CC BY
11УДК 579.61:577.15 https://doi.org/10.29296/25877313-2021-03-05
© Коллектив авторов, 2021
ИЗУЧЕНИЕ КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КОЛЛЕКЦИОННЫХ ШТАММОВ МИКРОМИЦЕТОВ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ХРАНЕНИИ
З.К. Никитина
д.б.н., профессор, гл. науч. сотрудник,
Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (Москва, Россия) E-mail: nikitinaz@yandex.ru И.К. Гордонова к.б.н., вед. науч. сотрудник,
Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (Москва, Россия) E-mail: gordonova777@yandex.ru Э.М. Насибов аспирант,
Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (Москва, Россия)
Актуальность. Своеобразие коллекции микромицетов ФГБНУ ВИЛАР состоит в наличии штаммов способных гидролизовать коллаген, являясь потенциальными продуцентами коллагеназ. При поиске продуцентов биологически активных веществ важным показателем является стабильность жизнеспособности и биосинтетической активности микроорганизмов. В связи с этим изучение коллагенолитической активности коллекционных штаммов мицелиальных грибов в процессе длительного хранения является актуальным для решения прикладных и фундаментальных проблем современной биотехнологии.
Цель исследования. Изучение жизнеспособности и коллагенолитической активности коллекционных штаммов микромицетов при длительном хранении.
Материал и методы. Объектом исследования являлись 16 штаммов 10 видов микромицетов из коллекции ФГБНУ ВИЛАР, относящиеся к родам Aspergillus, Beauveria, Paecilomyces, Pénicillium, Phialophora. Культуры хранили под вазелиновым маслом при 4 °С в течение 4 лет. После хранения оценивали жизнеспособность и коллагеназную активность микроорганизмов при поверхностном культивировании. Кроме того, проводили глубинное культивирование грибов с определением удельной коллагенолитической активности (УКА) в фильтратах культуральной жидкости.
Результаты. Проведенные исследования показали, что все микромицеты сохраняли жизнеспособность после 4 лет консервации при выбранных условиях. При поверхностном культивировании на модифицированной среде с заменой сахарозы на коллаген грибы образовывали колонии и хорошо выраженные зоны лизиса, что свидетельствовало о синтезе и секреции колл are политических ферментов. Обнаружены различия скоростей радиального роста и индексов лизиса у отдельных видов и штаммов мик-ромимцетов. Сравнение индексов лизиса культур до и после хранения показало стабильность данного показателя. С использованием регрессионного и корреляционного анализа отобраны пять штаммов для проведения глубинного культивирования. Определение УКА в фильтратах культуральной жидкости подтвердило синтез и секрецию коллагенолитических ферментов исследованными микромицетами.
Выводы. Консервация микромицетов на агаризованных средах Чапека под вазелиновым маслом при 4 °С обеспечивает сохранение жизнеспособности и коллагенолитической активности. Подтверждена стабильность коллагенолитических свойств грибов в процессе длительного хранения. Для пяти штаммов, отобранных на основе регрессионного и корреляционного анализа, показана секреция коллагенолитических ферментов в культуральную среду при глубинном культивировании.
Ключевые слова: микромицеты, коллаген, коллагеназы, поверхностное и глубинное культивирование.
Для цитирования: Никитина З.К., Гордонова И.К., Насибов Э.М. Изучение коллагенолитических свойств коллекционных штаммов микромицетов при длительном хранении. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2021;24(3):33-39. https://doi.org/10.29296/25877313-2021-03-05
Несмотря на постоянное углубление знаний в области генетики, биохимии, физиологии и экологии микроорганизмов, мы все еще далеки от понимания полной картины процессов, ответственных за обратимый переход клеток микроорганиз-
мов в анабиотическое состояние [1]. В то же время важнейшей проблемой при работе с коллекционными штаммами-продуцентами является выбор оптимального способа их консервации, обеспечивающего сохранение не только жизнеспособности,
но и секреционной активности. Ранее было показано, что многие штаммы из коллекции микромице-тов ФГБНУ ВИЛАР обладали способностью секре-тировать протеиназы с различной субстратной специфичностью [2-5]. Среди протеолитических ферментов особое внимание привлекает коллагеназа -эндопептидаза, расщепляющая тройную спираль молекулы нерастворимого природного белка коллагена, которая может найти широкое применение во многих областях медицины [6]. Для сохранения жизнеспособности коллекционных культур с кол-лагенолитической активностью исследовались различные способы их консервации [7, 8].
