CC BY
23УДК 577.144.4:615.281
И.Н. Полякова1, Б.В. Москвичев2, А.И. Гинак3
Ремантадин в настоящее время широко используется в виде таблеток при лечении гриппа и ОРЗ, причем из вирусов гриппа он действует только на вирус гриппа А, также оказывает подавляющее действие и на вирусы Herpes simplex типа I и II и вирусы клещевого энцефалита.
Ремантадин представляет собой солянокислую соль первичного амина (а-метил-1-адамантил-метиламина) (C12H21N HCI) с молекулярной массой равной 215,77. Его структурная формула изображена на рисунке 1:
HNH2 - HCl
Рисунок 1. Структурная формула ремантадина.
В России запатентовано несколько полимерных производных ремантадина (Полирем, Альгирем), причем на основе одного из патентов выпускается лекарственная форма в виде сиропа (Альгирем). Необходимо отметить, что эти полимерные соли ремантадина представляют собой всего лишь соли полимерной кар-боновой кислоты и ремантадина как основания. Поскольку соль слабой кислоты и слабого основания легко гидролизуется в водной среде, то некоторое изменение физико-химических и биологических свойств ремантадина в такой форме может быть обусловлено всего лишь меньшей растворимостью полимерной соли по сравнению с хлоридом исходного основания.
ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ
МОДИФИКАЦИИ
РЕМАНТАДИНА
С ПОМОЩЬЮ ПОЛИСАХАРИДОВ
Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактериальных препаратов 198320, Санкт-Петербург, г. Красное Село, ул. Свободы, д. 52
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет) 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., д.26
Изучено химическое модифицирование ремантадина с помощью декстрана-полиглюкина. Показано что ремантадин при взаимодействии с окисленным полиглюкином образует полимерное растворимое производное - модифицированный ремантадин (МР). При испытаниях на куриных эмбрионах установлено, что острая токсичность модифицированного ремантадина в 20 меньше исходного ремантадина. При лечении мышей, зараженных вирусом, модифицированный ремантадин показал высокий уровень защиты животных. Дальнейшее изучение МР позволит определить возможность применения в медицине.
Ключевые слова: ремантадин, модификация, декстран, противовирусная активность, вирусы гриппа.
Представляло интерес изучить влияние нейтральной полимерной матрицы ковалентно связанной с ремантадином на его свойства. Поскольку ремантадин представляет собой соль первичного амина как основания и соляной кислоты, то в своей работе мы использовали ранее разработанный нами подход [1, 2] при образовании ковалентной связи между первичной £-аминогруппой остатков лизина в молекуле белков-ферментов и карбонильной группой гидрофильного полимера.
Взаимодействие белков с предварительно активированным полиглюкином происходит с образованием ^замещенного имина (основания Шиффа), возникающего в результате реакции между альдегидными группами полимера и аминогруппами фермента. Активация биополимера осуществлялась окислением глюкопира-нозных звеньев декстрана-полиглюкина перйодатом калия до альдегидных групп. Схема окисления и дальнейший синтез полимерного производного белка изображены на рисунке 2. Отметим, что восстановление связей -СН=N- в продукте реакции осуществлялось так, чтобы происходила не только их полная трансформация в -СН^Н- связи, но и трансформация избытка альдегидных (непрореагировавших) - СНО-групп до первичных спиртовых групп - СН2ОН. В реакцию восстановления боргидрид натрия (калия) брали в двухкратном избытке по отношению к количеству альдегидных групп. Содержание альдегидных групп в активированном полиглюкине, а также содержание невосстановленных альдегидных групп в модифицированных белках оценивали потенциометрическим методом, основанном на реакции взаимодействия этих групп с гидроксиламином, сопровождающейся высвобождением кислоты.
1 Полякова Ирина Николаевна, науч. сотр. ФГУП СПбНИИВС, e-mail: irina-polya@yandex.ru
Москвичев Борис Васильевич, д-р хим. наук, проф., зам. директора ФГУП СПбНИИВС, e-mail: moskvichev.36@mail.ru Гинак Анатолий Иосифович, д-р хим. наук, проф., зав. кафедрой молекулярной биотехнологии СПбГТИ(ТУ) e-mail: mbt@lti-gti.ru
Дата поступления 16 октября 2009 года
щ
Й он
'КЩ
РНЦ5
-н,с он
¿ту
и он I н V-0 -1 н
п-у
с=о ХЖ С--0
РИ&,Ь
У
ЪЫНч , рн ¿,6-9,0
У-Р
-их
0£>
н он
Лс
ОШ- Б 1)^0 И СН20Н
у
СИг0Й
С/{ОН
У
1-р
Рис. 2. Схематическое изображение реакций процесса синтеза модифицированного полиглюкином белкагде ПГ -полиглюкин, п -100 мол. % звеньев ПГ, р - мол. % - ИНг групп белка, принимающих участие в ковалентном связывании, Б — нативный белок, у = 20 мол. % окисленных звеньев
ПГ.
