая ишемия нижней конечности, бицистронный плазмидный вектор, ан-гиогенез, миогенез, нейрогенез, VEGF, HGF
В последние годы для лечения критической ишемии нижней конечности (КИНК) наиболее перспективным направлением является терапевтический ангиогенез с применением методов генной терапии. Среди векторных систем преимуществом с точки зрения безопасности обладают плазмиды. Представленная в данном исследовании бицистронная плазмида pHGF/VEGF позволяет одновременно доставлять гены двух ангиогенных факторов роста (АФР), комбинация которых на данных момент является одной из самых эффективных [1]. Благодаря наличию в составе плазмиды двух независимых экс-прессионных кассет при эффективности трансфекции в 71,96%±0,3% достигается практически эквимолярная концентрация целевых белков — 1:1,62 (HGF/VEGF165), что благоприятно для активации ангиогенеза.
Предыдущие исследования плазмиды pHGF/VEGF доказали ее высокую эффективность относительно уменьшения распространения площади некроза
Гены & Клетки XVII, №3, 2022
