CC BY
31УДК 619:576.851.42.576.809.53
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КУЛЬТУРЫ BRUCELLA ABORTUS 19 С ЦЕЛЬЮ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ РНГА
П.М.Кабахова - н.с.; О.Ю.Юсупов - доктор ветеринарных наук, профессор, зав. лабораторией ЭДиП бруцеллеза; М.М.Микаилов - кандидат ветеринарных наук, ст. н.с.; Э.А.Яникова - н.с.;
Г.М.Шехилалиева - мл. н.с., А.Т.Гулиева - мл.н.с.
ФГБНУ Прикаспийский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт, г.Махачкала (367000, Республика Дагестан, г.Махачкала, Дахадаева, 88, тел.: +7 (8722) 68-27-02,
e-mail: pznivi@bk.ru).
Представлены результаты исследований по конструированию питательной среды и испытанию ее для выращивания бруцелл штамма B.abortus 19 с целью получения бакмассы, пригодной для изготовления бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Для выращивания культуры бруцелл из штамма B.abortus 19 с целью производства бруцеллезного эритроцитарного антигена для РНГа испытана, в сравнении с мясопептонным печеночным глюкозо-глицериновым агаром (МППГГА), новая плотная питательная среда - агар, изготовленный на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей. Изучены ростовые свойства нового агара, а также антигенные свойства бруцелл штамма B.abortus 19, и пригодность бакмассы бруцелл, выращенных на этой среде для производства эритроцитарного антигена для РНГА. При выращивании культуры штамма B.abortus 19 на новой питательной среде, изготовленной на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей, рост бруцелл был лучше, чем на МППГГА. Выход бактериальной массы трехсуточной культуры бруцелл в расчете на 1 л питательной среды при выращивании B.abortus 19 на агаре, изготовленном на основе гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей составлял 1,1 л при концентрации 80-90 м.к. в 1 мл, а на МППГГА - 0,9-1 л той же концентрации. Бакмасса, полученная на новой питательной среды, состояла из микробных клеток, обладающих типичными для бруцелл штамма B.abortus19 биологическими и высокими антигенными свойствами. Питательная среда, изготовленная на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей, позволяет получить бактериальную массу бруцелл штамма B.abortus 19 необходимой концентрации, обладающих типичными для бруцелл биологическими свойствами без диссоциированных клеток, обладающих высокими антигенными свойствами. При изготовлении бруцеллезного эритроцитарного антигена для РНГА эта среда может заменить МППГГА, используемый для этой цели.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: питательная среда, панкреатический гидролизат казеина, экстракт хлебных дрожжей, штамм B.abortus 19, эритроцитарный антиген для РНГА.
Бруцеллез относится к числу особо опасных инфекционных болезней, причиняющих большой экономический ущерб народному хозяйству и представляющий серьезную опасность для здоровья людей. Несмотря на это, полная ликвидация его является трудной задачей, требующей больших затрат и зависящей в значительной степени от эффективности используемых в практике ветеринарно-санитарных мероприятий, в особенности методов и средств диагностики.
Применяемые в настоящее время в ветеринарной практике методы серологической диагностики бруцеллеза (РА, РСК, РИД с О-ПС антигеном и др.) не обеспечивают своевременное и полное выявление больных бруцеллезом животных. В связи с этим во многих странах, где имеется бруцеллез, большое внимание уделяется усовершенствованию и внедрению в практику более эффективных методов и средств диагностики бруцеллеза. К числу таких наиболее перспективных методов диагностики, по признанию многих исследователей, относится реакция непрямой гемаг-глютинации (РНГА).