На начальном этапе изучения модификации ремантадина было выбрано молярное соотношение окисленного декстрана-полиглюкина и ремантадина аналогичное тому, которое было апробировано ранее при связывании белков и полисахаридов, и равное [СО] / [1МН2] ~ 4,4 [2]. Для этого был приготовлен 5%-ный раствор полиглюкина, затем при комнатной температуре и перемешивании магнитной мешалкой, был добавлен мелкорастертый перйодат калия. Полученный окисленный активированный полиглюкин был очищен ультрафильтрацией через полые волокна ВПХ-15 Па на установке УПЛ-0,6. Степень очистки контролировалась спектрофотометрически по оптической плотности (Р) при длине волны 235 нм до величины 0235 < 0,25. Степень окисления полиглюкина составила у=1б,8 %.
Далее в очищенный активированный полиглюкин при комнатной температуре была добавлена субстанция ремантадина и затем медленно добавлен углекислый натрий, до рН 10,0-10,2, после чего раствор перемешивали в течение часа. Восстановление азометино-вых связей, образовавшихся между атомом азота в ремантадине и атома углерода в карбонильной группе окисленного полиглюкина, проводилось боргидридом натрия. Полученный раствор модифицированного ремантадина был очищен аналогично - ультрафильтрацией через полые волокна ВПХ-15 Па на установке УПЛ-0,6. Степень очистки контролировалась рН-метрически до рН раствора 8,0-8,2. Для анализа модифицированного ремантадина были отобраны пробы во флаконы с последующей лиофильной сушкой.
При хроматографическом исследовании образовавшегося продукта на колонке размером 50x1,2 см с гелем в-75 было показано, что, действительно, зона ремантадина находится во фракциях высокомолекулярных веществ, что доказывает химическую связь ремантадина с высокомолекулярным полиглюкином. Из данных, приведенных на рисунке 3 видно, что зона исходного ремантадина соответствует 62,5 мл, а пик зоны полимерного ремантадина (24 мл), практически совпадает с зоной голубого декстрана (24 мл). Полученное высокомолекулярное производное ремантадина было охарактеризовано по соотношению ремантадина и полиглюкина в зависимости от условий его получения.
Рис. 3. Гэль - хроматограмма исходного ремантадина (г), голубого декстрана (вертикальная линия, соответствующая 24 мл), ремантадина (+) связанного с полиглюкином (Ш ). Колонка размером 50 х 1,2 см заполнена се-фцдексом в-75.
При фиксированной величине концентрации исходного полиглюкина равной 50 мг/мл и ремантадина - 5 мг/мл при рН раствора 10,0 варьировалась степень окисления декстрана от 1,5% до 16,8%. Полученный модифицированный ремантадин диафильтрацией на установке УПЛ-0,6 обессоливали, и полученный раствор высушивали лиофильно. В высушенном продукте определяли содержание ремантадина после сжигания по методу Кьельдаля [3], а полисахаридную составляющую с помощью антронового реагента [4].
На рисунке 4 показана зависимость содержания ремантадина в процентах в конечном высушенном продукте от степени окисления полисахарида. Эта зависимость изображается пологой прямой, что говорит о слабой зависимости содержания ремантадина от степени окисления исходного декстрана.
Рис. 4. Зависимость содержания ремантадина в его полимерной форме от степени окисления полиглюкина в исходном растворе.
На рисунке 5 приведена зависимость содержания ремантадина от соотношения альдегидных групп окисленного полиглюкина и аминных групп исходного ремантадина, взятых в реакцию. Видно, что количество связанного ремантадина пропорционально увеличению именно концентрации альдегидных групп в исходном растворе.
Рис. 5. Зависимость содержания ремантадина в его полимерной форме от соотношения альдегидных и аминогрупп, реагирующих компонентов в исходной смеси.
На рисунке 6 приведена зависимость содержания ремантадина в полимерной форме от концентрации полиглюкина в исходной смеси при постоянной степени окисления исходного полиглюкина. Совершенно определенно доля ремантадина в конечном продукте падает при увеличении исходной концентрации полисахарида в растворе.
го 60
и
г "
* 30
го ю о
Рис. 6. Зависимость доли ремантадина в конечном продукте от содержания полиглюкина в исходном растворе.
Итак, можно убедительно утверждать, что ранее предложенный нами метод модификации белков окисленными полисахаридами оказался действенным и в реакции между низкомолекулярным амином - ремантадином и окисленным полиглюкином.
