CC BY
40
УДК 619:616.9-092.9:612.017.12
В С. ВЛАСЕНКО, Н.Н. НОВИКОВА, ТА. ЯНЧЕНКО, А.А. КОЖАХМЕТОВА, С.А. ИМЕРЯКОВА
Омский аграрный научный центр, Омск
ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВАКЦИНЫ B. ABORTUS RB-51 В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА МОРСКИХ СВИНКАХ
Несмотря на улучшение эпизоотической ситуации по бруцеллезу животных в Российской Федерации данная инфекция по-прежнему занимает одно из ведущих мест среди заболеваний, представляющих экономическую и социальную угрозу. Одним из основных способов повышения эффективности проти-вобруцеллезных мероприятий является специфическая профилактика с использованием вакцин, отвечающих современным требованиям экологической безопасности иммунизирующих препаратов. Вакцина B. аЬо11ш RB-51 американского производства широко применяется для оздоровления от бруцеллеза крупного рогатого скота за рубежом, в том числе в Республике Казахстан. По результатам проведенных предварительных исследований было выявлено, что вакцина из штамма RB-51 в дозе 1 млрд КОЕ/мл предохраняла от заражения 35,6% морских свинок, а в дозе 2 млрд КОЕ/мл - 55,6%. Предметом исследовательского интереса стало изучение иммунобиологических свойств вакцины при повышении иммунизирующей дозы бруцелл. Наибольшая степень иммуногенности вакцинного штамма B. abortus RB-51 отмечена при введении 2 млрд КОЕ/мл морским свинкам (60% иммунных животных), в то же время увеличение дозы антигена до 4 млрд КОЕ/мл приводило к снижению числа животных, способных противостоять экспериментальному инфицированию, в два раза (30%), что говорит о необоснованности повышения дозы антигена для стимуляции иммунопоэза. О степени иммунной защиты также свидетельствовали параметры функционального резерва нейтрофилов, определяемые с помощью спонтанного и стимулированного вариантов постановки теста с нитросиним тетразолием (НСТ-тест). Животные, проявившие наибольшую устойчивость к заражению, имели высокую бактерицидную активность нейтрофилов. Значимым качеством вакцины из штамма B. аЬоАш RB-51 является ее инагглютинабельность по отношению к S-бруцеллезному антигену. В связи с чем рекомендуется ее использование как диагностического средства при проведении комплеса противобруцеллезных мероприятий.
Ключевые слова: вакцина, бруцеллез, иммунитет, морские свинки, НСТ-тест.
Введение
Бруцеллез в настоящее время остается одной из наиболее опасных зооантропо-нозных инфекций, которая занимает ведущее место среди заболеваний, представляющих экономическую и социальную угрозу, а также имеет стойкое неблагополучие с тенденцией к более широкому распространению [1]. Во многих регионах РФ возрос интерес к развитию животноводства, особенно у частных предпринимателей. Это порождает возможность заноса возбудителя бруцеллеза из неблагополучных территорий (Республики Дагестан, Тыва, Монголия, Казахстан и др.) в любой регион РФ. Подтверждением являются вновь объявляемые неблагополучные по бруцеллезу пункты и возникновение новых эпизоотических очагов с заболеванием людей.
Одним из способов повышения эффективности противобруцеллезных мероприятий в таких случаях могла бы стать специфическая профилактика с использованием экологически безопасных иммунизирующих препаратов. Современная вакцина должна отвечать следующим требованиям: обеспечивать защиту не менее 70% привитых животных; быть безопасной в эпизоотическом и эпидемическом аспектах; не индуцировать образования агглютинирующих антител, что позволяет отличать привитых и инфицированных животных; не вызывать сенсибилизацию при ревакцинациях; не давать побочных эффектов, а также быть технологичной для массового производства [2; 3].
© Власенко В.С., Новикова Н.Н., Янченко Т.А., Кожахметова А.А., Имерякова С.А., 2019
Вакцина B. abortus RB-51 американского производства широко применяется для оздоровления от бруцеллеза крупного рогатого скота за рубежом (в США, Канаде, Бразилии, Мексике и др., в том числе в Республике Казахстан) [4-6].
