CC BY
12УДК 579.61:577.15 https://doi.org/10.29296/25877313-2020-06-05
© И.К. Гордонова, З.К. Никитина, 2020
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ ДЛЯ ВТОРИЧНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
И.К. Гордонова
к.б.н., вед. науч. сотрудник,
Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (Москва) E-mail: gordonova777@yandex.ru З.К. Никитина
д.б.н., профессор, гл. науч. сотрудник,
Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (Москва) E-mail: nikitinaz@yandex.ru
Актуальность. В настоящее время при лечении многих хронических заболеваний широко используются препараты на основе лекарственного растительного сырья. Современные растительные лекарственные средства, как правило, сочетают в себе высокую эффективность, относительную безопасность и широту лечебного действия. При производстве многих галеновых и неогаленовых препаратов в большинстве случаев отходы растительного сырья содержат различные биополимеры, в том числе целлюлозу, присутствие которой может при определенных условиях вызывать синтез соответствующих гидролаз-целлюлаз. Цель исследования. Разработка способов биотехнологической конверсии производственных отходов лекарственного растительного сырья на примере марены красильной.
Материал и методы. Объект исследования - 12 штаммов 11 видов микромицетов из биоколлекции микроорганизмов ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» (ВИЛАР). В качестве объекта для конверсии отходов лекарственного растительного сырья использовался шрот корней и корневищ марены красильной (Rubia tinctorum), образованный при получении сухого экстракта марены. Характерной особенностью шрота различного происхождения является низкое содержание жира и относительно высокое количество белков и целлюлозосодержащих веществ. Ранее авторы показали, что микромицеты из коллекции ВИЛАР обладают способностью гидролизовать некоторые нерастворимые белки и различные типы целлюлозы. В связи с этим совершенно логично попытаться использовать эти биологические объекты для конверсии шрота. Результаты. Показано, что все изученные мицелиальные грибы хорошо росли на средах с заменой легко метаболизируемого углевода на широту корней и корневищ Rubia tinctorum. Микромицеты образуют зоны лизиса при поверхностном культивировании, что свидетельствует о синтезе и секреции гидролаз в окружающую среду.
Выводы. В результате детального изучения 12 штаммов грибов, а также регрессионного и корреляционного анализа были отобраны 5 микромицетов, перспективных для вторичной переработки лекарственного растительного сырья. Ключевые слова: микромицеты, шрот, гидролазы, марена красильная.
Для цитирования: Гордонова И.К., Никитина З.К. Использование мицелиальных грибов для вторичной переработки лекарственного растительного сырья. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2020;23(6):28-33. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-06-05
Деятельность человека связана с появлением огромного количества разнообразных отходов [1]. Резкий рост потребления в последние десятилетия привел к существенному увеличению объемов отходов производства, которые подлежат удалению в соответствии с настоящими Федеральными законами [2].
Отходы засоряют природный ландшафт и могут являться источником поступления вредных химических, биологических и биохимических веществ в окружающую среду. Вместе с тем отходы следует рассматривать как техногенные образова-
ния, которые характеризуются значимым содержанием в них ряда ценных практически бесплатных компонентов, пригодных для использования в экономике.
Свойства микроорганизмов разрушать различные вещества широко используются в настоящее время в биотехнологии при переработке отходов различных производств [3-5].
Фитотерапия и фитопрофилактика сегодня все шире и прочнее внедряются в медицинскую практику [6, 7]. При получении многих галеновых и неогаленовых препаратов в большинстве случа-
ев образуются отходы растительного сырья, содержащие различные биополимеры, в том числе целлюлозу, лигнинцеллюлозу, белки, липиды [8]. Ранее авторами было показано, что микромицеты из коллекции мицелиальных грибов ФГБНУ ВИЛАР (Москва) и некоторые виды бактерий могут гидролизовать различные белковые и целлюлозные субстраты [9-11]. Представляет интерес изучение возможности использования указанных биообъектов для конверсии отходов при получении фитопрепаратов.
