CC BY
55
Красиков Александр Пантелеевич,
д-р вет. наук, проф., Омский ГАУ, krasikovap1950@mail.ru; Трофимов Игорь Георгиевич, д-р вет. наук, проф., Омский ГАУ, Ш> fimov@omgau.ru; Алексеева Ирина Геннадьевна, канд. вет. наук, irinaalekseeva63@mail.ru.
Krasikov Alexander Panteleevich, Dr. Vet. Sci., Prof., Omsk SAU, krasikovap1950@mail.ru; Trofimov Igor Georgiyevich, Dr. Vet. Sci., Prof., Omsk SAU, trofimov@omgau.ru; Alekseeva Irina Gennadyevna, Cand. Vet. Sci., Omsk SAU, iri-naalekseeva63@mail.ru.
УДК 619:616:981.42
А.А. Новицкий, В.И. Околелов
РОЛЬ РЕАКЦИИ ИММУНОДИФФУЗИИ С О-ПОЛИСАХАРИДНЫМ АНТИГЕНОМ В ПОСТВАКЦИНАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА
Представлены результаты анализа показателей серологических реакций с сывороткой крови (реакции - агглютинации, связывания комплемента, иммунодиффузии с О-полисахаридным антигеном) от коров, многократно иммунизированных вакциной из штамма Brucella abortus 82 и химической противо-бруцеллезной вакциной в стадах с различным иммунологическим статусом и эпизоотическим состоянием по бруцеллезу - благополучные, угрожаемые, неблагополучные. Санитарными и ветеринарными правилами (1996) предусмотрена дифференциация больного и иммунизированного крупного рогатого скота с помощью реакции иммунодиффузии (РИД) с О-полисахаридным антигеном. Исследования проведены в целях изучения влияния на показатели РИД иммунологического и эпизоотологического фона. Для проверки истинной эпизоотической ситуации в стадах нами было рекомендовано исследовать сыворотку крови в РИД с О-ПС антиген в короткий срок после ревакцинации (2 мес.). При проверке 10324 проб сыворотки крови от коров благополучных стад этим методом не выделено ни одно положительно реагирующее животное, подтверждая благополучие по бруцеллезу. На официально благополучных фермах общественного скота, находившихся в угрожаемой зоне, при исследовании 20601 пробы сыворотки крови через 8-12 мес. после иммунизации вакциной из шт. 82 выделены 557 (2,7%) животных, реагирующих положительно в РИД. В стадах неиммунного скота, где регистрировали истинно больных бруцеллезом животных, эта реакция не позволяла выявить всех зараженных животных, являясь лишь индикатором наличия этой инфекции в стаде. Кроме того, установлено: в оздоравливаемых стадах РИД эффективна только в близкие сроки после вакцинации (шт. 82, химическая вакцина) на фоне достаточно высокого иммунитета по стаду. Введение химической противобруцеллезной вакцины стимулировало выработку агглютининов отдельными животными в разных титрах, которые угасали к 4 мес.
Ключевые слова: бруцеллез, дифференциальная диагностика, РИД, О-ПС антиген, вакцина из штамма 82, химическая вакцина.
Введение
Смена двадцатилетнего периода использования в специфической профилактике бруцеллеза агглютиногенного штамма В. o.bortus 19 на слабоагглютиногенный В. аЬог-tus 82 сыграла исключительную роль в оздоровлении от бруцеллеза крупного рогатого скота в Российской Федерации. Во многом этому способствовала появившаяся возможность ранней поствакцинальной диагностики бруцеллеза в фазе достаточного выраженного иммунитета (не менее 50% иммунных).
© Новицкий А.А., Околелов В.И., 2016
Однако при проведении оздоровительных мероприятий возникла проблема, связанная с экономическим ущербом от убоя здоровых животных, реагирующих на вакцину. Это потребовало совершенствования методов дифференциальной диагностики бруцеллеза.