Цель работы - изучение жизнеспособности, культуральных свойств и коллагеноли-тической активности коллекционных штаммов мицелиальных грибов при длительном хранении.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлись 16 штаммов 10 видов микромицетов из коллекции микроорганизмов ФГБНУ ВИЛАР, относящиеся к родам Aspergillus, Pénicillium: A. repens F 5, 6, 7, 31, A. ruber F 4, A. versicolor F 20, 26, P. chrysogenum F 1, 41, 53, P. decumbens F 2, P. i tali cum F17, P. puberulum F 16, a также Beauveria bassiana F 13, Paecilomyces variotii F 9, Phialophora verrucosa F 12.
Музейные культуры хранили на среде Чапека под вазелиновым маслом при 4 °С в течение 4 лет. После хранения микромицеты пересевали на скошенные поверхности агаризованных сред Чапека и культивировали в течение 14 суток. Жизнеспособность культур после хранения и пересева оценивали по заполняемости газона в процессе культивирования и выражали в процентах. Заполненность 1/4 газона - 25%, 1/2 газона - 50%, 3/4 газона -75%, полная заполненность - 100%.
После культивирования на свежих средах проводили посев спор микромицетов тремя уколами на чашки Петри в двух повторностях с ага-ризованной средой Чапека, модифицированной заменой сахарозы на 2%-ный коллаген, при температуре 26±1 °С, в темноте. Коллагеназную активность микроорганизмов оценивали по диаметру колоний и зон лизиса, радиальной скорости роста и индексам лизиса. Диаметр колоний и зон лизиса измеряли в двух перпендикулярных направлениях, рассчитывая индекс лизиса (Ил) по формуле:
Дк2
где Дл и Дк - средние диаметры зон лизиса и колоний соответственно.
При проведении глубинного культивирования посевным материалом служила суспензия спор дейтеромицетов (107 спор на 100 мл среды). Культивирование осуществляли в колбах вместимостью 300 мл с 100 мл питательной среды на качалке при скорости вращения 220 об/мин при 26 °С с использованием жидкой модифицированной среды Чапека с частичной заменой сахарозы на коллаген (0,5% сахарозы и 1,5% коллагена). В фильтратах культу-ральной жидкости дейтеромицета, полученных путем их пропускания через мембранный фильтр с диаметром пор 0,23 мкм на различных этапах культивирования, определяли удельную коллагеноли-тическую активность (УКА).
Для определения коллагенолитической активности (КА) к 1 мл фильтрата приливали 1 мл 1% раствора коллагена в 0,01 M Са2+ фосфатном буфере рН 7,4. Длительность проведения гидролиза составила 5 ч при температуре 37 °С. Контролем служили смесь 1 мл воды и 1 мл 1%-ного раствора коллагена (контроль субстрата) в том же буфере, а также смесь 1 мл фильтрата культураль-ной жидкости с 1 мл воды (контроль фермента). После инкубации реакцию останавливали кипячением в течение 20 мин. Осадок отделяли центрифугированием на центрифуге К 24 при 4 °С при 6000 об/мин. Коллагенолитическую активность в надосадочной жидкости определяли по накоплению а-аминогрупп с использованием нингидрино-вого реактива [9]. Удельную КА рассчитывали как отношение КА к содержанию белка, определенного методом Лоури.
Статистическую обработку результатов, регрессионный и корреляционный анализ проводили на персональном компьютере с помощью пакета статистических программ Microsoft Office Excel 2010. Данные на рисунках представлены в виде средних значений и стандартных ошибок среднего по 12 измерениям. В ряде случаев рассчитывали доверительные интервалы для уровня значимости а = 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 показано изменение количества штаммов с разной заполненностью газона в процессе культивирования. Можно видеть, что в процессе культивирования постепенно увеличивается количество штаммов с большей степенью заполняемости газона. Так, к шестым суткам культивирования только 4 штамма (A. repens F 31, A. versi-
color F 20, 26 и P. decumbens F 2) из 16 полностью заполняли газон. К 14-м суткам фиксировалось уже 14 подобных штаммов, и только у двух штаммов - P. piiberiihim F 16 и A. repens F 7 этот показатель оценивался равным 50 и 75% соответственно. Однако, как видно из рис. 2, культуры выглядели вполне жизнеспособными, что и подтвердили последующие эксперименты.