К числу важных лекарственных растений, являющихся источником создания высокоэффективных лекарственных средств, относится марена красильная (Rubia tinctorum) - многолетнее травянистое растение семейства мареновые (Rubiaceae) [12]. Препараты из корней марены (настойки, отвары, сухой экстракт и др.) применяются в традиционной фитотерапии и современной медицине при заболеваниях почек - как нефролитическое средство для уменьшения спазмов и облегчения отхождения мелких камней [13].
Цель исследования - разработка способов биотехнологической конверсии производственных отходов лекарственного растительного сырья на примере марены красильной.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлись 12 штаммов 11 видов микромицетов из биоколлекции микроорганизмов ФГБНУ ВИЛАР, относящиеся к родам Aspergillus, Monilia, Penicillium: A. niger F51, A. terreus F59, M. implicata F15, P. brevicompactum F37, 49, P. camemberti F45, P. casei F19, P. claviforme F32, P. crustosum F46, P. hirsutum F29, P. malinovobranova F3, P. purpurescens F18. В некоторых экспериментах в качестве культуры для сравнения использовали новый штамм P. martensii F 63. Проводили поверхностное культивирование микромицетов на агаризованных средах Чапека, модифицированных заменой сахарозы на шрот марены красильной при температуре 26±1 °С, в темноте. В качестве объекта для конверсии отходов лекарственного растительного сырья использовали шрот корней и корневищ марены красильной, образованный при получении сухого экстракта марены (экспериментально-производственный отдел ФГБНУ ВИЛАР). Образцы шрота марены добавляли к среде Чапека в концентрации 2,0%.
Гидролитическую активность микроорганизмов оценивали по скорости радиального роста микроорганизмов и индексам лизиса. Диаметр колоний фк) измеряли в двух перпендикулярных направлениях. Кроме того, измеряли диаметр зон лизиса фл) и рассчитывали индексы лизиса по ранее предложенной схеме [9]. Для выявления зон лизиса использовали окраску раствором Люголя [10]. Статистическую обработку результатов, регрессионный и корреляционный анализ проводили на персональном компьютере с помощью пакета статистических программ Microsoft Office Excel 2010.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что рост микроорганизмов в условиях полной или частичной замены легко усвояемых сахаров на трудно метаболизируемые биополимеры, например нерастворимые белки или целлюлозу, позволяет оценить их потенциальную гидролитическую активность. Поэтому на начальном этапе исследования фиксировались диаметры колоний и зон лизиса при культивировании микроорганизмов на средах с полной заменой углеводов на шрот марены красильной (табл. 1).
Можно видеть (рис. 1), что все исследованные культуры хорошо росли на модифицированных средах. Начальная скорость роста была максимальной у P. malinovobranova, а минимальная -у P. martensii. К 5-м суткам культивирования колонии с наибольшими диаметрами образовывал микромицет P. casei. После окрашивания также выявлялись максимальные зоны лизиса, что делало необходимым прекращение культивирования из-за вероятного слияния зон лизиса в дальнейшем. У четырех микромицетов (P. hirsutum, P. claviforme, P. camembertm P. crustosum) на начальных этапах культивирования отмечалось обильное спороношение, приводившее к образованию большого количества вторичных колоний, заполнивших весь газон (рис. 3), что также вызвало прекращение наблюдения на 5-е сутки.
На 6-е сутки культивирования максимальные диаметры колоний фиксировались у штамма сравнения P. martensii F63, который был ранее получен путем адаптации материнского штамма P. martensii F47 к росту на целлюлозных субстратах [10]. Несколько меньшие колонии обнаружены у одного из штаммов P. brevicompactum F49 и P. malinovobranova.