Санитарными и ветеринарными правилами (1996) была предусмотрена дифференциация больного и вакцинированного скота путем постановки реакции иммуно-диффузии с О-полисахаридным антигеном.
Несмотря на официальное признание этого метода, многие вопросы, связанные с практическим его применением в разных эпизоотических условиях, требовали от ученых некоторого осмысления и более глубокого изучения.
Впервые R. Diaz, P. Garatea, L.M. Jones, J. Moriyon (1979) [1] был выделен поли -В антиген, с его помощью появилась возможность дифференцировать животных, реагирующих на вакцину из штамма 19, от реагирующих на естественное заражение.
J.W. Chernogrodzky, K.H. Nielsen (1988) [2] из B. abortus 1119-3 выделен О-полисахаридный антиген, который функционально не отличался от поли -В антигена и мог быть использован для дифференциации вакцинированных и больных бруцеллезом животных.
Другими исследователями В.М. Чекишевым, Ш.Р. Файзрахмановым и др. (1991) [3] с помощью мягкого гидролиза и очистки бактериальной массы штамма B. abortus 19 был получен О-ПС антиген, апробировали его в РИД в геле агара. Установлено, что РИД с О-ПС антигеном была отрицательной во всех случаях с сывороткой крови вакцинированных (штаммы 19, 82 и 104 М) животных через 1,5 мес. и далее после иммунизации [4].
Понять сущность такого феномена можно при более детальном рассмотрении химической структуры грамотрицательной микрофлоры вообще, бруцелл в частности. Клеточные стенки бруцелл представлены гидрофобными макромолекулами липополи-сахаридов, содержащих специфические О -полисахариды, связанные с ядерной коровой частью и липидом А гетерополисахаридами. О -полисахарид, отщепленный с помощью мягкого кислотного гидролиза от коровой части и липида А, оказался разным по молекулярной массе у слабовирулентных и вирулентных штаммов бруцелл. У вакцинированных штаммов бруцелл О -ПС из-за низкой массы (около 10 КДН) ведет себя как гап-тен. Однако исследователи и авторы предложенного антигена указывают на его недостатки, связанные с тем, что при введении вакцины из шт. B. abortus (19 и 82) в больших дозах или при использовании адъювантов положительные показатели РИД с О -ПС антигеном у отдельных животных могут регистрироваться через 1,5-2 мес. после иммунизации. Однако при использовании предусмотренных инструкцией по борьбе с бруцеллезом доз вакцин это не имеет практического значения [5; 8].
Известно, что Brucella abortus экспрессирует преимущественно наработку А антигена, а Brucella melitensis - М антигена, однако у различий количественный, а не качественный характер. Исключение составляют бруцеллы в стабильной R-форме (B. ovis), которые не экспрессируют синтез О-полисахаридов (О -ПС), хотя бруцеллы других видов в R-форме определенное количество О -ПС синтезируют [5]. П. А. Верши-лова (1972) [6] отмечает «...отсутствие в клетках Br. ovis липополисахаридного эндотоксина, характерного для S-форм бруцелл. В ряде серологических тестов: реакции агглютинации с адсорбированными сыворотками, реакции пассивной гемагглютинации, а также преципитации в геле, было установлено сходство Br. ovis и R-форм B. melitensis, а также небольшое антигенное родство с S-формой B. melitensis».
Анализируя литературные данные, отметим: для диагностики было взято основное свойство предложенного антигена, связанное с тем, что вирулентные (эпизоотические) и слабовирулентные (вакцинные) бруцеллы отличаются по иммунохимической структуре. Дифференцирующим эпитопом является О -цепь полисахарида S-форм бру-целл (О-ПС), присущая высокой молекулярной массе вирулентных штаммов, на которую в организме вырабатываются адекватные антитела. У слабовирулентных и диссоциированных форм бруцелл этот антиген отсутствует [7].
Улучшение эпизоотической ситуации по бруцеллезу в стране ведет к пересмотру системы борьбы с ним, в частности, к необходимости снижения жесткого антигенного прессинга с использованием живых вакцин, с заменой их на менее реактогенные -убитые.
