CC BY
35BIOLOGICAL SCIENCES
УДК: 579.61:577.15
Никитина З. К.
Гордонова И. К.
Насибов Э. М.
ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР), Москва DOI: 10.24411/2520-6990-2020-12070
ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ НА КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ
Nikitina Z. K.
Gordonova I. K.
Nasibov E. M.
All-Russian research Institute of medicinal and aromatic plants, Moscow
EFFECT OF LONG-TERM STORAGE ON THE CULTURAL AND BIOCHEMICAL PROPERTIES
OF MYCELIAL FUNGI
Аннотация
Целью настоящей работы являлось изучение жизнеспособности и коллагенолитической активности коллекционных штаммов мицелиальных грибов при длительном хранении. Показано, что использованный способ консервации позволяет сохранять жизнеспособность и коллагенолитическую активность всех изученных штаммов. Подтверждено, что все культуры способны гидролизовать коллаген при поверхностном культивировании и могут рассматриваться в качестве потенциальных продуцентов коллагеназ.
Abstract
The aim of this work was to study the viability and collagenolytic activity of collection strains of mycelial fungi during long-term storage. It is shown that the used method of preservation allows to maintain viability and collagenolytic activity of all studied strains. It is confirmed that all cultures are capable to hydrolyze collagen at surface cultivation and can be considered as potential producers of collagenases.
Ключевые слова: мицелиальные грибы, коллагеназы, поверхностное культивирование
Key words: mycelial fungi, collagenases, surface cultivation
Несмотря на постоянное углубление знаний в области генетики, биохимии, физиологии и экологии микроорганизмов, мы все еще далеки от понимания полной картины процессов, ответственных за обратимый переход клеток микроорганизмов в анабиотическое состояние [1]. В то же время важнейшей проблемой при работе с коллекционными штаммами-продуцентами является выбор оптимального способа их консервации, обеспечивающего сохранение не только жизнеспособности, но и секреционной активности. Ранее нами было показано, что многие штаммы из коллекции микромице-тов ФГБНУ ВИЛАР обладали способностью секре-тировать протеиназы с различной субстратной специфичностью [2 - 5]. Среди протеолитических ферментов особое внимание привлекает коллаге-наза - эндопептидаза, расщепляющая тройную спираль молекулы нерастворимого природного белка коллагена, которая может найти широкое применение во многих областях медицины [6]. Для сохранения жизнеспособности коллекционных культур с коллагенолитической активностью исследовались различные способы их консервации [7, 8]. Целью настоящей работы являлось изучение жизнеспособности, культуральных свойств и коллагенолитиче-ской активности коллекционных штаммов мицели-альных грибов при длительном хранении на агари-зованных средах.
Объектом исследования являлись 12 штаммов 11-ти видов микромицетов из биоколлекции микроорганизмов ФГБНУ ВИЛАР, относящиеся к родам Aspergillus, Monilia, Penicillium: A. niger F 51, A. terreus F 59, M. implicata F 15, P. brevicompactum F 37, 49, P. camemberti F 45, P. casei F 19, P. claviforme F 32, P. crustosum F 46, P. hirsutum F 29, P. malinovobranova F 3, P.purpurescens F 18. В некоторых экспериментах в качестве культуры для сравнения использовался новый штамм P. martensii F 63. Музейные культуры хранили на среде Чапека под вазелиновым маслом при 40С в течение 3 лет. После хранения микромицеты пересевали на скошенные поверхности сред Чапека и культивировали в течение 7 суток при температуре 26±10С. Жизнеспособность культур после хранения и пересева оценивали по заполняемости газона в процессе культивирования и выражали в процентах. Заполнение 1/4 газона - 25, 1/2 газона - 50, 3/4 газона -75, полное заполнение - 100%. После культивирования проводили посев тремя уколами на чашки Петри с агаризованной средой Чапека, модифицированной путем полной замены сахарозы на коллаген. Коллагеназную активность микроорганизмов оценивали по диаметру колоний, зон лизиса и индексам лизиса. Диаметр измеряли в двух перпендикулярных направлениях, рассчитывая индекс лизиса (Ил) по формуле: Ил = Дл2/Дк2 , где Дл и Дк -
ВЮЬОвГСАЬ 8С!Б1ЧСБ8 / <<ШУУШШУМ=^1ШШа1>#2(Щ72Ш2®
средние диаметры зон лизиса и колоний соответственно.
