CC BY
72
УДК 619:576.807.7.636.22
СТЕПЕНЬ ГОМОЛОГИИ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК БРУЦЕЛЛ
А.В. ИВАНОВ, член-корреспондент РАСХН, директор Е.В. ПАНКОВА, младший научный сотрудник Р.М. АХМАДЕЕВ, кандидатветеринарныхнаук, старший научный сотрудник
Э.М. ПЛОТНИКОВА, доктор ветеринарных наук, зав. лабораторией
ФГБУ «Федеральныйцентр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»
E-mail: vnivi@mail.ru
Резюме. В экспериментах были использованы, как стабильные S-формы (B.abortus 54,19, B.melitensis Rev-1, B.suis 117, B.rangiferi Г-221, B.rangiferiВ-307, B.ovis, B.canis), такидиссоцианты и трансформанты из S- в SR-формы (B.abortus82,82Пч и 82 Ц) и R-формы (B.abortus R-1096, B.rangiferi С-227, С-226) бруцелл. В работе использовали 3 варианта ПЦР(ПЦР-1, мультиплекс ПЦР-2 и ПЦР-3) и 6 видов праймеров (P1 - bsp31, P2 - IS711, P3 - IS711, P4 - R0952, P5 - BMEU 0635-0636 и P6 - A0504). Из испытанных праймеров оптимальным оказался P1 (bsp31), который позволяет идентифицировать различные виды бруцелл независимо от вирулентности и степени диссоциации культур (S-, SR-, R-формы). Кроме того, с использованием праймеров P1 и Р2 можно идентифицировать бруцеллы вида B.abortus, P1, Р3 - B.melitensis, Р1, P4 - B.suis (rangiferi), P1, P6 - B. ovis, P1, P4, P5 - B.canis. Полученные данные подтверждаюттакуюхарактерную особенность микроорганизмов рода Brucella, как высокая гомологичность их ДНК. При этом изменчивость бруцелл (диссоциация, трансформация и др.) не ведет к заметной дивергенции генома. Следовательно, метод ДНК-ДНК гибридизации не только дополняет общепринятую систему тестов идентификации бруцелл, но и во многих случаях может служить единственно достоверным показателем принадлежности микроорганизмов к роду Brucella.
Ключевые слова: бруцеллёз, штамм, гомологичность, диссоциация, трансформация, праймер, ДНК-полимераза.
В 1983 г. американский ученый K. Millis впервые сообщил о создании нового метода диагностики, основанного на амплифицировании ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК - синтетических праймеров и фермента ДНК-полимеразы [1].
Изучение рода Brucella в аспекте геносистематики показало, что это хорошо обособленная, компактная группа бактерий, для которыххарактерен высокий уровень гомологии ДНК (90.. .100 %) независимо от видовой принадлежности [2, 3].
В процессе взаимодействия возбудителей бруцеллеза со внешней средой (колебания температуры, солнечная и ионизирующая радиация, персистенция в организме восприимчивых животных и носителей, влияние лечебнопрофилактических средств, антибиотиков и дезинфектантов и др.) нередко происходят существенные изменения их фенотипических свойств, что создает значительные затруднения при идентификации. Поэтому использование общепринятых методов в таких случаях нередко приводит к ошибочным результатам. Кроме того, рутинные методы, как правило, длительны и связаны с большими материальными затратами [4].
Как показали проведенные ранее исследования, наиболее достоверный метод ускоренной идентификации бруцелл -определение степени подобия нуклеотидных последовательностей их ДНК с использованием различных физических и химических методов [5].
Цель наших исследований - изучить метод определения нуклеотидных последовательностей в реакции ДНК-ДНК гибридизации при идентификации бруцелл и дифференциации их от фенотипически сходных микроорганизмов.
Условия, материалы и методы. В ходе исследований изучено 35 культур микроорганизмов в реакции ДНК-ДНК гибридизации с целью подтверждения или исключения их принадлежности к роду Brucella.
В экспериментах использовали стабильные S-формы (B.abortus 54, 19, B.melitensis Rev-1, B.suis 117, B.rangiferi Г-221, B.rangiferiВ-307, B.ovis, B.canis), а также диссоцианты и трансформанты из S- в SR-формы (B.abortus 82, 82 Пч и 82 Ц) и R-формы (B.abortus R-1096, B.rangiferi С-227, С-226).
Для определения степени гомологии нуклеотидных последовательностей штаммов бруцелл различного происхождения (референтных музейных, вакцинных и эпизоотических) использовали метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).
Выделение тотальной ДНК из штаммов и культур микроорганизмов проводили согласно Методическим рекомендациям [6].
Праймеры для ПЦР разрабатывали в программе Vector NTI. В опытах использовали Taq-полимеразу фирмы «Си-бЭнзим» и олигонуклеотиды фирмы «Синтол».
В работе использовали 3 варианта полимеразной цепной реакции - ПЦР-1, мультиплекс ПЦР-2 и ПЦР-3 и 6 видов праймеров - P1 (bsp31), P2 (IS711), P3 (IS711), P4 (R0952), P5 (BMEU 0635-0636) и P6 (A0504).