Объекты и методы
Объектом исследования являлся крупный рогатый скот разных половозрастных групп (коровы, нетели, телки) с различным иммунологическим (невакцинированные, многократно иммунизированные вакциной из штамма Brucella abortus 82, химической вакциной) эпизоотологическим (благополучные, угрожаемые, неблагополучные) фоном. В качестве методов серологической диагностики использовали в разные сроки РА, РСК, РИД с О-ПС антигеном.
Результаты исследований
Стада, благополучные по бруцеллезу, реиммунизированные вакциной из шт. B. abortus 82. Известно, что на фоне применения противобруцеллезных вакцин, в т.ч. и вакцины из шт. B. abortus 82, некоторые здоровые животные длительно реагируют в РА и РСК в низких титрах. В связи с этим, для проверки истинной эпизоотической ситуации в таких стадах нами было рекомендовано исследовать сыворотку крови в РИД с О-ПС антигеном в короткий срок после ревакцинации (2 мес.). При проверке 10324 проб сыворотки крови от коров этим методом не было выделено ни одного положительно реагирующего животного, что подтвердило благополучие хозяйств по бруцеллезу.
Благополучные по бруцеллезу стада, реиммунизированные вакциной из шт. B. abortus 82, находившиеся в угрожаемой по бруцеллезу зоне. На официально благополучных фермах общественного скота, находившихся в угрожаемой зоне, при исследовании 20601 пробы сыворотки крови через 8-12 мес. после иммунизации вакциной из шт. 82 было выделено 557 (2,7%) животных, реагирующих положительно в РИД. В то же время в личных подворьях на этой же угрожаемой территории у неиммунного поголовья крупного рогатого скота при исследовании 1436 проб на бруцеллез положительные реакции одновременно по 3 тестам (РА + РСК + РИД) были зарегистрированы у 102 коров. РА у 191 и РСК у 161 животного, что свидетельствует о наличии бруцеллезной инфекции, затяжного характера и низкой чувствительности РИД с О-ПС-антигеном.
Благополучные по бруцеллезу стада, реиммунизированные химической вакциной трехкратно - схема № 1; иммунизированные однократно химической вакциной по фону вакцины из шт. 82 - схема № 2.
Введение химической противобруцеллезной вакцины по схеме 1 стимулирует выработку агглютининов отдельными животными в разных титрах. Так, в пробирочной РА на 21-е сут антитела выявлены у 61,6% животных. У 5,5% коров титры РА были 200 МЕ и выше, которые угасли к 4 мес. Комплементсвязывающие вещества, улавливаемые в РСК на 21 -е сут - составляли 11,7%, (в основном 1 : 5), которые также угасли к 4 мес. Сочетанное применение живой вакцины из шт. 82 на телках двукратно с после-
дующей реиммунизацией химической противобруцеллезной вакциной стимулировало выработку агглютининов, улавливаемых в РА на 21-е сут у 58,0% при отсутствии реагирующих РА 200 МЕ и выше. Через 1,5 мес. в РА регистрируется увеличение титров агглютининов - РА 200 МЕ - 2,7% с угасанием к 3-4 мес. Комплементсвязывающие вещества, улавливаемые в РСК, регистрировали на 21-е сут в 47,2% (в титрах - 1 : 10 -6,2%), через 1,5 мес. 11,0% (в титрах 1 : 10-0,7%) и угасают к 4 мес. -11,4% (только 1 : 5). Не были выявлены антитела, регистрируемые в РИД с сывороткой крови и КР с молоком (табл. 1).