На рисунке 1 показано изменение количества штаммов с разным заполнением газона в процессе
культивирования. Можно видеть, что в процессе культивирования постепенно увеличивается количество штаммов с большей степенью заполняемо-сти газона.
Рис. 1. Выживаемость микромицетов после 3 лет хранения и пересева
К 7 суткам у 10 из 12 исследованных штаммов газон был заполнен полностью, только у двух штаммов, Р. таИпоуоЬгапвуа F 3 и Р. ригригасвт Б 18, этот показатель оценивался в 50%. Однако
грибы выглядели вполне жизнеспособными (рис. 2), что и подтвердили последующие эксперименты. Быстрее всего, на 4 сутки, полное заполнение газона наблюдалось у микромицста. 1.Б 51.
ж
11 н
Рис. 2. Рост некоторых мецелиальных грибов на различные сроки культивирования: А. niger Е 51 (4 сутки), А. terrius Е 59 и Р. hirsutum Е 29 (5 сутки), Р. сатетЬеШ Е 45 (6 сутки), Р. ригриге^'сет Е 18 (7
сутки)
Для оценки протеолитической активности коллекционных штаммов мицелиальных грибов ранее нами был предложен комплекс показателей, включающий определение скоростей роста и индексов лизиса при поверхностном культивировании на модифицированных средах с заменой сахарозы на соответствующие белки [2, 3]. Проведение подобных скрининговых исследований позволило выявить потенциальных продуцентов протеиназ, а затем выделить и охарактеризовать ферменты [2, 4, 5]. В связи с этим, для изучения влияния длительного хранения на протеолитические свойства мик-
ромицетов, целесообразно было проведение подобных исследований при поверхностном культивировании грибов.
Известно, что рост микроорганизмов в условиях полной или частичной замены легко усвояемого источника углерода на трудно метаболизиру-емые биополимеры, например коллаген, позволяет оценить их гидролитическую активность. Рост грибов на средах с коллагеном свидетельствует об их способности утилизировать белок после его гидролиза (рис. 3, табл. 1), а наличие выраженных зон лизиса является признаком секреции протеиназ [9].
Рис. 3. Колонии и зоны лизиса микромицетов при культивировании в течение 7 суток на среде Чапека с заменой сахарозы на коллаген. Слева направо: P. malinovobranova, P. purpurescens, A. terrius, P. crustosum
Таблица 1
Параметры роста микромицетов при поверхностном культивировании на средах с заменой саха_розы на коллаген после 3 лет хранения_
Время культивирования, сутки
№ 3 4 5 6 7
штамма Дк, Дл, Дк, Дл, Дк, Дл, Дк, Дл, Дк, Дл,
мм мм мм мм мм мм мм мм мм мм
51 2,4 8,0 5,8 17,7 7,4 23,3 23,3 33,0 26,0 35,5
59 6,5 7,7 6,8 8,7 7,6 12,3 18,6 26,6 25,7 42,2
15 2,7 - 7,8 - 8,8 - 9,5 - 11,6 16,4
37 рн* - 9,0 25,2 19 35,2 25,0 37,4 27,0 39,5
49 рн* - 10,0 17,8 20,0 27,8 22,0 28,4 24,0 31,6
45 8,8 13,5 18,8 23,5 24,5 27,5 26,3 30,2 26,4 30,8
19 3,2 11,2 10,8 21,8 30,8 35,2 38,5 43,3 44,0 44,3
32 9,8 20,6 14,8 25,6 20,3 29,5 26,2 39,5 30,5 45,3
46 6,2 15,2 11,2 20,2 16,8 22,3 21,3 27,8 23,8 33,5
29 12,2 21,5 17,2 26,5 22,0 35,4 26,8 40,2 27,8 41,0
3 11,2 23,7 16,2 27,7 18,2 29,8 19,8 32,3 22,8 35,3
63 11,3 18,0 16,2 26,7 20,7 33,8 25,0 41,0 28,2 43,5
18 рн* - рн* - 5,5 14,7 11,2 23,7 14,7 27,2
*Примечание: здесь и в другой таблице рн - нет роста.