Проведенное ранее испытание этого иммунобиологического препарата А.В. Ивановым с соавторами [7] на морских свинках в дозе 1 млрд КОЕ/мл показало, что уровень иммуногенности штамма RB-51 варьирует от 50 до 87%. В то же время другими исследователями [8] был отмечен более низкий уровень иммунной защиты животных при введении этой же дозы препарата, но при увеличении дозы до 2 млрд КОЕ/мл про-тективные свойства вакцины существенно возрастали. Предметом исследовательского интереса авторов статьи стало изучение иммунобиологических свойств вакцины при повышении иммунизирующей дозы.
Задачи исследования:
1) изучить морфологические, культурально-биохимические и антигенные свойства вакцины;
2) изучить напряженность иммунитета вакцины в опыте на морских свинках при различных иммунизирующих дозах (экспериментальный период - 120 суток).
Материалы и методы
Антигенные свойства вакцинного штамма B. аЬог!ш RB-51 изучали в РАП (пластинчатой реакции агглютинации) на стекле с S- и R-бруцеллезными антисыворотками, а также путем окрашивания колоний по Уайт - Вильсону. При изучении морфологических и культурально-биохимических свойств применяли следующие тесты: окрашивание и микроскопия мазков; выращивание культур на печеночно-пептонном глюкозо-глицериновом агаре и бульоне (111 И ГА, ППГГБ, pH 6,8-7,2); определение потребности в углекислом газе; образование сероводорода; способность роста на средах с пенициллином, рифампицином, проба термоагглютинации и с акрифлавином; агглютина-бельность с монорецепторными А- и М-сыворотками; способность роста на средах с фуксином и тионином. Контролем служили штаммы В. аЬоЛш 54-70 (R-форма) и референтные штаммы В. аЬог1ш 544 (S-форма).
Ответные гуморальные реакции организма морских свинок при изучении реакто-генных свойств вакцинных штаммов определяли с помощью пробирочных реакций агглютинации (РА) и реакции связывания комплемента (РСК) с R-бруцеллезными антигенами ВНИИБТЖ [9]. S-бруцеллезные антитела в сыворотке морских свинок определяли в традиционных серологических реакциях: РА, РСК с единым антигеном, реакции иммунной диффузии (РИД) с О-ПС антигеном и экспресс-тестах: реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), роз бенгал пробе (РБП) с биофабричным и изготовленным во ВНИИБТЖ антигеном.
Иммунобиологические свойства при введении разных доз препарата изучали в опыте на 34 морских свинках, которых разделили на 4 группы. Первую группу составили 10 голов, которых подкожно привили В. аЬог!ш Rß-51 в дозе 1 млрд КОЕ/мл. Второй группе (n = 10) доза В. аЬог!ш RE-51 была увеличена до 2 млрд КОЕ/мл, а третьей (n = 10) - до 4 млрд КОЕ/мл. Остальным животным (n = 4), служившим в качестве контроля, подкожно вводили физиологический раствор в дозе 1 мл (4-я группа). Через 90 сут после вакцинации морских свинок 1-4-й групп инфицировали штаммом В. аЬог!ш 54 в 10-кратной заражающей дозе 100 микробных клеток.
Агглютинабельные свойства вакцинных штаммов В. аЬоЛш RB-51 определяли в РАП с S- и R-бруцеллезными сыворотками. Форму, окраску колоний изучали по методике Уайт - Вильсона.
Сыворотки крови исследовали до введения бруцеллезных антигенов и через 20, 40, 60 и 120 суток.
После 30 суток заражения проводили бактериологический посев патологического материала от 34 морских свинок на питательные среды с последующей дифференциацией выделенных культур бруцелл.
Оценку кислородзависимого метаболизма лейкоцитов проводили в спонтанном (без антигенной нагрузки) и индуцированном вариантах (с внесением специфического антигена) теста с нитросиним тетразолием (НСТ) фотометрическим методом. Функциональный резерв нейтрофилов рассчитывали как отношение стимулированного варианта НСТ к спонтанному [10].