Таблица 1
Показатели РИД с О-ПС антигеном на бруцеллез в близкие сроки после реиммунизации ХВ и сочетанного использования вакцины из шт. 82 и ХВ в благополучных по бруцеллезу стадах
Сроки Результаты исследований
Эпизоотическая Иммунный фон после Кол-во (количество реагирующих, %)
ситуация реиммуни- проб РА МЕ, % РСК, титры РИД
зации 50/100 200 1 : 5 1 : 10 положительная
Схема № 1 ХВ + ХВ + ХВ ежегодно 21 сут 162 56,1 5,5 11,7 - 0
1,5 мес. 274 23,4 4,1 12,7 - 0
2 мес. 481 22,8 - 1,8 - 0
Благополучные 4 мес. 393 22,1 0,2 2,5 - 0
Схема № 2 82 + 82 + ХВ ежегодно 21 сут 239 58,0 - 41,0 6,2 0
1,5 мес. 145 42,3 2,7 10,3 0,7 0
3,5 мес. 140 29,4 - 11,4 - 0
1834
Благополучные по бруцеллезу стада, реиммунизированные химической вакциной, находившиеся в угрожаемой по бруцеллезу зоне.
При проведении фоновых исследований сыворотки крови от всех возрастных групп крупного рогатого скота: телят, телок, нетелей и коров 3 гуртов был получен результат: перед иммунизацией (в отдаленные сроки - 7 мес.) выявлено: в РА - 50 МЕ -8,2%; 100 МЕ - 4,8%; 200 МЕ - 0,7%; 400 МЕ - 1,0% реагирующего на бруцеллеза скота. РСК 1/5 - 10,3%; 1 : 10 - 3,0%; 1 : 20 - 2,4%; 1 : 20 - 2,4 процента. В то время как в РИД с О-ПС антигеном только 1,0% больного скота. Данные свидетельствуют, что показатели РИД с О -ПС-антигеном не отражают объективную ситуацию по бруцеллезу и отстают по чувствительности от показателей реакции агглютинации и реакции связывания комплемента.
Эпизоотическая ситуация по бруцеллезу (коровы). В близкие после использования химической вакцины сроки исследовано 1237 проб сыворотки крови и максимальное выделение больного скота зарегистрировано через 14 сут - 12 гол (4,4%), через 21 сут - 9 гол (2,7%) (табл. 2).
Таблица 2
Эпизоотическая ситуация по бруцеллезу (коровы)
Группа Количество Срок исследования Результаты серологических реакций в %
РИД РА МЕ РСК титры
50 100 200 5 10 20
Коровы 291 7 мес. 1,0 8,2 4,8 0,7/1,0 10,3 3,0 2,4/2,4
Иммунизация ХВ 28.04.11 г.
Коровы 86 7 сут 0 8,1 5,8 1,1 17,4 3,4 0
Коровы 267 14 сут 4,4 21,7 38,5 17,2/1,1 25,0 11,9 8,6/1,4
Коровы 332 21 сут 2,7 24,3 2,2 28,3/2,4 14,7 6,9 4,5/0,6
К + т 499 1,5-2 мес. 0,8 17,4 9,8 0 5,8 1,8 0,6
Коровы 344 4-5 мес. 0,5 18,3 6,9 0 1,5 4,0 0
Эпизоотическая ситуация по бруцеллезу (телок). В отдаленные сроки (7-8 мес.) после иммунизации исследовано 218 гол и выявлено 3 гол (2,8%). В короткие сроки исследования не проводили; первое исследование - через 3 мес. после иммунизации ХВ, установлено 12 (11,4%) больных телок перед осеменением. Через 4 мес. еще зарегистрированы животные, реагирующие в РИД - 2,0%.
Заключение
Проведенные исследования по изучению диагностической эффективности О -по-лисахаридного антигена в стадах, многократно иммунизированных живой противо-бруцеллезной вакциной из шт. B. abortus 82 и химической противобруцеллезной вакциной, с учетом различного иммунного фона (благополучные и неблагополучные) позволили заключить следующее.
Через 2 мес. после многократной реиммунизации вакциной из шт. B. abortus 82 у коров в благополучных по бруцеллезу стадах положительные показатели РИД с О-ПС антигеном не зарегистрированы.