Два изученных виды рода Aspergillus образовывали заметные колонии и зоны лизис на агаризо-ванных средах с заменой сахарозы на коллаген уже на начальных этапах культивирования. A. niger F-51 имел меньшие диаметры колоний на 3 и 4 сутки культивирования, однако к 7 суткам диаметры колоний у аспергилл были практически равны. На 3 -6 сутки культивирования диаметры зон лизиса у A. terrius F 59 были меньше, чем у A. niger, однако к 7 суткам диаметр зон лизиса у первого вида аспер-гилл превысил тот же показатель у A. niger почти в 1,2 раза.
Все штаммы рода Penicillium росли и образовывали зоны лизиса на модифицированных средах, однако, активность роста и образования зон лизиса у различных видов и штаммов заметно отличалась. Наименьший протеолитический потенциал отмечен для P. purpurescens F 18, рост которого начинался только на 5 сутки, оставаясь на самом низком уровне по сравнению с другими видами до конца культивирования. Диаметр зон лизиса также был меньше, чем у других представителей рода Penicillium. Наиболее активно на начальных этапах культивирования росли три микромицета: P. hirsutum F 29, P. malinovobranova F 3 и P. martensii F 63. Однако к 7 суткам наибольшие диаметры колоний зафиксированы для P. casei F 19 и P. claviforme F 32,
для них же, также как и для P. martensii F 63 отмечены наибольшие зоны лизиса на 7 сутки. Два штамма P. brevicompactum начинали рост на модифицированной среде Чапека только к 4 суткам культивирования, сразу образуя заметные зоны лизиса. К 6-7 суткам диаметр и колоний и зон лизиса был выше у штамма F 37.
Наименьший протеолитический потенциал обнаружен у M. implicata F 15: рост культуры был крайне неактивным, а зоны лизиса образовывались только к 7 суткам культивирования. Таким образом, все исследованные микромицеты после длительного хранения на агаризованных средах под вазелиновым маслом могут использовать коллаген в качестве единственного источника углерода, как и до хранения [10].
На следующем этапе исследования были рассчитаны индексы лизиса микромицетов при росте на средах, содержащих коллаген (табл. 2). Из двух изученных видов Aspergillus наибольшие индексы лизиса были зафиксированы для A. niger F-51 на 3 -5 сутки культивирования, затем они резко снижались, что, по-видимому, связано с преобладанием процесса роста колоний над скоростью секреции протеиназ. Средние индексы лизиса аспергилл, рассчитанные за все время наблюдения, также были больше у A. niger F-51 (рис. 4)
BIOLOGICAL SCIENCES / <<ШУУШШУМ=^1ШШа1>#2(Ш21,2®2®
Таблица 2
Индесы лизиса микромицетов на агаризованной среде с заменой сахарозы на коллаген после 3 лет _хранения_
№ штамма Время культивирования, сутки
3 4 5 6 7
51 11,11 9,31 9,91 2,01 1,86
59 1,40 1,64 2,62 1,84 2,70
15 1,0 1,0 1,0 1,0 2,0
37 рн* 7,84 3,43 2,24 2,14
49 рн* 3,16 1,93 1,67 1,73
45 2,35 1,56 1,26 1,32 1,36
19 12,25 4,07 1,31 1,27 1,01
32 4,42 2,99 2,11 2,27 2,21
46 6,01 3,25 1,76 1,70 1,98
29 3,11 2,37 2,59 2,25 2,18
3 4,48 2,92 2,68 2,66 2,40
63 2,54 2,72 2,67 2,69 2,38
18 рн* рн* 7,14 4,48 3,42
Характерной особенностью почти всех представителей рода Pénicillium является то, что максимальные индексы лизиса отмечены в самом начале роста колоний, затем они постепенно снижались. Возможно, обнаруженный факт свидетельствует об интенсивной секреции протеиназ на первых этапах культивирования, необходимой для адаптации культуры к трудно утилизируемому субстрату. Только у P. martensii F 63 зафиксированы практически не изменяющиеся во время культивирования индексы лизиса. Следует отметить достаточно высокий индекс лизиса у микромицета P. pur-purescens, для которого обнаружено длительное время адаптации (таблица 1). Полученные результаты позволяют рассматривать и эту культуру в качестве потенциального продуцента коллагенолити-ческих ферментов. Наименьшие индексы лизиса зафиксированы для микромицета M. implicata F 15.