Таблица 1. Параметры роста микромицетов на среде со шротом марены красильной
Микромицеты Время культивирования, сутки
1-е 4-е 5-е 6-е
Dк Dк Dк Dл Dк Dл
Р. таИпоуоЬгапоуа Е3 4,3 15,7 22,8 - 26,8 45,7
М. implicata И5 2,0 12,3 18,0 - 24,0 36,0
Р. purpurescens И8 1,7 6,7 8,5 - 13,3 30,6
Р. casei И9 1,8 22,7 35,3 47,3 ин* -
Р. hirsutum Е29 2,0 10,0 10,0 18,0 ин* -
Р. clavi Forme Е32 2,2 12,2 23,0 29,1 ин* -
Р. brevicompactum Е37 3,2 17,2 21,3 - 23,3 38,0
Р. camemberti Е45 3,2 - 15,0 28,0 ин* -
Р. crustosum Е46 2,6 12,6 14,3 23,4 ин* -
Р. brevicompactum Е49 2,8 18,0 22,4 - 29,5 43,1
А. niger Е51 2,8 12,4 14,6 - 11,3 20,7
А. terreus Е59 1,8 9,5 20,3 - 21,2 36,6
Р. martensii Е63 1,0 23,3 31,4 - 32,7 43,0
Примечание : * - исследования не проводились.
Рис. 1. Рост Р. malinovobranova F3 на среде со шротом марены красильной: а - 4-е сутки культивирования; б - 5-е сутки культивирования; в - 6-е сутки культивирования
Важным показателем для оценки способности микроорганизмов утилизировать трудно гидроли-зуемые субстраты является скорость их роста на соответствующих средах. Анализ радиальных скоростей роста культур, приведенных на рис. 2, свидетельствует о различиях адаптационных потенциалов микромицетов. Можно видеть, что средние скорости роста культур существенно различаются. Так, минимальная средняя скорость роста, зафиксированная у Р. purpurescens F18, в 2,6 раза мень-
ше, чем максимальная, отмеченная у Р. casei Б19. У подавляющего большинства штаммов средняя скорость роста была больше 2 мм/сутки. У трех вновь изученных штаммов Р. таИпоуоЬгапоуа Б3, Р. casei F19 и Р. brevicompactum F49 указанный показатель превышал 4 мм/сутки и был сопоставим со средней скоростью роста Р. таШти Б63, полученного путем адаптации материнского штамма Р. таШти Б47 к росту на целлюлозных субстратах [10].
Скорость роста, мм/сутки
3 15 18 19 29 32 37 45 46 49 51 59 63
■ № штамма
Рис. 2. Средние скорости радиального роста микромицетов при культивировании на среде со шротом марены красильной
Появление при культивировании на различных субстратах зон лизиса свидетельствует о сек-
реции микроорганизмами ферментов, гидролизу-ющих соответствующие субстраты [14]. После окраски раствором Люголя на 5-е и 6-е сутки культивирования выявлялись заметные зоны лизиса (рис. 3), что позволяло рассчитать индексы лизиса для каждой культуры (рис. 4).
Индекс лизиса определяется соотношением площади колонии и площади зоны лизиса и характеризует удельную протеолитическую активность культуры, так как площадь колонии пропорциональна ее биомассе, а площадь зоны лизиса - активности секретируемых гидролаз.
На рис. 4 видно, что все исследованные культуры обладали индексами лизиса больше единицы, то есть секретировали ферменты, гидролизу-ющие шрот марены красильной.
Рис. 3. Рост микромицетов на среде со шротом марены красильной: а - P. crustosum F46 (5-е сутки); б - P. purpurescens F18 без окраски (6-е сутки); в - та же культура с окраской (6-е сутки)
Рис. 4. Индексы лизиса микромицетов на среде со шротом марены красильной
Максимальный индекс лизиса (больше 5) был отмечен у P. purpurescens F18, у трех штаммов указанный показатель был выше 3 и у шести - выше 2.
Следует отметить, что при культивировании на модифицированной среде всех исследованных микромицетов фиксировались индексы лизиса выше, чем у штамма сравнения P. martensii F63, для которого ранее был показан синтез целлюло-литических ферментов при глубинном культивировании в среде с заменой сахарозы на шрот цветков пижмы [15].
