CC BY
499. Funktsionirovaniye i serologicheskaya aktivnost ekstrakta kletok i produktov ekspressii Mycobacterium bovis [Functioning and serological activity of the extract of cells and products of Mycobacterium bovis expression] / E.A.Shuralev, K.S.Khaertynov, A.R.Valeeva [et al.] // Veterinariya i kormleniye. - 2017. - № 3. - P. 103-105.
10. Iziskaniye ekspress metoda diagnostiki tuberkuleza krupnogo rogatogo skota [Finding a rapid method of bovine tuberculosis diagnostics] / R.G.Ilyazov, T.A.Yakhno, R.A.Khamzin [et al.] // Ucheniye zapiski Kazanskoy gosudarstvennoy akademii veterinarnoy meditsini im. N.E. Baumana. - 2014. - № 220 (4). - P. 115-118.
11. Ispolzovaniye ekspress-testa Bovine TB dlya provedeniya skriningovykh issledovaniy na tuberkulez krupnogo rogatogo skota [Using express-test Bovine TB for undertaking screening studies on bovine tuberculosis] / D.N.Mingaleev, R.Ch.Ravilov, N.I.Sadykov [et al.] // Ucheniye zapiski Kazanskoy gosudarstvennoy akademii veterinarnoy meditsini im. N.E.Baumana. - 2016. - № 225 (1). - P.50-52.
12. Jakait, J.A. Dot-blot IFA test-sistema dlya viyavleniya antitel k mikobakteriyam tuberkuleza krupnogo rogatogo skota [Dot-blot immunoanalysis test-system for the detection of antibodies to Mycobacteria of bovine tuberculosis] // Ucheniye zapiski Kazanskoy gosudarstvennoy akademii veterinarnoy meditsini im. N.E.Baumana. - 2017. - № 231. - P. 37-40.
13. Viyavleniye spetsificheskikh antitel u vapiti pri tuberkuleze [Detection of specific antibodies in elk infected by tuberculosis] / E.A.Shuralev, M.N.Mukminov, C.Whelan [et al.] // Veterinariya. - 2013. - № 8. - P. 54-57.
14. Shuralev, E.A. Mikobakterialnye antigeny: sinteticheskie peptidy i rekombinantnye belki [Mycobacterial antigens: synthetic peptides and recombinant proteins] / E.A.Shuralev // Ucheniye zapiski Kazanskoy gosudarstvennoy akademii veterinarnoy meditsini im. N.E.Baumana. - 2013. - № 216. - P. 403-407.
15. Multiplex immunoassay for serological diagnosis of Mycobacterium bovis infection in cattle / C.Whelan, E.Shuralev, G.O'Keeffe [et al.] // Clinical and Vaccine Immunology. - 2008. - № 15 (12). - P. 1834-1838. doi: 10.1128/ CVI.00238-08.
16. Performance of the Enferplex TB assay with cattle in Great Britain and assessment of its suitability as a test to distinguish infected and vaccinated animals / C.Whelan, A.O.Whelan, E.Shuralev [et al.] // Clinical and Vaccine Immunology. - 2010. - № 17 (5). - P. 813-817. doi: 10.1128/CVI.00489-09.
17. Use of a multiplex enzyme-linked immunosorbent assay to detect a subpopulation of Mycobacterium bovis-infected animals deemed negative or inconclusive by the single intradermal comparative tuberculin skin test / C.Whelan, E.Shuralev, H.F.Kwok [et al.] // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. - 2011. - № 23 (3). - P. 499-503.
18. Multipleksniy IFA s khemilyuminestsentoy metkoy dlya diagnostiki tuberkuleza u kabanov [Multiplex ELISA with chemiluminescent label for the diagnosis of tuberculosis in wild boars] / E.A.Shuralev, M.N.Mukminov, A.R.Valeeva [et al.] // Veterinariya. - 2013. - № 2. - P. 25-28.