Результаты исследований
Результаты исследований показали, что культура B. abortus RB-51 находится в R-форме, агглютинирует только с R-бруцеллезными антисыворотками и акрифлавином, а с S-бруцеллезными антисыворотками и физиологическим раствором дает отрицательный результат. О принадлежности к R-форме также свидетельствовала окраска колоний по Уайт - Вильсону (темно-синего цвета с неровным краем). В мазках культура имела типичный морфологический вид бруцеллы (граммотрицательная мелкая коккобак-терия), не нуждалась в повышенном содержании углекислого газа при росте на агаре, не выделяла сероводород, не росла на средах с тионином, пенициллином и росла на средах с фуксином, рифампицином, так как штамм B. аЬоЛш RB-51 рифампицино-устойчивый.
При исследовании всех сывороток крови морских свинок перед иммунизацией с помощью традиционных серологических реакций и экспресс-тестов получены отрицательные результаты, что указывает на специфичность S- и R-бруцеллезных диагности-кумов, используемых для исследований.
У экспериментальных животных всех опытных групп в сыворотке крови на протяжении 20-60 суток не были обнаружены S-бруцеллезные антитела в PA, РБП, PCK и РНГА, что характерно для инагглютиногенных вакцин, находящихся в устойчивой R-форме.
При изучении реактогенности вакцины B. аЬоЛш RB-51 на организм морских свинок установили, что высокую чувствительность имела PA с R-бруцеллезным цветным антигеном. Активный синтез R-антител в организме животных происходил на 20-40-е сутки после вакцинации: их регистрировали у 80,0-100,0% морских свинок. При исследовании сыворотки крови во всех группах на 20-е сутки титр R-агглю-тининов составлял 1 : 40-1 : 80, а на 40-е сутки - 1 : 40-1 : 320.
К 60-м суткам исследований синтез R-агглютининов в организме морских свинок 1-й и 3-й групп начал снижаться (70,0-90,0% реагирующих), в то же время у животных, иммунизированных в дозе 2 млрд KOE/мл, их определяли у всех без исключения особей в титрах 1 : 20-1 : 80. При обследовании морских свинок через 20-40 суток после иммунизации чувствительность PCK с R-бруцеллезным антигеном была ниже в сравнении с PA при использовании R-бруцеллезного антигена (60,0-90,0% реагирующих). На 60-е сутки одинаковые результаты PA и PCK с R-антигенами получены в 13-й группах, соответственно 70% в 1-й и 100% во 2-3-й группах (рис. 1).
При обследовании опытных животных после введения вирулентной культуры B. abortus 54 на 120 сутки после вакцинации в сыворотке крови как иммунных, так и зараженных морских свинок определяли S-агглютинирующие, гемагглютинирующие и комплементсвязывающие антитела. У 100% животных контрольной группы обнаружили S-бруцеллезные антитела в высоких титрах: PA - 1280 МЕ; РСК - 1 : 40-1 : 80; РНГА - 1 : 5120. В РИД с О-ПС антигеном среагировала только одна морская свинка, что свидетельствует о низкой чувствительности теста для морских свинок. Контрольные животные не реагировали с R-бруцеллезными антигенами в РА и РСК, что указывает на специфичность диагностикумов.
суток 4U суток bu суток Реакция агглютинации (PA)
20 суток 40 суток 60 суток Реакция связывания комплемента (PCK)
Рис. 1. Сравнительный анализ синтеза R-антител
Отмечено, что после введения вирулентной культуры бруцелл значительно увеличилось количество реагирующих в РБП среди животных, иммунизированных вакциной RB-51. Общее количество прореагировавших в РБП составило 61,7% (21 голова). По результатам бактериологических исследований они оказались бруцеллоносителями. После инфицирования штаммом B. аЬойш 54 у животных всех групп, иммунизированных вакциной B. аЬойш RB-51, в сыворотке крови выявляли S-гемагглютинирующие антитела у 61,7% особей, а титр гемагглютинирующих антител у отдельных животных -бруцеллоносителей составлял 1 : 1280-1 : 5120.