Для оценки протеолитической активности коллекционных штаммов мицелиальных грибов ранее был предложен комплекс показателей, включающий определение скоростей роста и индексов лизиса при поверхностном культивировании на модифицированных средах с заменой сахарозы на соответствующие белки [2, 3]. Проведение подобных скрининговых исследований позволило выявить потенциальных продуцентов протеиназ, а затем выделить и охарактеризовать ферменты [2, 4, 5]. В связи с этим, для изучения влияния длительного хранения на протеолитические свойства микро-мицетов, целесообразно было проведение подоб-
Рис. 2. Рост некоторых мицелиальных грибов на различные сроки культивирования: A. repens F 31 и A. versicolor F 20 (6-е сутки) -100% заполненность газона; P. puberulumV 16, A. repens F 7 (14-е сутки) - 50 и 75% заполненность газона соответственно
Рис. 3. Колонии и зоны лизиса при культивировании микромицетов на модифицированной среде, 6-е сутки культивирования. Слева направо: A. repens F 7, A. ruber F 4, P. decumbens F 2, P. chrysogenum F 53
ных исследовании при поверхностном культивировании грибов на среде с коллагеном. Можно видеть, что микромицеты хорошо росли на модифицированных средах, образуя заметные зоны лизиса (рис. 3). Следует отметить существенные различия размера колоний у отдельных видов и даже штаммов мицелиальных грибов в процессе культивирования, которые отчетливо проявляются при сравнении скоростей радиального роста культур (рис. 4).
Рис. 1. Выживаемость микромицетов после 4 лет хранения на агаризованной среде Чапека при 4 °С и пересева
Так, среди грибов рода Pénicillium наибольший размер колоний и соответствующие скорости роста фиксировались у P. chrysogenum F 53, что вызвало необходимость прекращения культивирования уже на 6-е сутки. Два других штамма росли значительно медленнее на всех этапах культивирования. Скорости роста/1, italicum и P. piiberiilum в конце культивирования достигали максимальных значений, отмеченных для P. chrysogenum F 53, тогда как указанный показатель у P. decum-bens характеризовался практически постоянными низкими значениями.
Аналогичные закономерности наблюдались и при сравнении средних за все время культивирования скоростей радиального роста грибов на среде с коллагеном (рис. 5). Максимальный показатель фиксировался у P. chrysogenum F 53, минимальные - у обоих штаммов A. versicolor, Р. с/е-cumbens F 2 и Рае с. variotii F 9. Среди изученных представителей рода Pénicillium средние скорости роста менялись в следующем ряду: F 53 > F 17 > >F16 = F1>F41>F2b диапазоне от 4,61 до
Скорость роста, мм/сут
Ш4 S 5 □ 6 а 7 суток
1 41 53 2 17 16
№ штамма
Рис. 4. Изменение скорости радиального роста микромицетов рода Pénicillium при культивировании на среде с коллагеном
1,89 мм/сутки. В целом у представителей рода РетсШтт наблюдались более высокие скорости роста на средах с коллагеном, по сравнению с ас-пергиллами, что может свидетельствовать об их более высоком адаптационном потенциале.
Наряду с такими параметрами роста микроорганизмов, как диаметр колоний, зон лизиса, скоростей роста важным показателем является индекс лизиса. Индекс лизиса определяется соотношением площади колонии и площади зоны лизиса и характеризует удельную протеолитическую активность культуры, так как площадь колонии пропорциональна ее биомассе, а площадь зоны лизиса -активности секретируемых протеиназ. В связи с этим на следующем этапе исследования были рассчитаны индексы лизиса микромицетов при росте на средах, содержащих коллаген, как на каждом этапе культивирования (рис. 6), так и средние за все время культивирования (рис. 7).