В нашей стране эта реакция применяется в системе мероприятий по диагностике бруцеллеза животных с 2006 г. Для ее постановки применяется эритроцитарный антиген, разработанный ФГБНУ «Прикаспийский зональный НИВИ», ФГБУ «ВГНКИ» и ФГБНУ ВНИИБТЖ. Для изготовления антигена применяется бакмасса бруцелл вакцинного штамма B.abortus 19, получаемая путем выращивания культуры указанного штамма на мясо-печеночном глюкозо-глицериновом агаре (МП-ПГГА) в матровых колбах или четвертях. Однако при использовании этой питательной среды не всегда удается получить достаточное количество бакмассы и концентрацию бруцелл, необходимые для изготовления антигена для РНГА в больших количествах. При добавлении в питательную среду стерильной сыворотки крови улучшается рост бруцелл и несколько увеличивается выход бакмассы. Тем не менее для изготовления и серийного выпуска антигена приходится засевать большое количество матровых колб, что связано с большими материальными затратами и ручного труда. Кроме того, получение антигена с использованием питательной среды, изготовленной на основе высоко-
ценного пищевого продукта - мяса, экономически не оправдано, а добавление дефицитной и дорогостоящей сыворотки крови, помимо экономической нецелесообразности, вызывает дополнительные трудности, связанные со стерильным внесением ее в питательную среду и возможностью загрязнения бактериальной массы посторонней микрофлорой.
Основная цель наших исследований заключалась в изыскании недорогой и технологичной питательной среды для культивирования бруцелл из штамма B.abortus 19 с целью получения бакмассы в больших количествах для производства антигена для РНГА. С этой целью мы решили испытать возможность использования питательной среды, изготовленной на основе казеинового гидролизата и пекарских или хлебных дрожжей для получения достаточного количества биомассы бру-целл штамма 19, пригодной для изготовления эритро-цитарного бруцеллезного антигена для РНГА.
Материалы и методы. В настоящее время большинство препаратов, применяемых для диагностики бруцеллеза животных, в частности, единый антиген для РА и РСК, антиген для кольцевой реакции с молоком, роз-бенгал антиген для пластинчатой РА, эри-троцитарный антиген для РНГА готовят из вакцинного штамма B.abortus 19. Это связано с тем, что штамм B.abortus 19 обладает хорошо выраженными антигенными свойствами, стабильно сохраняет свои биологические (культурно-морфологические, антигенные, им-муногенные, вирулентные и др.) свойства и является менее опасной для работников биофабрик и персонала работающего с ним.
Существующая технология изготовления бруцеллезного эритроцитарного антигена для РНГА предусматривает культивирование бруцелл штамма B.abortus 19 на плотных мясо-печеночных средах в стеклянной посуде (матровые колбы, четверти), что требует больших затрат ручного труда и времени. При выращивании культуры B.abortus 19 на этих средах не всегда удается получить бактериальную массу достаточно высокой концентрации, требующей для производства антигена. Недостатком ее является также необходимость использования для изготовления питательной среды мясного бульона и печеночного экстракта, полученных из высокоценных пищевых продуктов - говяжьего мяса и печени. В ряде случаев, особенно при отсутствии агар-агара хорошего качества, для улучшения роста бруцелл в питательную среду приходится добавлять 5-10% стерильной сыворотки крови. Питательная среда дорогостоящая, поскольку готовится из доброкачественной свежей говядины и печени крупного рогатого скота.
При массовом серийном производстве диагностических препаратов, в том числе и антигена для РНГА, большое значение имеет использование питательных сред, обеспечивающих оптимальный рост бруцелл и хорошее накопление бакмассы. Поэтому с целью изыскания наиболее технологичной и недоро-
гой питательной среды, изготовленной из непищевого сырья, в то же время обеспечивающей получение бакмассы бруцелл штамма B.abortus 19, пригодной для производства антигена для РНГА нами испытана, в сравнении с мясопеченочным глюкозо-глицериновым агаром, новая плотная питательная среда - агар, изготовленный на основе гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей.
Агар на основе гидролизата казеина и хлебных дрожжей.
Для получения бактериальной массы бруцелл культуру штамма B.abortus 19 выращивали в матровых колбах на плотной питательной среде, изготовленной из корсаковского агар-агара на основе панкреатического гидролизата казеина с добавлением в качестве белковых и углеводных компонентов, источника различных витаминов и других ростовых факторов - экстракта хлебных дрожжей. Использование гидролизата казеина обосновано тем, что он содержит наиболее полный набор необходимых для роста бруцелл аминокислот и является более дешевым сырьем по сравнению с мясом.