При положительной ПЦР-РВ с парой праймеров Р1, подтверждающей принадлежность исследуемых изолятов и культур кроду Brucella, и отрицательныхреакциях с использованием Р2-Р6 изолятили культуруисследовали дополнительно с другими парами праймеров для определения его вида, например В.cet, В. cetaceae, B.inopinatae, В^ютИ, B.maris, В. pinnipedialis или отнесения к бруцеллам неопределённой видовой принадлежности, то есть Brucella spp.
Для подтверждения достоверности реакции «гнездового» варианта ПЦР, параллельно проводили идентификацию изучаемых культур по характеру их флуоресценции в зависимости от номера цикла.
Полученные в ходе исследований положительные результаты по генотипической идентификации референтных и вакцинных штаммов бруцелл послужили основанием для продолжения опытов по ПЦР-идентификации эпизоотических штаммов - изолятов бруцелл, выделенных из организма сельскохозяйственных (свиньи) и диких (олени, песцы, волки, зайцы) животных, обитающих на Крайнем Севере.
Поскольку выделенные из организма диких животных варианты бруцелл (B.rangiferi) значительно отличались от референтного штамма B.suis (шт. 1330) по фенотипическим
Таблица 1. Результаты ПЦР-РВ идентификации культур, принадлежащих к роду Brucella*
Вид Био- тип Р1 (bsp 31) Р2 (IS 711 alk В) Р3 (IS 711 BME11162) Р4 (R 0952) Р5 (ВMEI 0635- 0636) Р6 (А 0504)
B.abortus 19 1 + + - - - -
B.melitensis 16М 1 + - + - - -
B.suis
(B.rangiferi-303) 1 + - - + - -
B.ovis 31 + - - - - +
B.canis + - - + + -
Контроль - - - - - -
* «+» - положительная реакция;«-» - отрицательная реакция.
Достижения науки и техники АПК, №8-2012
8З
свойствам (расщепление по признаку потребности в фуксине, тионине, образование CO2, H2S, различная серологическая активность и вирулентность), мы сочли необходимым провести молекулярно-генетические исследования по определению степени гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК эпизоотических штаммов, вакцинных из органов и тканей диких животных-носителей бруцелл. В качестве референтного штамма использовали B.suis 1330 - носителя стандартной ДНК, а в качестве испытуемых:
B.rangiferi 0-172 (от дикого северного оленя), B.suis 117 (из абортированных плодов свиноматки из Калининградская обл.), B.rangiferi B-307 (из организма волка с территории Крайнего Севера), B.rangiferi С-227 и B.rangiferi С-226 (из организма собаки с Крайнего Севера), B.suis 1005 (из организма собаки в Казахстане), B.rangiferi Г-221 (из сердца горностая с Крайнего Севера), B.suis-164 (из организма зайца на территории Польской народной республики).
Результаты и обсуждение. Результаты анализа в варианте ПЦР-1 пяти штаммов различных видов бруцелл (B.abortus 19, B.melitensis 16М, B.suis 303, B.ovis 31 и B.canis RM6) показали, что все они проявляют положительную реакцию с использованными праймерами. Это свидетельствует об их принадлежности к роду Brucella (табл. 1). Однако каждый вид имел свои особенности. Так, В.abortus вступал в ПЦР с праймерами Р1, Р2; В.melitensis - Р1, Р3; В.suis - Р1, Р4; В.ovis - Р1, Р6; В.canis - Р1, Р4, Р5 и Р6.
Установлено, что использованные штаммы бруцелл значительно отличаются по характеру флуоресценции в зависимости от цикла амплификации и каждому виду свойственна своя специфика флуоресценции.
При параллельных молекулярно-генетических исследованиях указанных культур в вариантах ПЦР «Мультиплекс ПЦР-2» и «ПЦР-3» получены менее достоверные результаты. Так, при использовании праймера Р2 (IS 711 akB) положительная реакция отмечена для бруцелл вида B.abortus 19, праймера Р3 (IS 711 ВМЕ1 1162) - B.melitensis 16M, праймера Р4 (R0952) - B.suis (B.rangifari303); праймера P5 (BMEU 06350636) - B.canis RM6 и праймера 6 (А0504) - B.ovis 31.
Из испытанных 6 видов праймеров оптимальным оказался P1 (bsp31), который позволяет идентифицировать различные виды бруцелл независимо от вирулентности и степени диссоциации культур (S-, SR-, R-формы).
Результаты молекулярно-генетических исследований 10 эпизоотических штаммов бруцелл с использованием
ПЦР в реальном времени показали, что степень гомологии нуклеотидных последовательностей ихДНК, независимо от показателя вирулентности или степени диссоциации, была практически однозначной в пределах 85...100 % (табл. 2).