Основной целью при проведении скрининго-вых исследований является отбор перспективных штаммов-продуцентов для дальнейшего углубленного изучения гидролитического потенциала мик-
роорганизмов. При этом важными показателями для отбора являются скорость роста, которая определяет количество биомассы, и индекс лизиса - показатель гидролитической активности. Проведенный регрессионный и корреляционный анализ фиксирует значительную отрицательную корреляцию между скоростью роста и индексом лизиса при культивировании грибов на средах со шротом марены (рис. 5). Коэффициент корреляции г = = -0,7968, значимость коэффициента корреляции tр = 4,1686 > ^р = 3,0545 при уровне значимости 0,01, то есть полученный коэффициент корреляции статистически значим. В связи с этим при выборе потенциальных продуцентов гидролаз целесообразно исключить штаммы с наименьшими и наибольшими индексами лизиса.
Рис. 5. Линия и уравнение линейной регрессии, показывающие соотношение между средней скоростью роста и индексом лизиса микромицетов (R2 - коэффициент детерминации)
В результате для дальнейших исследований выбраны пять штаммов с индексами лизиса от 2,5 до 3 и скоростью роста от 2,75 до 4,25: A. terre-us F59, P. brevicompactum F37, P. claviforme F32, P. crustosum F46, P. malinovobranova F3.
ВЫВОДЫ
1. Все изученные микроорганизмы обладали способностью к росту на средах с заменой сахарозы на шрот корней и корневищ марены красильной, образовавшийся при получении сухого экстракта.
2. Обнаружены существенные видовые и штам-мовые различия скоростей роста и гидролитической активности микромицетов при культивировании на среде со шротом марены.
3. На основании проведенного регрессионного и корреляционного анализа отобраны пять пер-
спективных штаммов для вторичной переработки лекарственного растительного сырья.
ЛИТЕРАТУРА
1. Пирогова Е.Е. Правовые и организационные основы деятельности федеральных органов исполнительной власти в сфере природопользования и охраны окружающей среды: Автореф. дисс. ... канд. юр. наук. М. 2010. 29с.
2. Российская Федерация. Законы. Об отходах производства и потребления [Электронный ресурс]: Федеральный закон от 24.06.1998 N 89-ФЗ (ред. от 29.12.2015). СПС «Консультантплюс».
3. Onifade A.A., Al-Sane N.A., Al-Mussallam A.A. A review: potentials for biotechnological application of keratin-degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of feathers and other keratins as livestock feed resorurces. Bioresource Technol. 1998; 66: 1-11.
4. Касаткина А.Н. Использование мультиэнзимных композиций для деструкции пивной дробины. Биотехнология. 2008; 2: 59-65.
5. Патент № 2393719 (РФ). Способ получения биомассы кормовых дрожжей. Башашкина Е.В., Панфилов В.И., Шакир И.В. 2010. 5 с.
6. Лесновская Е.Е., Пастушенков Л.В. Фармакотерапия с основами фитотерапии: Учеб. пособие. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. 592с.
7. Потупчик Т., Эверт Л., Иванов А. Возможности применения биологически активных добавок у спортсменов в условиях высоких спортивных нагрузок. Врач. 2019; 30(10): 24-31.
8. Медетханов Ф.А., Овсянников А.П., Хайруллин Д.Д., Мул-лакаева Л.А. Технология изготовления лекарственных форм: Учеб. пособие. Казань: ФГБОУ ВО Каз. ГАВМ им. Н.Э. Баумана, 2016. 123 с.
9. Гордонова И.К., Никитина З.К., Зон ХыЧол. Сравнительная оценка протеолитической активности бактерий и микромицетов. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2017; 20(9): 18-24.