Питательная среда состоит из равных объемов панкреатического гидролизата казеина глубокой степени расщепления и экстракта дрожжей, разведенных после смешивания дистиллированной водой до содержания аминного азота 110-130 мг% с добавлением 0,5% хлористого натрия, 1% глюкозы, 2% глицерина и 2,5-3% агар-агара. Данная питательная среда значительно дешевле, по сравнению с МППГГА, так как для ее изготовления не используются высокоценные пищевые продукты - мясо и печень, а также дефицитная и дорогостоящая сыворотка крови крупного рогатого скота.
Мясопептонный печеночный глюкозо-глицерино-вый агар.
Для изготовления 1 л среды брали 500 мл мясного бульона и 500 мл печеночного экстракта, 3% агар-агара, 1% пептона, 0,5% хлорида натрия, рН 7,2-7,3. После кипячения и расплавления агар-агара в среду добавляли 2% глицерина и 1% глюкозы, после чего ее разливали в матровые колбы по 250 мл и стерилизовали при одной атмосфере в течение 30 минут. РН после стерилизации - 6,8-7,1.
Результаты исследований. Установлено, что при выращивании культуры штамма B.abortus 19 на испытуемой питательной среде, изготовленной на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей, рост бруцелл был лучше, чем на МППГГА. Выход бактериальной массы трехсуточной культуры бруцелл, полученной при выращивании B.abortus 19 на этой питательной среде составлял 1,1 л при концентрации 80-90 м.к. в 1 мл, а на МППГГА -0,9-1 л той же концентрации. При выращивании на МППГГА получен удовлетворительный рост бруцелл штамма 19 и хорошее накопление микробной массы.
Известно, что при изготовлении бруцеллезных антигенных диагностических препаратов важное значение имеет не только выход и концентрация микробной
суспензии, используемой для этой цели, что зависит от качества и ростовых свойств питательной среды. Для получения высокоактивного и специфичного диагностического препарата не меньшее значение имеет, чтобы выросшая на питательных средах культура состояла из типичных для бруцелл неизмененных S-клеток без диссоциированных форм, обладающих высокими антигенными, агглютинабельными и другими биологическими свойствами, характерными для данной группы микроорганизмов.
Учитывая, что на свойства бруцелл большое влияние может оказать состав питательных сред, используемых для их культивирования, нами ставилась задача определить пригодность бакмассы B.abortus 19, полученной на испытуемой питательной среде, изготовленной на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей, для производства высокоактивного и специфичного бруцеллезного эритроцитарного антигена для РНГА. Прежде чем приступить к изготовлению антигена для РНГА у бруцелл микробной суспензии, выращенных на новой питательной среде, были изучены культурально-морфоло-гические, антигенные, агглютинабельные и некоторые другие биологические свойства, определяли также наличие в ее составе диссоциированных R-клеток.
При проверке мазков, изготовленных из культуры B.abortus 19 двухсуточного роста, выросшей при температуре 37-380С, на новой питательной среде, было установлено, что она состоит из грамотрицательных бактерий типичных для бруцелл коротких палочек или овоидных форм, окрашенных в красный цвет по методу Козловского.
Агглютинабельность бруцелл из штамма 19, выросших на новом агаре, изготовленном на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта дрожжей, изучали путем исследования в РА позитивной бруцеллезной сыворотки с использованием в качестве антигена взвеси бруцелл указанного штамма с концентрацией 2 млрд/см3 в физиологическом растворе, инактивированной нагреванием в водяной бане при 700С в течение 30 минут. Культура хорошо агглютинировалась позитивной бруцеллезной сывороткой до ее титра.