УДК 619:616.98:579.841.93
ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БРУЦЕЛЛ ВИДА ABORTUS, НАХОДЯЩИХСЯ В РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ДИССОЦИАЦИИ
М.А.Косарев - кандидат биологических наук, зав. сектором по изучению бруцеллеза;
А.М.Фомин - доктор ветеринарных наук, профессор, гл.н.с.; Г.М.Сафина - кандидат ветеринарных наук, вед.н. с.; С.А.Григорьева - мл.н.с.; Л.А.Тухватуллина - мл.н.с.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, Казань, Научный городок - 2, тел.+7(843)239-53-31, e-mail: vnivi@mail.ru)
Целью исследования являлось изучение культурально-морфологических свойств бруцелл, находящихся в различной степени диссоциации. Культурально-морфологические свойства бруцелл штамма B.abortusR-1096 (R-форма) изучали в сравнении с штаммами B.abortus 19 (S-форма) и 82 (SR-форма) в комплексе тестов: скорость и характер роста на питательных элективных средах - печеночно-пептонномглюкозо-глицериновом агаре (ППГГА), на питательных средах с красками (тионин 1:25 тыс., 1:50 тыс., 1:100 тыс; фуксин 1:50 тыс., 1:100 тыс.), способность образовывать сероводород, потребность в повышенном содержании углекислого газа, окраска колоний по Уайт-Вилсону, чувствительность к пенициллину (0,5; 5; 50; 100 ЕД/мл), антигенные свойства культур с использованием специфических бруцеллезных S- и R-сывороток и монорецепторных «А» и «М» сывороток,
проба термоагглютинации, проба с трипафлавином (акрифлавином). Культура штамма В-1096 во все сроки учета термоагглютинации, а также в пробе с трипафлавином показывала положительные результаты. Наиболее интенсивное выделение сероводорода было у штамма И-1096 в сравнении с другими вакцинными штаммами В.аЬог^в 19 и 82. Штамм И-1096 рос во всех разведениях анилиновых красок, и наблюдали сплошной рост на средах, где концентрация антибиотика составляла 0,5 - 5,0 и 50 ЕД/мл. Изучение культурально-морфологиче-ских свойств бруцелл, находящихся в различной степени диссоциации показало отличительные свойства культуры штамма И-1096 в сравнении с другими исследуемыми штаммами во всех проведенных тестах.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: бруцеллез, диссоциированная форма, культурально-морфологические свойства.
Бруцеллез относится к наиболее распространенным заболеваниям, и полная его ликвидация является актуальной задачей, стоящей перед ветеринарной и медицинской наукой [7-12]. Сложность этой проблемы обусловливается рядом особенностей биологии возбудителя этого заболевания.
У бруцелл описаны явления диссоциации с образованием R- и S-форм [1-3]. Из организма животных и человека нередко выделяли диссоциированные формы бруцелл [4].
В хозяйствах с длительным неблагополучием по бруцеллезу наиболее проявляется действие различных факторов на антигенную структуру бруцелл, отсюда идет увеличение количества атипичных и диссоциированных форм бруцелл [5, 6].
Целью наших исследований было изучение культу-рально-морфологических свойств бруцелл вида abortus, находящихся в различной степени диссоциации.
Материалы и методы. Для достижения поставленной цели проведена серия исследований по изучению культурально-морфологических свойств бруцелл штамма B.abortus R-1096, полученного на печено-пеп-тонном глюкозо-глицериновом агаре. В качестве контролей при этом были использованы штаммы B. abortus 19 (S-форма) и 82 (SR-форма). В число рекомендуемых методов вошли комплекс тестов: скорость и характер роста на питательных элективных средах, рост на печеночно-пептонном глюкозо-глицерино-вом агаре (ППГГА), на питательных средах с красками (тионин 1:25 тыс., 1:50 тыс., 1:100 тыс.; фуксин 1:50 тыс., 1:100 тыс.), потребность в повышенном содержании углекислого газа, способность образовывать
Вакцинные штаммы B. abortus 19, 82 и R-1096 в процессе метаболизма на питательных средах выделяли сероводород. Интенсивность его выделения была более выражена у штамма R-1096.
сероводород, окраска колоний по Уайт-Вилсону, чувствительность к пенициллину (0,5; 5; 50; 100 ЕД/мл), антигенные свойства культур с использованием специфических бруцеллезных Б- и Я-сывороток и моноре-цепторных «А» и «М» сывороток, проба термоагглютинации, проба с трипафлавином (акрифлавином).
Результаты исследований. Установлено, что характер роста культур на ППГГА через одни сутки выглядел в виде прозрачного налета на поверхности питательной среды. На вторые сутки со дня посева рост культуры штамма Я-1096 был мутнее других. Через трое суток культуры штаммов Я-1096 и 82 росли в виде матового налета, а культура штамма 19 была прозрачной, блестящей и соломенно-желтого цвета.