Среди животных 1-й группы заражение культурой бруцелл штамма B. abortus 54 установлено у 60,0% голов; 2-й группы - у 40,0% морских свинок и 3-й группы - 70% бруцеллоносителей. Культура B. аЬойш RB-51 не выделена при бактериологических исследованиях, что говорит о ее слабой приживаемости в организме морских свинок. Степень иммуногенности вакцинного штамма B. аЬойш RB-51 в зависимости от дозы введения антигена представлена на рис. 2.
■ 1 млрд f 2 млрд 4 млрд
Рис. 2. Степень иммуногенности вакцинного штамма B. abortus RB-51 в зависимости от дозы введения антигена
Анализ реакций клеточного иммунитета с помощью НСТ-теста показал, что у морских свинок на 20-е сутки, независимо от введенной дозы вакцинного штамма бруцелл, наблюдалось усиление спонтанной и стимулированной активности нейтрофилов относительно соответствующих показателей контрольной группы. Функциональный резерв нейтрофилов - показатель, характеризующий способность нейтрофила к завершенному фагоцитозу, - на 40-е сутки наблюдения незначительно снижался у особей опытных групп. Параметры кислородзависимого метаболизма нейтрофилов на 60-е сутки исследования животных опытных групп возвращались к исходному состоянию и не отличались от идентичных показателей контрольной группы.
На 30-е сутки после введения B. аЬог1ш 54 зарегистрировано усиление с высокой степенью достоверности (Р < 0,05) бактерицидной активности нейтрофилов в спонтанном и индуцированном НСТ-тесте. Однако у морских свинок, сенсибилизированных как повышенными, так и более низкими дозами вакцинного штамма B. аЬог!ш RB-51, функциональный резерв нейтрофилов существенно не превышал значений, характерных для контрольной группы. Так, этот показатель варьировал от 0,75 у морских свинок 3-й группы до 0,85 во 2-й группе, тогда как в контрольной группе он составил 0,70. Это свидетельствовало о снижении противомикробного потенциала фагоцитов и подтверждалось данными бактериологических исследований: низким уровнем иммунной защиты у 30-60% животных.
Заключение
На основании полученных результатов можно заключить, что вакцинный штамм B. abortus RB-51 является инагглютиногенным, т.к. при его введении морские свинки не отвечали выработкой S-бруцеллезных антител, определяемых в серологических реакциях: PA, PCK, PKrA, РБП с S-бруцеллезными антигенами. При изучении реакто-генности иммунобиологического препарата на организм морских свинок (с различными иммунизирующими дозами) установили, что высокую чувствительность имела реакция PA с R-бруцеллезным цветным антигеном. Активный синтез R-антител в организме животных происходил на 20-40-е сутки после вакцинации, реагировали от 80,0 до 100,0% морских свинок, что позволяет проводить диагностику в ранние сроки после вакцинации (20-40-е сутки) для контроля иммунитета. PCK с R-антигеном уступала в чувствительности PA с R-антигеном, но является ценным диагностическим тестом в более поздние, длительные сроки после иммунизации. Экспресс-тесты PKrA и РБП с S-бруцеллезными антигенами необходимо применять дополнительно для оценки благополучия по бруцеллезу животных.
Наибольшая степень напряженности иммунитета вакцины B. аЬоЛш RB-51 отмечена при введении 2 млрд KOE/мл морским свинкам (60% иммунных животных), при увеличении дозы введения антигена до 4 млрд КОЕ/мл иммунитет снижался до 30%. Таким образом, повышение дозы антигена до 4 млрд КОЕ/мл для стимуляции иммуно-поэза является неэффективным. Значимым качеством вакцины из штамма B. аЬоЛш RB-51 является ее инагглютинабельность по отношению к S-бруцеллезному антигену. В связи с чем препарат предпочтительно использовать как диагностическое средство при проведении комплекса противобруцеллезных мероприятий или в сочетании с другими, более иммуногенными вакцинами.
Параметры функционального резерва нейтрофилов также свидетельствовали о степени иммунной защиты. Животные, проявившие наибольшую устойчивость к заражению, имели высокую бактерицидную активность нейтрофилов.