Определение наличия диссоциированных клеток в культуре, полученной путем выращивания B.abortus 19 на испытуемой среде, проводили по методу Уайт-Вильсона. Для этого из двухсуточной агаровой культуры B.abortus 19 готовили взвесь бруцелл в стерильном физиологическом растворе с таким расчетом, чтобы при посеве на агар в чашках вырастало изолированные колонии бруцелл. С этой целью одномиллиардную взвесь культуры по оптической концентрации методом десятикратных разведений доводили до разведений 10-6 - 10-7 и из каждого разведения делали высевы по 0,1 мл на проверяемый агар в чашках Петри. Посевы выдерживали при 36,5-37,00С в течение 5 сут, после чего в
чашки с агаром, где выросли отдельные колонии наливали рабочий раствор - кристалл виолета (1:2000). Через 30 сек краску сливали и просматривали колонии с помощью бинокулярной лупы. На всех чашках колонии имели светло-желтый или светло-зеленоватый цвет. Окрашенных колоний или колоний, состоящих из измененных, диссоциированных бруцелл не было, то есть колонии сохраняли S-форму, типичную для бруцелл штамма B.abortus 19.
Проведенные исследования показали, что бакмас-са, полученная на испытуемой среде, состоит из микробных клеток, обладающих типичными для бруцелл штамма B.abortus 19 культурально-морфологически-ми, выраженными антигенными и агглютинабельными свойствами и не содержит измененных диссоциированных клеток.
Для изготовления эритроцитарного антигена для РНГА культуру B.abortus 19 на обеих питательных средах выращивали при температуре 370С в течение 72 часов. Микробную суспензию после смыва с поверхности питательных сред доводили до концентрации 80-100 млрд. м.к. в 1 мл, автоклавировали при 1 атмосфере в течение 30 мин и использовали в качестве сен-ситина для приготовления эритроцитарного антигена для РНГА. Антиген для РНГА готовили по способу, разработанному ФГБНУ «Прикаспийский ЗНИВИ», ФГБУ «ВГНКИ» и ФГБНУ «ВНИИБиТЖ».
При испытании для исследования сывороток крови крупного рогатого скота и овец на бруцеллез серии антигена, полученные с использованием бакмассы бруцелл штамма 19, выращенной на обеих питательных средах были специфичны и существенно не отличались по чувствительности.
Таким образом, проведенные исследования показали, что питательная среда, изготовленная на основе панкреатического гидролизата казеина и экстракта хлебных дрожжей, при изготовлении эритроцитарно-го антигена для РНГА может заменить мясопептонную печеночную глюкозо-глицериновую среду, используемую для этой цели и позволяет получить бактериальную массу бруцелл, пригодную для производства указанного антигена.
Заключение. Результаты проведенных исследований дают основание рекомендовать для культивирования бруцелл штамма B.abortus 19, с целью получения бакмассы для производства эри-троцитарного антигена для РНГА, использование питательной среды, изготовленной на основе панкреатического гидролизата казеина и дрожжевого экстракта, которая позволяет получить бакмассу бруцелл с типичными биологическими свойствами без диссоциированных клеток и обладающие высокими антигенными свойствами.
Данная питательная среда намного дешевле, по сравнению с мясопеченочными средами, т.к. для ее изготовления не используются высокоценные пищевые продукты - мясо и печень.
Литература
1. Альтон, Д. Методы лабораторных исследований по бруцеллезу / Д.Альтон, Л.М.Джонс. - Женева: Всемирная организация здравоохранения, 1968. - 84 с.
2. А.с. 382682 СССР, МКИ С12Ы 1/20. Питательная среда для выращивания микроорганизмов / М.М.Иванов, Н.А.Михайлов. - № 1675773/30-15; заявл. 18.06.1971; опубл. 23.05.1973, Бюл. № 23. - 4 с.
3. Вершилова, П.А. Бруцеллез / П.А.Вершилова, А.А.Голубева, Е.И.Кайтмазова. - М.: МедГиз, 1961. - 414 с.
4. Гидролизат казеина средней степени расщепления кислотный сухой // Микробиологические питательные среды: каталог; под ред. Ш.М.Меджидова. - Махачкала, 2001. - С. 9.
5. Коротич, А.С. Питательные среды, ускоряющие рост бруцелл / А.С.Коротич // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1960. - Вып. 3.
6. Питательная среда для выделения и культивирования бруцелл, сухая (эритрит агар) // Микробиологические питательные среды: каталог; под ред. Ш.М.Меджидова. - Махачкала, 2001. - С. 47.