При определении потребности для роста углекислого газа было установлено, что культуры всех вакцинных штаммов не нуждались в его повышенном содержании. Они более обильно росли под ватно-мар-левыми пробками.
Культуры штаммов 19 и 82 показывали отрицательную пробу термоагглютинации. Во все сроки учета столбик жидкости оставался равномерно мутным, а с культурой штамма Я-1096 наблюдали положительный результат во все сроки учета, при этом взвесь бруцелл оседала на дно пробирки, а столбик жидкости оставался прозрачным.
У штамма 19 отмечали отрицательную пробу с трипафлавином, у штамма 82 регистрировали положительную пробу с оценкой на два креста, а у штамма Я-1096 - положительную с оценкой на 4 креста, при этом на стекле образовывались крупные хлопья, а жидкость оставалась прозрачной (табл.1).
При определении способности роста культур с красками, установили, что штамм19 не рос на средах, содержащих тионин, а на агаре с фуксином наблюдали интенсивный рост (табл.2).
Таблица 1
Результаты проб термоагглютинации и с трипафлавином
Наименование штамма Сроки учета пробы термоагглютинации Проба с трипафлавином
Спустя 30 мин 1 ч 24 ч
B. abortus R-1096 + + + ++++
B. abortus 19 - - - -
B. abortus 82 - - - ++
Таблица 2
Результаты роста культур штаммов B. abortus 19, R-1096 и 82 на средах с красками
Наименование штамма Рост на средах с красками
Тионин Фуксин
1:25 тыс 1:50 тыс 1:100 тыс 1:50 тыс 1:100 тыс
B. abortus R-1096 + + + + +
B. abortus 19 - - - + +
B. abortus 82 + + + + +
Культуры штаммов 82 и Я-1096 росли на питательных средах со всеми разведениями анилиновых красок.
Штамм 19 показывал обильный урожай бакте-
риальной массы на среде с содержанием 0,5 и 5 ЕД антибиотика на 1 мл среды. При более высокой концентрации пенициллина рост данной культуры отсутствовал (табл. 3).
Таблица 3
Оценка результатов роста культур штаммов B. abortus 19, R-1096 и 82 на средах с пенициллином
Наименование штамма Концентрация антибиотика в 1 мл среды
0,5 ЕД/мл 5 ЕД/мл 50 ЕД/мл 100 ЕД/мл
B. abortus R-1096 + + + -
B. abortus 19 + + - -
B. abortus 82 + + + -
Культуры штаммов 82 и Я-1096 давали сплошной рост на средах, где концентрация антибиотика составляла от 0,5 до 50 ЕД/мл.
При окрашивании колоний бруцелл по Уайт-Вил-сону колонии штамма 19 не окрашивались. Они имели желтый центр и фиолетовый ободок, это объясняется тем, что В.аЬо11иБ штамм 19 - типичная культура, находящаяся в Б-форме, а колонии штамма 82 также имели желтый центр и фиолетовый ободок, но по всему желтому фону были фиолетовые вкрапления или исчерченность, это свидетельствует о том, что данная культура находится в БЯ-форме.
Результаты реакции агглютинации с Э-, R-агглютинl
Колонии штамма Я-1096 полностью были фиолетового цвета, так как данный штамм находится в Я-форме.
Культура штамма 19, находящаяся в Б-форме, реагировала только с Б-агглютинирующей и «А» моноре-цепторной сыворотками и не вступала в реакции с Я-а-гглютинирующей и «М» монорецепторной сыворотками, а культуры штамма 82, находящиеся в БЯ- и ЯБ-формах, агглютинировали в Б-, Я- и «А» сыворотках и не вступали в реакцию с «М» сывороткой. В то же время культура штамма Я-1096, находящаяся в Я-форме, положительно реагировала лишь с Я-сывороткой, при отрицательных результатах со всеми другими сыворотками (табл. 4).
Таблица 4
тощими и «А», «М» монорецепторными сыворотками
Наименование штамма Реакция агглютинации с сыворотками
агглютинирующие монорецепторные
R S «А» «М»
B. abortus 19 - + + -
B. abortus 82 + + + -
B. abortus 1096 + - - -
Заключение. Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод, что культура штамма Я-1096 во все сроки учета термоагглютинации, а также в пробе с три-пафлавином давала положительные результаты на четыре креста. Наиболее интенсивное выделение сероводорода было у штамма Я-1096 по сравнению с аналогичным показателем штаммов В.аЬоЛиБ 19 и 82. Культура штамма Я-1096 росла во всех разведениях анилиновых красок, и
при этом наблюдали сплошной рост на средах, где концентрация антибиотика составляла 0,5-5,0 и 50 ЕД/мл.