В благополучных по бруцеллезу стадах, трехкратно реиммунизированных химической вакциной по фону вакцины из шт. 82, в последующем не зарегистрирован синтез антител, улавливаемых РИД, начиная с 21 -х сут.
Положительные показатели РИД с О -ПС антигеном совпадают с высокими титрами РА и РСК, но дополнительно не выявляют реагирующих животных и по чувствительности отстают от показателей РА и РСК в отдельности.
В оздоравливаемых стадах РИД эффективна только в близкие сроки (1-3 мес.) после вакцинации (шт. 82, химическая вакцина) на фоне достаточно высокого иммунитета по стаду после провокации скрытого течения бруцеллеза. В отдаленные сроки (6-12 мес.) при выявлении больных бруцеллезом животных достаточно пользоваться результатами РА и РСК как более чувствительных методов.
A.A. Novitsky, W.I. Okolelov
Role of reaction of the immunodiffusion with O-polisaharidnym the antigen in postvaccinal diagnostics brucellosis
Results of the analysis of indexes of serological tests with blood serum (an agglutination test, a reaction of binding complement, reaction of an immunodiffusion with O-polisakharidnym an antigen) from cows, multiply the immunizirovannykh a vaccine from the strain of Brucella abortus 82 and a chemical antibrucella vaccine in herds with various immunologic status and an epizootic state on a brucellosis - safe, threatened, unsuccessful are presented. Health and veterinary regulations (1996) provided differentiation of sick and immunizirovanny cattle by means of reaction of an immunodiffusion (RID) with About - a polisakharidny antigen. Researches were conducted for studying of influence on indicators of RID of an immunologic and epizootological hum noise. For check of the true epizootic situation in herds, us it was recommended to investigate blood serum in RID with O-PS an antigen in a short space of time after a revaccination (2 months). When checking 10324 tests of blood serum from cows the blagpoluchnykh of herds with this method it was not allocated any positively the reacting animal that confirmed their wellbeing on a brucellosis. On officially safe farms of the public cattle which were in the threatened zone at a research of 20601 tests of blood serum in 8-12 months after immunization with a vaccine from piece 82 it was allocated 557 (2,7%) the animals reacting positively in RID. In herds of the neim-munny cattle where recorded animals truly sick with a brucellosis, this reaction did not allow to reveal all infected animals, and was only the indicator of existence of this infection in herd. Besides, it was established that in the revitalized herds of RID it is effective only in the close terms after vaccination (piece 82, a chemical vaccine) against the background of rather high immunity on herd. Introduction of a chemical antibrucella vaccine stimulated production of agglutinins certain animals in different titres which died away by 4 months.
Keywords: brucellosis, differential diagnostics, RID, O-PS an antigen, a vaccine from the strain 82, a chemical vaccine.
Список литературы
1. Radial immunodifusion test with a Brucella polysaccharide antigen for differentiating infected from vaccinated cattle / R. Diaz at al // J. Clin. Microbiol. - 1979. - V. 10. - P. 37-41.
2. Cherwonogrodzky J.W. Brucella abortus 1119-3 O-chain polysaccharide to differentiate sera from B. abortus S-19 - Vaccinated and fieldstrain infected cattle by agar gel immunodiffusion / J.W. Cherwonogrodzky, K.H. Nielsen // J. Clin. Mic-rob. - 1988. - V. 26, № 6. - P. 1120-1123.
3. Пат. 2035188., 6А61К 39/10. Способ получения антигена для дифференциальной диагностики вакцинированных и больных бруцеллезом животных / М.Л. Филиппенко, Е.А. Киселев,
B.М. Чекишев, Ш.Р. Файзрахманов // Открытия. Изобретения. - 1995. - № 14.
4. Дифференциация вакцинированных и больных бруцеллезом животных / В.М. Чекишев [и др.] // Ветеринария. - 1993. - № 8. - С. 25-32.