10. Никитина З.К., Гордонова И.К. Разработка методических подходов для поиска продуцентов целлюлаз. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2018; 21(3): 27-31. DOI: 29296/25877313-2018-03-05.
11. Никитина З.К., Гордонова И.К. Оценка целлюлазной активности микромицетов. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2018; 21(6): 20-26. DOI: 10.29296/25877313-2018-06-04.
12. Рыбалко М.В., Куркин ВА., Шмыгарева А.А., Саньков А.Н. Сравнительное анатомо-гистологическое исследование корневищ и корней марены красильной и марены серд-целистной. Медицинский альманах. 2018; 6: 171-174. D0I:10.21145/2499-9954-2018-6-171-174.
13. АляевЮ.Г., Руденко В.И., ФилософоваЕ.В. Современные аспекты медикаментозного лечения больных мочекаменной болезнью. Урология. 2004; 1: 41-46.
14. Яковлева М.Б., Никитина З.К. Скрининг-методы в биотехнологии (Обзор). Часть 1. Поиск микроорганизмов-продуцентов ферментов. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2016. 4: 23-32.
15. Никитина З.К., Гордонова И.К. Использование отходов лекарственного растительного сырья для биотехнологического получения гидролитических. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2019; 22(9): 37-42. DOI: 10.29296/25877313-2019-09-06.
Поступила 5 марта 2020 г.
MYCELIAL FUNGI USING FOR SECONDARY PROCESSING OF MEDICINAL PLANT RAW MATERIALS
© I.K. Gordonova, Z.K. Nikitina, 2020 I.K. Gordonova
Ph.D. (Biol.), Leading Research Scientist,
All-Russian Scientific Research of Medicinal and Aromatic Plants (Moscow)
Z.K. Nikitina
Dr.Sc. (Biol.), Professor,
All-Russian Scientific Research Institute of Medicinal and Aromatic Plants (Moscow)
Currently, in the treatment of many chronic diseases, drugs based on medicinal plant raw materials are widely used. Modern herbal medicines, as a rule, combine high efficiency, relative safety and breadth of therapeutic action. In the production of many galenic and neogalenic preparations, in most cases, waste products of plant raw materials containing various biopolymers, including cellulose, the presence of which can, under certain conditions, induce the synthesis of the corresponding hydrolases - cellulases. The reviewed article is devoted to solving the actual problem of using mycelial fungi for secondary processing of medicinal plant raw materials. As an example of waste of plant raw materials, the authors used a schroth of roots and rhizomes of Rubia tinctorum, formed in the process of dry extract obtaining in the experimental production Department of All-Russian Scientific Institute of Medicinal and Aromatic Plants. A characteristic feature of various originschroth is a low fat content and a relatively high number of proteins and cellulose-containing substances. Previously, the authors showed that micromycetes from the VILAR collection have the ability to hydrolyze some insoluble proteins and various types of celluloses. In this regard, it is absolutely logical to try to use these biological objects for conversion of schroth.
The article shows that all the studied mycelial fungi grew well on media with the replacement of easily metabolized carbohydrate with the schroth of the roots and rhizomes of Rubia tinctorum. Micromycetes formed lysis zones during surface cultivation, which indicates the synthesis and secretion of hydrolases into environment. In the result of a detailed study of 13 fungal strains, as well as regression and correlation analysis, were selected 5 micromycetes that are promising for secondary processing of medical plant raw materials.
Key words: micromycetes, hydrolases, plant raw material, Rubia tinctorum.
For citation: Gordonova I.K., Nikitina Z.K. Mycelial fungi using for secondary processing of medicinal plant raw materials. Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry. 2020;23(6):28-33. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-06-05
REFERENCES
1. Pirogov E.E. Pravovye i organizatsionnye osnovy deyatel'nosti federal'nykh organov vlasti v sfere prirodoispol'zovaniya i okhrany okruzhayushchei sredy: Avtoref. diss. ... kand. yur. nauk. M. 2010. 29 s.