Таким образом, изучение культурально-морфо-логических свойств бруцелл, находящихся в различной степени диссоциации свидетельствует о том, что культура штамма В.аЬо11иБЯ-1096 по своим свойствам отличается от штамма В.аЬоАиБ 19 и 82 во всех проведенных тестах.
Литература
1. The new global map of human brucellosis / G.Pappas [et al.] // Lancet Infect Dis. - 2006. - Vol. 6. - P. 91-99.
2. Brucella as a biological weapon / G.Pappas, P.Panagopoulou, L.Christou, N.Akritidis // Cellular and molecular life sciences CMLS. - 2006. - Vol. 63. - P. 2229-2236.
3. Solera, J. Update on brucellosis: therapeutic challenges / J.Solera // International journal of antimicrobial agent.
- 2010. - Vol. 36. - P. 18-20.
4. Modulation of Brucella-induced macropinocytosis by lipid rafts mediates intracellular replication / M.Watarai [et al.] // Cellular Microbiology. - 2002. - Vol. 4. - P. 341-355.
5. Pizarro-Cerda, J. Invasion and intracellular trafficking of Brucella abortus in nonphagocytic cells / J.Pizarro-Cerda, E.Moreno, J.P.Gorvel // Microbes and Infection. - 2000. - Vol. 2. - P. 829-835.
6. Vector development for the expression of foreign proteins in the vaccine strain Brucella abortus S19 / D.J.Comerci [et al.] // Infect Immun. - 1998. - Vol. 66. - P. 3862-3866.
7. Metabolic control of virulence genes in Brucella abortus. HutC coordinates virB expression and the histidine utilization pathway by direct binding to both promoters / R.Sieira [et al.] // J Bacteriol. - 2010. - Vol. 192. - P. 217-224.
8. Extensive cell envelope modulation is associated with virulence in Brucella abortus / J.Lamontagne [et al.] // J Proteome Res. - 2007. - Vol. 6. - P. 1519-1529.
9. Жилина, Н.Я. Бруцеллез в Российской Федерации в 2001 - 2005 годах / Н.Я.Жилина // Санитарный врач.
- 2007. - № 6. - С. 14-21.
10. Русанова, Д.В. Эпидемиологические особенности бруцеллеза в Ставропольском крае / Д.В.Русанова, Г.И.Лямкин // Проблемы особо опасных инфекций. - 2010. - № 3. - С. 27-30.
11. Лямкин, Г.И. Эпидемиологическая обстановка по бруцеллезу в Южном федеральном округе / Г.И.Лямкин // Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций: труды Всерос. науч. конф., СПб, 19-20 ноября 2009 г. - СПб, 2009. - С. 242.
12. Кологоров, А.И. Эпидемиологическая ситуация по природно-очаговым и зоонозным инфекциям в Приволжском федеральном округе в 2000-2009 гг. и прогноз на 2010 г. / А.И.Кологоров // Проблемы особо опасных инфекций. - 2010. - Вып. 104. - С. 5-10.
STUDY OF CULTURAL AND MORPHOLOGICAL PROPERTIES OF BRUCELLAS ABORTUS IN VARIOUS DEGREES OF DISSOCIATION
Kosarev M.A. - Candidate of Biological Sciences; Fomin A.M. - Doctor of Veterinary Sciences, professor; Safina G.M. - Candidate of Veterinary Science; Grigorieva S.A. - Research Assistant;
Tuhvatullina L.A. - Research Assistant.
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnivi@mail.ru).
The purpose of the research was to study the cultural and morphological properties of Brucella in different degrees of dissociation. Cultural and morphological properties of strain of Brucella B. abortus R-1096 were studied in comparison with control strains B. abortus 19 (S-form) and 82 (SR-form) in the set of tests: speed and character of growth on nutrient elective media - liver-peptone glucose-glycerol agar (PPGA), growth on nutrient media with dyes (thionin 1:25 million, 1:50k; 1:100k; 1:50k; 1:100 thousand), hydrogen sulfide ability, the need for an increased content of carbon dioxide, color of the colonies at white-Wilson, sensitivity to penicillin (0.5; 5; 50; 100 U/ml), antigenic properties of cultures using specific Brucella S- and R-serums and minor "A" and "M" of the serum, the sample of thermoagglutination, test with trypaflavine (acriflavine). The culture of the strain R-1096 in all terms of thermoagglutination registring as well as in the sample with tripaflavin showed a positive results. The most intense release of hydrogen sulfide was registered in R-1096 in comparison with other vaccine strains of B. abortus - 19 and 82. Strain R-1096 showed the growth in all dilutions of aniline dyes and also showed continuous growth in media where the concentration of drug was 0.5 - 5.0 and 50 U/ml. The study of cultural and morphological properties of Brucella in different degrees of dissociation showed the distinctive properties of the culture of the R-1096 strain in comparison with other studied strains in all tests.