7. Триленко, П.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных / П.А.Триленко. - Л.: Колос. Ленинградское отд-ние, 1976. -280 с.
NUTRIENT MEDIUM FOR CULTIVATION OF BRUCELLA ABORTUS 19 TO PRODUCE ANTIGEN FOR IHT
Kabakhova P.M. - Research Officer; Yusupov O.Yu. - Doctor of Veterinary Medicine, professor;
Mikailov M.M. - Candidate of Veterinary Sciences; Yanikova E.A. - Research Officer;
Shehilalieva G.M. - Research Assistant; Gulieva A.T. - Research Assistant.
Caspian Zonal Research Veterinary Institute, Makhachkala (e-mail: pznivi@bk.ru).
The article presents the design of nutrient medium and its trial for cultivation of B.abortus strain 19 brucella used to produce erythrocyte antigen for indirect hemagglutination test (IHT). A new solid medium - the agar based on pancreatic casein hydrolizate and grain yeast extract was tested for cultivation of B.abortus 19 in comparison with a meat-and-peptone liver glucose-glycerin agar (MPLGGA). The medium was trialled for growth features, antigenic features against B.abortus strain 19 and suitability of brucella bacterial mass to produce erythrocyte antigen for IHT. The new nutrient medium based on pancreatic casein hydralizate and grain yeast extract showed better growth of B.abortus 19 brucella than MPLGGA. With the new nutrient medium based on pancreatic casein hydralizate and grain yeast extract the bacterial mass yield of three-days brucella culture per 1 liter was 1.1 liters at a concentration of 80-90 microbial cells per 1 ml, while with MPLGGA the bacterial mass yield was 0.9-1 liter in the same concentration. Bacterial mass received using the new nutrient medium consisted of microbial cells with biological and high antigen properties typical for B.abortus 19 brucella. The nutrient medium from pancreatic casein hydrolyzate and grain yeast extract allows to receive B.abortus19 bacterial mass in required concentration and possessing biological properties, typical for brucellas, without the dissociated cells possessing high antigen properties. This medium can replace MPLGGA at production of a brucellar erythrocyte antigen for IHT.
KEYWORDS: nutrient medium, pancreatic hydralyzate of casein, extract of grain yeast, B.abortus 19, erythrocyte antigen for IHT.
References
1. Alton, D. Laboratory techniques in brucellosis / D.Alton, L.M.Johns // World Health Organization. - Geneva, 1968. - 84 p.
2. A. s. 382682 the USSR. Pitatelnaya sreda dlya vyraschivaniya mikroorganizmov [Nutrient medium for growing microorganisms] / M.M.Ivanov, N.A.Mikhaylov - № 1675773/30-15; applied in 18.06.1971; published in 23.05.1973, Bulletin № 23. - 4 p.
3. Vershilova, P.A. Brutsellez [Brucellosis] / P.A.Vershilova, A.A.Golubeva, Ye.I.Kaytmazova. - Moscow: MedGiz, 1961. - 414 p.
4. Gidrolizat kazeina sredney stepeni rasshchepleniya kislotnyy sukhoy: Mikrobiologicheskiye pitatelnyye sredy [ Acidic dry casein hydrolyzate of medium degree of cleavage: Microbiological nutrient media]: catalog edited by Sh.M.Medzhidov. - Makhachkala. 2001. - P. 9.
5. Korotich, A.S. Pitatelnyye sredy, uskoryayushchiye rost brutsell [Nutrient media accelerating brucella growth] / A.S.Korotich // Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. - 1960. - Iss. 3.
6. Pitatelnaya sreda dlya vydeleniya i kul'tivirovaniya brutsell, sukhaya (eritrit agar) [Nutrient medium (dry erythritol agar) for isolation and cultivation of brucella]. Microbiological nutrient media]: catalog edited by Sh.M.Medzhidov. -Makhachkala. 2001. - P. 47.
7. Trilenko, P.A. Brutsellez selskokhozyaystvennykh zhivotnykh [Brucellosis of farm animals] / P.A.Trilenko. -Leningrad: Kolos, 1976. - P. 250-253.