Можно видеть, что у всех штаммов А. герет максимальные индексы лизиса фиксировались на начальных этапах культивирования. Обнаруженный факт свидетельствует, по-видимому, об интенсивной секреции протеиназ на этих этапах, необходимой для адаптации культур к трудно утили-
Скорость роста, мм/сут
N; штамма
Рис. 5. Средние скорости радиального роста микромицетов при культивировании на модифицированных средах Чапека. Подписи данных представлены в виде средних значений и доверительных интервалов при уровне значимости о = 0,05
Рис. 6. Изменение индексов лизиса микромицетов рода Aspergillus в процессе культивировании на среде с коллагеном
Индекс лизиса
□ 2020 ü 2016
1
i Í _
]||[ i i ш dt Iii
5 6 7 31 4 20 26 13 9 1 41 53 2 17 16 12
№ штамма
Рис. 7. Средние индексы лизиса микромицетов на агаризо-ванной среде с заменой сахарозы на коллаген до (2016 г.) и после (2020 г.) хранения
Индекс лизиса
4 а 5 □ 6 G 7 суток
№ штамма
зируемому субстрату. На 5-е - 7-е сутки культивирования индекс лизиса резко снижался, оставаясь на относительно постоянном уровне. У двух штаммов A. versicolor в начале культивирования, наоборот, наблюдались минимальные значения индексов лизиса, затем они или постепенно повышались (F 20) или повышались, а потом возвращались к исходным значениям (F 26). У гриба A. ruber на всех этапах культивирования фиксировались низкие, практически не меняющиеся индексы лизиса.
Среди исследованных аспергилл максимальный средний индекс лизиса обнаружен у A. versicolor F 26 (рис. 7). Индексы лизиса другого штамма, а также четырех штаммов A. repens были значительно ниже. Минимальный индекс лизиса зафиксирован у A. ruber F 4. Среди представителей рода Penicillinm максимальный средний индекс лизиса обнаружен у P. chrysogemim F 41, несколько меньшие индексы отмечены у P. decnmbens F 2 и P. itctlicnm F 17. Минимальный показатель зафиксирован у P. chrysogemim F 53.
Сравнительное изучение коллагенолитиче-ской активности мицелиальных грибов до и после хранения в течение 4 лет показало, что у большинства штаммов происходило увеличение индекса лизиса (12 штаммов из 16), у одного штамма не происходило статистически достоверного изменения указанного показателя (P. chrysogemimF 1), у
трех штаммов индекс после хранения несколько снижался (A. ruber, P. chrysogemimF 53, Ph. verrucosa), оставаясь все-таки выше единицы.
Следует отметить, что в результате проведенных экспериментов, так же как и ранее [11, 12], выявлена отрицательная корреляционная связь между значимыми для оценки коллагенолитиче-ской активности грибов параметрами: скорости роста на модифицированной среде и индексом лизиса (рис. 8). Для проведения глубинного культивирования были выбраны микромицеты, с индексами лизиса и скоростью роста, лежащими в диапазоне от 3,15 до 5,38 и от 1,83 до 2,98 соответственно (таблица).
Рис. 8. Линия и уравнение линейной регрессии, показывающая соотношение между средней скоростью роста и индексом лизиса микромицетов (й2 - коэффициент детерминации)
Таблица. Коллагенолитическая активность микромицетов при глубинном культивировании на модифицированной среде (7-е сутки)
Микромицет Индекс лизиса Скорость роста, мм/сутки УКА, мкМ/мгч
A. repens F 5 5,38±0,49 2,29±0,18 7,93±0,67
A. repens F 7 3,97±0,40 2,34±0Д5 1,71±0,17
A. versicolor F 20 5,37±0,52 1,83±0Д2 7,21±0,67
P. chrysogemim F 1 3,18±0,29 2,95±0,22 5,40±1Д0
P. piibeniliim F 16 3,15±0,29 2,98±0,20 1,55±0,17
Анализ полученных результатов свидетельствует о секреции коллагенолитических ферментов в культуральную жидкость при глубинном культивировании грибов. Выявлена отрицательная корреляция между скоростью радиального роста и УКА (г = -0,525) и положительная - между индексом лизиса и УКА (г = 0,750).
ВЫВОДЫ
Консервация микромицетов на агаризован-ных средах Чапека под вазелиновым маслом при 4 °С обеспечивает сохранение жизнеспособности и коллагенолитической активности.
Все изученные микроорганизмы росли и образовывали зоны лизиса на средах с заменой саха-
розы на коллаген. Обнаружены существенные видовые и штаммовые различия скоростей роста и индексов лизиса микромицетов при культивировании на модифицированной среде.
Подтверждена стабильность коллагенолити-ческих свойств грибов в процессе длительного хранения. Для отобранных на основе регрессионного и корреляционного анализа пяти штаммов показана секреция коллагенолитических ферментов в культуральную среду при глубинном культивировании.