KEYWORDS: brucellosis, dissociated form, cultural and morphological properties.
References
1. The new global map of human brucellosis / G.Pappas, P.Papadimitriou, N.Akritidis, L.Christou // Lancet Infect Dis.
- 2006. - Vol. 6. - P. 91-99.
2. Brucella as a biological weapon / G.Pappas, P.Panagopoulou, L.Christou, N.Akritidis // Cellular and molecular life sciences CMLS. - 2006. - Vol. 63. - P. 2229-2236.
3. Solera, J. Update on brucellosis: therapeutic challenges / J.Solera // International journal of antimicrobial agent.
- 2010. - Vol. 36. - P. 18-20.
4. Modulation of Brucella-induced macropinocytosis by lipid rafts mediates intracellular replication / M.Watarai, S.Makino, YFujii, K.Okamoto // Cellular Microbiology. - 2002. - Vol. 4. - P. 341-355.
5. Pizarro-Cerda, J. Invasion and intracellular trafficking of Brucella abortus in nonphagocytic cells / J. Pizarro-Cerda, E.Moreno, J.P.Gorvel // Microbes and Infection. - 2000. - Vol. 2. - P. 829-835.
6. Vector development for the expression of foreign proteins in the vaccine strain Brucella abortus S 19 / D.J.Comerci, G.D.Pollevick, A.M.Vigliocco, A.C.Frasch // Infect Immun. - 1998. - Vol. 66. - P. 3862-3866.
7. Metabolic control of virulence genes in Brucella abortus. HutC coordinates virB expression and the histidine utilization pathway by direct binding to both promoters / R.Sieira, G.M.Arocena, L.Bukata, D.J.Comerci // J. Bacteriol. -2010. - Vol. 192. - P. 217-224.
8. Extensive cell envelope modulation is associated with virulence in Brucella abortus / J.Lamontagne, H.Butler, E. Chaves-Olarte [et al.] // J Proteome Res. - 2007. - Vol. 6. - P. 1519-1529.
9. Zhilina, N.J. Brucelles v Rossijskoj Federacii v 2001 - 2005 godah [Brucellosis in the Russian Federation in 20012005] / N.J.Zilina // Sanitarnij vrach. - 2007. - Vol. 6. - P.14-21.
10. Rusanova, D.V. Epidemiologicheskie osobennosti brucellesa v Stavropolskom krae [Epidemiological features of brucellosis in the Stavropol region] / D.V.Rusanova, G.I.Lyamkin // Problemi osobo opasnih infekcij. - 2010. - Vol. 3. -P. 27-30.
11. Lyamkin, G. I. Epidemiologicheskaj obstanovka po brucellesu vYuzhnom federalnom okruge [The Epidemiological situation for brucellosis in the Southern Federal district] / G.I.Lyamkin // Problemj sovremrnnoj epidemiology. Perspektivnie sredstva i metodi laboratornoi diagnostiki i profilaktiki aktualnih infectij: Tr. Vseros nauch. conf.; 19-20 Noyabr. 2009. -SPb, 2009. - P. 242. [The problems of modern epidemiology. Prospective means and methods for laboratory diagnostics and prevention of actual infections: proceedings of All-Russian conf., November 2009. - SPb, 2009. - P. 242.]
12. Kologorov, A.I. Epidemiologicheskaya situatsiya po prirodno-ochagovym i zoonoznym infektsiaym v Privolzhskom federalnom okruge v 2000 - 2009 i prognoz na 2010 [The Epidemiological situation on natural-focal and zoonotic infections in the Volga Federal district in 2000 - 2009 and forecast for 2010] / A.I.Kologorov // Problemy osobo opasnykh infektsiy. - 2010. - Vol. 104. - P. 5-10.