5. Чекишев В.М. Проблемы серологической диагностики бруцеллеза животных / В.М. Чеки-шев // Актуальные проблемы ветеринарной медицины в России : сб. науч. тр., посвящ. 100-летию вет. науки в России и 30-летию СО РАСХН / РАССХН. Сиб. отд-ние. - Новосибирск, 1998. -
C. 273-282.
6. Бруцеллез / под ред. акад-ка АМН СССР П.А. Вершиловой. - Москва : Медицина, 1972. -439 с.
7. Оценка эпизоотической ситуации в стадах с помощью О-ПС антигена в радиальной им-мунодиффузии (РИД) / Т.Г. Попова [и др.] // Актуальные проблемы инфекционных, паразитарных и незаразных болезней домашних животных и меры борьбы с ними : матер. юбил. науч.-произв. конф. сотрудников и аспирантов / ОмГАУ. - Омск, 1998. - С. 268-272.
8. Diaz R. Radial immunodifusion test with a Brucella polysaccharide antigen for differentiating infected from vaccinated cattle / R. Diaz, P. Garatea, L.M. Jones // J. Clin. Microbiol. - 1979. - V. 10. -P. 37-41.
Новицкий Алексей Алексеевич, д-р вет. наук, проф., Омский ГАУ, lescheva@list.ru; Око-лелов Владимир Иванович, д-р вет. наук, проф., Омский ГАУ.
References
1. Radial immunodifusion test with a Brucella polysaccharide antigen for differentiating infected from vaccinated cattle / R. Diaz at al // J. Clin. Microbiol. - 1979. - V. 10. - P. 37-41.
2. Cherwonogrodzky J.W. Brucella abortus 1119-3 O-chain polysaccharide to differentiate sera from B. abortus S-19 - Vaccinated and fieldstrain infected cattle by agar gel immunodiffusion / J.W. Cherwonogrodzky, K.H. Nielsen // J. Clin. Mic-rob. - 1988. - V. 26, № 6. - P. 1120-1123.
3. Pat. 035188., 6A61K 39/10. Sposob polu-chenija antigena dlja differencial'noj diagnostiki vakcinirovannyh i bol'nyh brucellezom zhivotnyh / M.L. Filippenko, E.A. Kiselev, V.M. Chekishev, Sh.R. Fajzrahmanov // Otkrytija. Izobretenija. -1995. - № 14.
4. Differenciacija vakcinirovannyh i bol'nyh brucellezom zhivotnyh / V.M. Chekishev [i dr.] // Veterinarija. - 1993. - № 8. - S. 25-32.
5. Chekishev V.M. Problemy serologicheskoj diagnostiki brucelleza zhivotnyh / V.M. Chekishev // Aktual'nye problemy veterinarnoj mediciny v Rossii : sb. nauch. tr., posvjashh. 100-letiju vet. nauki v Rossii i 30-letiju SO RASHN / RASSHN. Sib. otd-nie. - Novosibirsk, 1998. -S. 273-282.
6. Brucellez / pod red. akad-ka AMN SSSR P.A. Vershilovoj. - Moskva : Medicina, 1972. -439 s.
7. Ocenka jepizooticheskoj situacii v stadah s pomoshh'ju O-PS antigena v radial'noj immuno-diffuzii (RID) / T.G. Popova [i dr.] // Aktual'nye problemy infekcionnyh, parazitarnyh i nezaraznyh boleznej domashnih zhivotnyh i mery bor'by s nimi : mater. jubil. nauch.-proizv. konf. sotrudnikov i aspi-rantov / OmGAU. - Omsk, 1998. - S. 268-272.
8. Diaz R. Radial immunodifusion test with a Brucella polysaccharide antigen for differentiating infected from vaccinated cattle / R. Diaz, P. Garatea, L.M. Jones // J. Clin. Microbiol. - 1979. - V. 10. -P. 37-41.
Novitsky Alexey Alexeyevich, Dr. Vet. Sci., Prof., Omsk SAU, lescheva@list.ru; Okolelov Vladimir Ivanovich, Dr. Vet. Sci., Prof., Omsk SAU.