ЛИТЕРАТУРА
1. Похиленко В.Д., Баранов A.M., Детушев КВ. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития. Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. 2009; 4(12): 99-121.
2. Сухосыроеа Е.А., Яковлева М.Б., Никитина З.К., Быков В А. Секреция коллагенолитических ферментов некоторыми видами дейтеромицетов. Технология живых систем. 2007; 4(4): 29-33.
3. Гордонова И.К., Дмитриев Г.В., Никитина З.К. Поиск микроорганизмов - продуцентов кератиназ. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2007; 4: 11-15.
4. Никитина З.К., Гордонова И.К. Некоторые свойства кератинолитического фермента, секретируемого Clado-sporium sphaerospermum. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2011; 5: 36-40.
5. Никитина З.К, Гордонова И.К. Выделение, очистка и биохимические свойства кератинолитического фермента, секретируемого Pénicillium citrinum. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2013; 9: 36-41.
6. Можина Н.В., Руденская Г.Н. Коллагенолитические ферменты патогенных микроорганизмов. Биомедицинская химия. 2004; 50(6): 539-553.
7. Яковлева М.Б., Никитина З.К, Хоанг T.JI. Коллагеноли-тическая активность у некоторых видов дейтеромицетов при различных методах хранения. Прикладная биохимия и микробиология. 2006; 42: 489-492.
8. Яковлева М.Б., Никитина З.К. Стабильность микромицетов - продуцентов протеиназ при пролонгированных методах хранения. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2016; 4: 23-32.
9. Lee Y.P., Takahashi Т. An improved colorimetric determination of amino acids with the use of ninhydrin. Analytical Biochemistry. 1996; 14: 71-77.
10. Яковлева М.Б., Никитина З.К. Скрининг-методы в биотехнологии (Обзор). Часть 1. Поиск микроорганизмов -продуцентов ферментов. Вопросы биологической, меди-цинскойи фармацевтической химии. 2013; 9: 36-41.
11. Гордонова И.К, Никитина З.К. Использование мицели-альных грибов для вторичной переработки лекарственного растительного сырья. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2020; 6. DOI: 10.29296/25877313-2020-06-05.
12. Никитина З.К, Гордонова И.К, Насибов Э.М. Изучение коллекционных штаммов микромицетов для поиска культур с коллагенолитической активностью. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2020; 23(7): 3-8. DOI: 10.29296/25877313-2020-07-04.
Поступила 19 января 2021 г.
COLLAGENOLYTIC PROPERTIES OF MICROMYCETES COLLECTION STRAINS DURING LONG-TERM STORAGE STUDY
© Authors, 2021 Z.K. Nikitina
Dr.Sc. (Biol.), Professor, All-Russian Scientific Research Institute of Medicinal and Aromatic Plants (Moscow, Russia) E-mail: nikitinaz@yandex.ru I.K. Gordonova
Ph.D. (Biol.), Leading Research Scientist, All-Russian Scientific Research Institute of Medicinal and Aromatic Plants (Moscow, Russia) E-mail: gordonova777@yandex.ru E.M. Nasibov
Post-graduate Student, All-Russian Scientific Research Institute of Medicinal and Aromatic Plants (Moscow, Russia)
Relevance. The VILAR collection of micromycetes contains hydrolyzing collagen strains-potential producers of collagenases. When searching for enzymes producers, the stability of viability and biosynthetic activity of microorganisms is an important indicator. In this regard, the study of collagenolytic activity of mycelial fungi collection strains during long-term storage is relevant for solving applied and fundamental problems of modern biotechnology.
Objective. Viability and collagenolytic activity of collection strains of micromycetes during long-term storage study. Material and methods. The object of the study were 16 micromycetesstrains, belonging to the genera Aspergillus, Beauveria, Paeci-lomyces, Pénicillium, Phialophora. The cultures were stored under oil at 4 °C for 4 years. After storage, the viability and collagenase activity of microorganisms were evaluated during surface cultivation. In addition, deep cultivation of fungi was carried out with the determination ofcollagenolytic activity in the filtrates of the culture fluid.