Таблица 2. Степень гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК эпизоотических культур бруцелл с ДНК референтного штамма B.suis 1330
Штамм Виру- лент- ность* Фор- ма коло- нии Гомология ДНК, %, M±m Принадлежность роду Brucella
B.suis 117 + S- 100,0 +
B.suis 1005 + S- 95,7±9,1 +
B.suis 164 +- SR- 84,3±7,7 +
B.rangiferi 0-172 + S- 100,0 +
B.rangiferi В-307 + SR- 91,3±1,5 +
B.rangiferi С-226 + R- 89,7±3,7 +
B.rangiferi Г-221 + S- 96,1±1,9 +
B.rangiferi С-227 +- R- 93,5±5,5 +
* «+-» - слабовирулентный
Эпизоотические штаммы B.suis 117, B.suis 1005 (биотип 3) и B.suis 164, независимо от источника выделения, региона (Калининградская область РФ, Казахстан, ПНР) и степени диссоциации (S-, SR-формы), имели высокую степень гомологии с ДНК референтного штамма B.suis 1330 (84,3.100,0). Это, на наш взгляд, свидетельствует о тесном генетическом родстве бруцелл и о том, что их SR-диссоциация не приводит к значительным перестройкам в нуклеотидной последовательности ДНК, независимо от показателя вирулентности или степени диссоциации, подтверждающим или исключающим принадлежность микроорганизмов к роду Brucella.
Аналогичную степень гомологии с ДНК референтного штамма имели штаммы бруцелл-изолятов, выделенных из организма диких северных оленей (100,0 %), волка (91,3 %), собаки (89,7 и 93,5 %) и горностая (96,1 %).
Выводы. Полученные данные подтверждают, что характерная особенность микроорганизмов рода Brucella -высокая гомологичность ДНК. При этом изменчивость бруцелл (диссоциация, трансформация и др.) не ведет к заметной дивергенции их генома. Следовательно, метод ДНК-ДНК гибридизации не только дополняет общепринятую систему тестов идентификации бруцелл, но и во многих случаях может служить единственно достоверным показателем принадлежности штаммов к роду Brucella.
Литература.
1. Millis, K. Primer-DirectedEuzymaticAmppplication of DNA with a Thermostable DNA Polymerase//Sctence. - 1983. - V.239. -P.487-491.
2. Verger J.M., Grimont F., Griment P.A. Brucella a monospecitig genus as shown by decxyribonucleic acid hybridization //Int. J. Syst. Bacter. - 1985. - V.36. - №3. - P.292-296.
3. Мельниченко А.Н. Нуклеотидный состав и степень подобия нуклеотидных последовательностей ДНК у бруцелл разных видов // Бюллетень ВИЭВ. - 1983. - Вып.51. - С.53-56.
4. Обухов И.Л., Груздев К.Н., Панин А.Н. Использование полимеразной цепной реакции в практических ветеринарных лабораториях / Ветеринария. - М. - 1997. - С. 24-26.
5. Скляров О.Д., Брюсова М.Б., Обухов И.Л. и др. Диагностика бруцеллеза методом полимеразной цепной реакции // Тез. докл. Вс. конф. «Лекарств. средства для животных и корма». - М., 2005. - С. 33-35.
6. Фаизов Т.Х., Макаев Х.Н., Садыков Н.С., Панкова Е.В. Индикация и дифференциация отдельных видов бруцелл с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени // Методические рекомендации. - ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». -Казань. - 2011. - 20с.
DNA NUCLEOTIDE SEQUENCES HOMOLOGY LEVEL FROM VAARIOUS BRUCELLA STRAINS A.V. Ivanov, E.V. Pankova, R-М. Ahmadeev, E.M. Plotnikova
Summary. Our investigation included stable S-forms (B.abortus 54, 19, B.melitensis Rev-1, B.suis 117, B.rangiferi B-307, B.ovis, B.canis) dissociates and transformants from S into SR-forms (B.abortus 82, 82 penicillinsensitive, and 82 ciproletresistant ) and R-forms (B.abortus R-1096, B.rangiferi C-227, C-226). Of the evaluated 6 primers the optimal was P1 primer (bsp 31), which allowed to identify different Brucella species regardless their virulence and cell cultures dissociation level (S-, SR-, and R-forms). Moreover, P1 and P2 primers were able to identify B.abortus species, P1, P3 - B.melitensis, P1 and P4 - B.suis (rangiferi), P1 and P6 - B.ovis, P1, P4, and P5 - B.canis. The obtained data confirmed that characteristics peculiar to microorganisms of Brucella genus were high level of their DNA homology and lack of homology with species belonging to other genera. At the same time, brucella variations (dissociation, transformation, etc.) does not result in their genome significant divergence. Consequently, DNA-DNA hybridization method is not only one of the approaches of brucella identification, but very often it is the only reliable indicator that the strain belongs to Brucella genus.
Key words: brucellosis, strain, homology, dissociation, transformation, primer, DNA-polymerase.
84 ------------------------------------------- ___________ Достижения науки и техники АПК, №8-2012