8
51 59 15 37 49 45 19 32 46 29 3 63 18
№ штамма
(1 До хранения □ После хранения
Индекс лизиса определяется соотношением площади колонии и площади зоны лизиса и характеризует удельную протеолитическую активность культуры, так как площадь колонии пропорциональна ее биомассе, а площадь зоны лизиса - активности секретируемых протеиназ. В связи с этим для оценки влияния длительного хранения на протео-литическую активность микромицетов представляло интерес сравнить указанные показатели у грибов до и после консервации. Можно видеть (рис. 4), что после трех лет хранения наблюдаются крайне незначительные изменения средних за время культивирования индексов лизиса, которые в большинстве случаев не являются статистически достоверными (рис. 4).
Рис. 4. Средние индексы лизиса коллекционных штаммов грибов до и после 3 лет хранения
Таким образом, использованный способ консервации мицелиальных грибов из коллекции ВИЛАР позволяет сохранять жизнеспособность и коллагенолитическую активность у всех изученных штаммов. Подтверждено, что все культуры способны гидролизовать коллаген при поверхностном культивировании и могут рассматриваться в качестве потенциальных продуцентов коллагеназ. Исключение составляет микромицет ЫвпШа ¡трНс^а, для которого зафиксированы низкие скорости роста и индексы лизиса.
Список литературы
1. Похиленко В. Д., Баранов А. М., Детушев К. В. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития. // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2009. - № 4 (12). - С. 99-121.
2. Сухосырова Е. А., Яковлева М. Б., Никитина З. К., Быков В. А. Секреция коллагенолитических ферментов некоторыми видами дейтеромицетов. // Технология живых систем. - 2007. - Т. 4, № 4. - С. 29-33.
3. Гордонова И. К., Дмитриев Г. В., Никитина З. К. Поиск микроорганизмов - продуцентов кера-тиназ. // Вопросы биол., мед. и фарм. химии. - 2007. - № 4. - С. 11-15.
4. Никитина З. К., Гордонова И. К. Некоторые свойства кератинолитического фермента, секрети-руемого Qadosporшm sphaerospermum. // Вопросы биол., мед. и фарм. химии -. 2011. - № 5. - С. 36-40.
5. Никитина З. К., Гордонова И. К. Выделение, очистка и биохимические свойства кератинолити-ческого фермента, секретируемого Pénicillium citrinum. // Вопросы биол., мед. и фарм. химии. -2013. - № 9. - С.36-41.
6. Можина Н. В., Руденская Г. Н. Коллагеноли-тические ферменты патогенных микроорганизмов. // Биомедицинская химия. - 2004. - Т. 50, №6. - С. -539-553.
7. Яковлева М. Б., Никитина З. К., Хоанг Т. Л. Коллагенолитическая активность у некоторых видов дейтеромицетов при различных методах хранения. // Прикладная биохимия и микробиол. - 2006. - Т. 42. - С. 489-492.
8. Яковлева М. Б., Никитина З. К. Стабильность микромицетов - продуцентов протеиназ при пролонгированных методах хранения. // Вопросы биол., мед. и фарм. химии. - 2016. - № 4. - С. - 2332.
9. Яковлева М. Б., Никитина З. К. Скрининг-методы в биотехнологии (Обзор). Часть 1. Поиск микроорганизмов - продуцентов ферментов. // Вопросы биол., мед. и фарм. химии. - 2013. - № 9. -С.36-41.
10. Никитина З. К., Гордонова И. К., Насибов Э. М. Скрининг коллекционных штаммов мицели-альных грибов для поиска перспективных продуцентов коллагеназ. // Научный альманах. - 2020. -№ 1-2 (63). - С. 91-97.