Results. Studies have shown that all micromycetes remained viable after 4 years of conservation under the selected conditions. During surface cultivation on a modified medium with the replacement of sucrose with collagen, fungi formed colonies and well-defined lysis zones, which indicated the synthesis and secretion of collagenolytic enzymes. Differences in growth rates and lysis indices were found for individual species and strains of micromycetes. Comparison of lysis indices before and after storage showed the stability of this indicator. Using regression and correlation analysis, five strains were selected for deep cultivation. Determination of collagenolytic activity in culture fluid filtrates confirmed the synthesis and secretion of collagenolytic enzymes by the studied micromycetes. Conclusions. Conservation of micromycetes on agarized Chapek media under oil at 4 °C ensures the preservation of viability and collagenolytic activity. The stability of the collagenolyticproperties of micromycetes during long-term storage was confirmed. For five strains selected on the basis of regression and correlation analysis, the secretion of collagenolytic enzymes into the culture medium during deep cultivation was shown.
Key words: micromycetes, collagen, collagenases, surface and deep cultivation.
For citation: Nikitina Z.K., Gordonova I.K., Nasibov E.M. Collagenolytic properties of micromycetes collection strains during long-term storage study. Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry. 2021;24(3):33-39. https://doi.org/10.29296/25877313-2021-03-00
REFERENCES
1. Pohilenko V.D., Baranov A.M., Detushev K.V. Metody dlitel'nogo hranenija kollekcionnyh kul'tur mikroorganizmov i tendencii razvitija. Izvestija vysshih uchebnyh zavedenij. Povolzhskij region. Medicinskie nauki. 2009; 4(12): 99-121.
2. Suhosyrova E.A., Jakovleva M.B., Nikitina Z.K., Bykov V.A. Sekrecija kollagenoliticheskih fermentov nekotorymi vidami dejteromicetov. Tehnologija zhivyh sis-tem. 2007; 4(4): 29-33.
3. Gordonova I.K., Dmitriev G.V., Nikitina Z.K. Poisk mikroorganizmov - producentov keratinaz. Voprosy biologicheskoj, medicinskoj i farmacevticheskoj himii. 2007; 4: 11-15.
4. Nikitina Z.K., Gordonova I.K. Nekotorye svojstva keratinoliticheskogo fermenta, sekretiruemogo Cladosporium sphaerospermum. Voprosy biologicheskoj, medicinskoj i farmacevticheskoj himii. 2011; 5: 36-40.
5. Nikitina Z.K., Gordonova I.K. Vydelenie, ochistka i biohimicheskie svojstva keratinoliticheskogo fermenta, sekretiruemogo Pénicillium citrinum. Voprosy biologicheskoj, medicinskoj i farmacevticheskoj himii. 2013; 9: 36-41.
6. Mozhina N.V., Rudenskaja G.N. Kollagenoliticheskie fermenty patogennyh mikroorganizmov. Biomedicinskaja himija. 2004; 50(6): 539-553.
7. Jakovleva M.B., Nikitina Z.K., Hoang T.L. Kollagenoliticheskaja aktivnost' u nekotoryh vidov dejteromicetov pri razlichnyh metodah hranenija. Prikladnaja bio-himija i mikrobiologija. 2006; 42: 489-492.
8. Jakovleva M.B., Nikitina Z.K. Ctabil'nost' mikromicetov - producentov proteinaz pri prolongirovannyh metodah hranenija. Voprosy biologicheskoj, medicinskoj i farmacevticheskoj himii. 2016; 4: 23-32.
9. Lee Y.P., Takahashi T. An improved colorimetric determination of amino acids with the use of ninhydrin. Analytical Biochemistry. 1996; 14: 71-77.
10. Jakovleva M.B., Nikitina Z.K. Skrining-metody v biotehnologii (Obzor). Chast' 1. Poisk mikroorganizmov - producentov fermentov. Voprosy biologicheskoj, medicinskoj i farmacevticheskoj himii. 2013; 9: 36-41.
11. Gordonova I.K, Nikitina Z.K. Ispol'zovanie micelial'nyh gribov dlja vtorichnoj pererabotki lekarstvennogo rastitel'nogo syr'ja. Voprosy biologicheskoj, medicinskoj i farmacevticheskoj himii. 2020; 6. DOI: 10.29296/25877313-2020-06-05.
12. Nikitina Z.K, Gordonova I.K., Nasibov Je.M. Izuchenie kollekcionnyh shtammov mikromicetov dlja poiska kul'tur s kollagenoliticheskoj aktivnost'ju. Voprosy biologicheskoj, medicinskoj i farmacevticheskoj himii. 2020; 23(7): 3-8. DOI: 10.29296/25877313-2020-07-04.