2. Rossiiskaya Federatsiya. Zakony. Ob otkhodakh proizvodstva i potrebleniya [Elektronnyi resurs]: Federal'nyi zakon ot 24.06.1998 N 89-ФЗ (red. ot 29.12.2015). SPS «Konsul'tantplyus».
3. Onifade A.A., Al-Sane N.A., Al-Mussallam A.A. A review: potentials for biotechnological application of keratin-degrading microorganisms and their enzymes for nutritional improvement of feathers and other keratins as livestock feed resorurces. Bioresource Technol. 1998; 66: 1-11.
4. Kasatkina A.N. Ispol'zovanie mul'tienzimnykh kompozitsii dlya destruktsii pivnoi drobiny. Biotekhnologiya. 2008; 2: 59-65.
5. Patent № 2393719 (RF). Sposob polucheniya biomassykormovykh drozhei. Bashashkina E.V., Panfilov V.I., Shakir I.V. 2010. 5 s.
6. Lesnovskaya E.E., Pastushenkov L.V. Farmakoterapiya s osnovami fitoterapii: Ucheb. posobie. M.: GOETAR-MED, 2003. 592 s.
7. Poyupchik T., Evert L., Ivanov A. Vozmozhosti primeneniya biologicheski aktivnykh dobavok u sportsmenov v usloviyakh vysokikh sportivnykh nagruzok. Vrach. 2019; 30(10): 24-31.
8. Medetchanov F.A., Ovsyannikov A.P., Khairyllin D.D., Mullakaev L.A. Tekhnologiya izgotovleniya lekarstvennylh form: Ucheb. posobie. Kazan': FGBOU VO Kaz. GAVM im. N.E. Баумана, 2016. 123 s.
9. Gordonova I.K., Nikitina Z.K., Zon KhuChol. Sravnitel'naya otsenka proteolitichesloi aktivnosti bakterii i mikromitsetov. Voprosy biologicheskoi, med-itsinskoi i farmatsevticheskoi khimii. 2017; 20(9): 18-24.
10. Nikitina Z.K., Gordonova I.K. Razrabotka metodicheskikh podkhodov dlya poiska produtsentov tsellyulaz. Voprosy biologicheskoi, meditsinskoi i far-matsevticheskoi khimii. 2018; 21(3): 27-31. DOI: 29296/25877313-2018-03-05.
11. Nikitina Z.K., Gordonova I.K. Otsenka tsellyulaznoi aktivnosti mikromitsetov. Voprosy biologicheskoi, meditsinskoi i farmatsevticheskoi khimii. 2018; 21(6): 20-26. DOI: 10.29296/25877313-2018-06-04.
12. Rubalko M.V., Kurkin V.A., Shmugareva A.A., San'kov A.N. Sravnitel'noe anatomo-gistologicheskoe issledovanie kornevishch i kornei mareny krasil'noi i mareny serdtselistnoi. Meditsinskii al'manakh. 2018; 6: 171-174. DOI:10.21145/2499-9954-2018-6-171-174.
13. Alyaev Yu.G., Rudenko V.I., Filosofova E.V. Sovremennye aspekty medikamentoznogo lecheniya bol'nykh mochekamennoi bolezn'yu. Urologiya. 2004; 1: 41-46.
14. Yakovleva M.B., Nikitina Z.K. Skrining-metody v biotekhnoloii (Obzor). Ch. 1. Poisk mikroorganizmov-produtsentov fermentov. Voprosy biologicheskoi, meditsinskoi i farmatsevticheskoi khimii. 2016. 4: 23-32.
15. Nikitina Z.K., Gordonova I.K. Ispol'zovanie otkhodov lekarstvennogo rastitel'nogo sur'ya dlya biotekhnologicheskogo polucheniya gidroliticheskikh. Voprosy biologicheskoi, meditsinskoi i farmatsevticheskoi khimii. 2019; 22(9): 37-42. DOI: 10.29296/25877313-2019-09-06.