Большой интерес представляет влияние полимерной химической модификации ремантадина на его основные биологические свойства. Для исследования биологических свойств был выбран образец полимерного производного, в котором доля ремантадина составляла 10 %, остальные 90 % - декстран.
В экспериментах по изучению токсичности модифицированного ремантадина на куриных эмбрионах (КЭ) препарат в дозах 15,0 мг/кэ; 7,5 мг/кэ; 4,0 мг/кэ; 1,0 мг/кэ; 0,25 мг/кэ; 0,05 мг/кэ; 0,005 мг/кэ при введении в хорионаллантоисную полость 9-10-дневных эмбрионов не вызывал их гибели. Ранняя гибель куриных эмбрионов (2-4 дня инкубации) и поздняя гибель куриных эмбрионов (5-10 дней инкубации) не наблюдалась (0% во всех группах). Вылупляемость цыплят во всех группах, включая контрольную, составила 80-90%. Таким образом, модифицированный ремантадин не проявлял раннего и позднего токсического действия на куриных эмбрионах.
Определение противовирусной активности производили на развивающихся куриных эмбрионах. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1. Индекс защиты на модели куриных эмбрионов.
Таким образом, на модели куриных эмбрионов модифицированный ремантадин превосходит по противовирусному действию ремантадин против штаммов вируса гриппа A A/New Caledonia/20/99 (H1N1), A/Pr/8/34/ (H0N1) и штамма вируса гриппа В B/Ya-manashi/166/98.
Определение острой токсичности проводили в опытах на мышах. Определение токсичности модифициро-
ванного ремантадина и ремантадина - субстанции на мышах показало, что: LD50 модифицированного ремантадина составляет 740 мг/кг, LD50 ремантадина - субстанции составляет 36 мг/кг.
Определение противовирусной активности в опытах на мышах показало что модифицированный ремантадин превосходит ремантадин при лечении мышей, зараженных вирусом гриппа типа А А/Рг/8/34 ^N1) при внутривенном введении препаратов в изученных дозах. В диапазоне доз от 60 до 300 мг/кг модифицированный ремантадин показывал стабильно высокий уровень защиты животных.
Результаты изучения противовирусной активности модифицированного ремантадина и ремантадина на мышах приведены ниже в таблице 2.
Таблица 2. Противовирусная защита мышей в зависимости от формы ремантадина..
Группа Доза мг/кг Количество выживших животных/ исходное количество животных (в скобках % от исходного количества животных)
Время между заражением и введением исследуемых субстанций, часы
I4 48 И
Контроль 8/Ю (4С%) 5/Ю £5 %) 1Q/IQ (5Q%)
Ремантадин 1Ю 1Q/IQ (5Q%) I/M (1Q %) 1Q/IQ (5Q%)
Модифицированный ремантадин 3Q 4/Ю (Ю%) 4/Ю (Ю%) 18/IQ(9Q%)*
Модифицированный ремантадин 6Q 18/IQ(9Q)* Ю/Ю (1QQ)* 18/IQ(9Q%)*
Модифицированный ремантадин 15Q 15/Ю (75%) 17/Ю (85 %)* Ю/Ю (1QQ %)*
Модифицированный ремантадин 3QQ 18/Ю (9Q%)* 14/Ю (7Q %)* Ю/Ю (1QQ %)*
Таким образом, первые оценки биологической активности нового продукта - модифицированного ремантадина показали интересные отличия при переходе от основного низкомолекулярного вещества к новой полимерной форме.
Авторы благодарны А.А. Гаврилову за проведение биологических тестов с модифицированным ремантадином.
Литература
1. Тенникова Т. Б., Панарин Е.Ф., Миргородская О.А., Самсонов Г.В., Москвичев Б.В. // Иммобилизация протеолитического фермента террили-тина на водорастворимой полимерной матрице. // Хим.-фарм. журн. 1977. Т. 11. Вып. 7. С. 86-90.
2. Тенникова Т. Б., Москвичев Б. В., Самсонов Г.В. // Изучение физико-химических свойств протеолитического фермента террилитина, модифицированного сополимером на основе ви-нилпирролидона. // Биохимия. 1980. Т. 45. Вып. 3. С. 438-448.
3. ФС 42-3874-99. Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов. Фармакопейная статья. М.: МЗ РФ, 1999. С. 2.
4. Roe J.H. The determination of dextran in blood and urine with anthrone reagent. // J. Biol. Chem. 1954. Vol. 208. N.2. P. 889-896.
Индекс защиты, %
Штамм вируса Модифицированный
Исходный
ремантадин ремантадин
A/Moscow/1Q/99 (H3NI) 7Q 7Q
A/New Caledonia/IQ/99 (H1N1) 1QQ Q
А/РГ/8/34/ (HQN1) 1QQ Q
B/Yamanashi/166/98 5Q 9