V.S. Vlasenko, N.N. Novikova, T.A. Yanchenko, A.A. Kozhakhmetova, S.A. Imeryakova Omsk Agrarian Scientific Center, Omsk
Studying the Immunobiological Properties of the Vaccine B. Abortus RB-51
in an Experiment on Guinea Pigs
Despite the improvement of the epizootic situation of animal brucellosis in the Russian Federation, this infection still occupies one of the leading places among diseases representing an economic and social threat. One of the main ways to improve the effectiveness of antibrucellar measures is by means of specific prophylaxis with the use of vaccines that meet the current environmental safety requirements for immunizing drugs. The vaccine B. abortus RB-51 produced in the USA is widely used for the rehabilitation of cattle from brucellosis in other countries, including the Republic of Kazakhstan. According to the results of our preliminary studies, it has been established that the vaccine from the strain RB-51 at a dose of 1 billion CFU/ml protected 35.6% of guinea pigs from infection, and at a dose of 2 billion CFU/ml - 55.6%. Object of our research interest was the study of the immunological properties of the vaccine with an increase in the immunizing dose of Brucella. The highest level
of immunogenicity of the B. abortus RB-51 vaccine strain was observed with the introduction of 2 billion CFU/ml in guinea pigs (60% of immune animals), while increasing the dose of antigen up to 4 billion CFU/ml reduced the number of animals able to withstand experimental infection by half (30%), which indicates that an increase in the dose of antigen to stimulate immunopoiesis is unreasonable. The degree of immune protection was also testified by the parameters of the functional reserve of neutrophils, determined using spontaneous and stimulated variants of the test with nitroblue tetrazolium (NBT-test). Animals showing the highest resistance to the infection had a high bactericidal activity of neutrophils. The significant quality of vaccines of the B. abortus RB-51 strain is its inhibition as regards the S-brucella antigen; therefore, we recommend its use as a diagnostic tool when performing a system of anti-brucellar measures.
Keywords: vaccine, brucellosis, immunity, guinea pigs, NBT-test.
Список литературы
1. Эпизоотическая ситуация в РФ [Электронный ресурс] // Информационно-аналитический центр Россельхознадзора. - URL: http://www.fsvps. ru/svps/iac/rf/reports.html (дата обращения: 20.04.2019).
2. Альбертян М.П. Вакцины против бруцеллеза: настоящее, прошлое и будущее / М.П. Альбертян, А.И. Федоров, М.И. Искандаров // Российский ветеринарный журнал. - 2006. - № 4. - С. 8-11.
3. Сравнительное изучение иммуногенных свойств живых вакцин из штаммов B. abortus 19, 82 и RB-51 в опыте на морских свинках / П.К. Араке-лян [и др.] // Ветеринария. - 2017. - № 7. - С. 18-21.
4. Бейсембаев К.К. Результаты применения вакцины RB-51 в борьбе с бруцеллезом крупного рогатого скота / К.К. Бейсембаев, Р.Ш. Бейсембае-ва, Н.К. Аильжанов // Ветеринария и кормление. -2019. - № 1. - С. 18-21.
5. Dorneles E., Sriranganathan N., Lage A. P. Recent advances in Brucella abortus vaccines [Электронный ресурс] // Veterinary Research. - URL : http: //veterinaryresearch.biomedcentral.com/articles/10.1186/ s13567-015-0199-7.
6. Human Exposure to Brucella abortus Strain RB-51. - Kansas, 1997. - MMWR 47(09) ; 172-175 Publication date: 03/13/1998.
7. Иммунобиологические свойства вакцинных штаммов В. abortus / А.В. Иванов [и др.] // Ветеринария. - 2009. - № 3. - С. 27-29.
8. Результаты испытания иммунобиологических свойств противобруцеллезных вакцин из штаммов В. abortus RB-51 и В. abortus 82 / А.С. Ки-силь [и др.] // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2017. - № 4. - С. 26-30.
9. Изучение R-бруцеллезного цветного антигена в хозяйствах с разным эпизоотическим статусом / А.С. Кисиль [и др.] // Международный вестник ветеринарии. - 2018. - № 3. - С. 28-32.
10. Методы иммунологической оценки животных, сенсибилизированных измененными формами бруцелл : метод. пособие / Л.В. Дегтяренко [и др.]. - М. ; Омск, 2017. - 30 с.
Власенко Василий Сергеевич, д-р биол. наук, доц., Омский АНЦ, vvs-76@list.ru; Новикова Наталья Николаевна, канд. вет. наук, Омский АНЦ, novnik00@mail.ru; Янченко Татьяна Александровна, канд. биол. наук, Омский АНЦ, vniibtg18@rambler.ru; Кожахметова Алмагуль Айсаковна, Омский АНЦ, vniibtg18@rambler.ru; Имерякова Светлана Алексеевна, Омский АНЦ, vniibtg18@rambler.ru.
References
1. Epizooticheskaya situatsiya v RF // Informat-sionno-analiticheskiy tsentr Rosselhoznadzora. - URL: http://www.fsvps.ru/fsvps/iac/rf/reports.html (data obra-scheniya: 20.04.2019).
2. Albertyan M.P. Vaktsinyi protiv brutselleza: nastoyaschee, proshloe i buduschee / M.P. Albertyan, A.I. Fedorov, M.I. Iskandarov // Rossiyskiy veterinar-nyiy zhurnal. - 2006. - № 4. - S. 8-11.
3. Sravnitelnoe izuchenie immunogennyih svoystv zhivyih vaktsin iz shtammov B. abortus 19, 82 i RB-51 v opyite na morskih svinkah / P.K. Arakelyan [i dr.] // Veterinariya. - 2017. - № 7 - S. 18-21.
4. Beysembaev K.K. Rezultatyi primeneniya vaktsinyi RB-51, v borbe s brutsellezom krupnogo rogatogo skota / K.K. Beysembaev, R.Sh. Beysembae-va, N.K. Ailzhanov // Veterinariya i kormlenie. -2019. - № 1. - S. 18-21.
5. Dorneles E., Sriranganathan N., Lage A. P. Recent advances in Brucella abortus vaccines [Electron-nyi rosors] // Veterinary Research. - URL : http: //veterinaryresearch.biomedcentral.com/articles/10.1186/ s13567-015-0199-7.
6. Human Exposure to Brucella abortus Strain RB-51. - Kansas, 1997. - MMWR 47(09) ; 172-175 Publication date: 03/13/1998.
7. Immunobiologicheskie svoystva vaktsinnyih shtammov V. abortus / A.V. Ivanov [i dr.] // Veterinariya. - 2009. - № 3. - S. 27-29.
8. Rezultatyi ispyitaniya immunobiologicheskih svoystv protivobrutselleznyih vaktsin iz shtammov V. abortus RB-51 i V. abortus 82 / A.S. Kisil [i dr.] // Voprosyi normativno-pravovogo regulirovaniya v ve-terinarii. - 2017. - № 4. - S. 26-30.
9. Izuchenie R-brutselleznogo tsvetnogo anti-gena v hozyaystvah s raznyim epizooticheskim statu-som / A.S. Kisil [i dr.] // Mezhdunarodnyiy vestnik veterinarii. - 2018. - № 3. - S. 28-32.
10. Metodyi immunologicheskoy otsenki zhi-votnyih, sensibilizirovannyih izmenennyimi formami brutsell : metod. posobie / L.V. Degtyarenko [dr.]. -M. ; Omsk, 2017. - 30 s.
Vlasenko Vasily Sergeevich, Doc. Biol. Sci., Ass. Prof., Omsk ASC, vvs-76@list.ru; Novikova Natalia Nikolaevna, Cand. Vet. Sci., Omsk ASC, nov-nik00@mail.ru; Yanchenko Tatyana Aleksandrov-na, Cand. Biol. Sci., Omsk ASC, vniibtg18@ramb-ler.ru; Kozhakhmetova Almagul' Aisakovna, Omsk ASC, vniibtg18@rambler.ru; Imeryakova Svetlana Alekseevna, Omsk ASC, vniibtg18@rambler.ru.
