CC BY
46
фекта необходимо правильно выбирать курсовую дозу. При более высоких курсовых дозах, которые были достигнуты четырехкратным подкожным введением препарата, ингибирующий лечебный эффект МР стал очевидным.
Авторы благодарны Е.М. Дементьевой за статистическую обработку результатов.
Список литературы:
1. Иммобилизация протеолитического фермента террилитина на водорастворимой полимерной матрице / Т.Б. Тенникова [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. - 1977. - Т. 11, Вып. 7. - С. 86-90.
2. Изучение физико-химических свойств протеолитического фермента террилитина, модифицированного сополимером на основе винилпирролидо-на / Т.Б. Тенникова [и др.] // Биохимия. - 1980. - Т. 45, Вып. 3. - С. 438-448.
СИНТЕЗ И ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ МОДИФИЦИРОВАННОГО РЕМАНТАДИНА
© Полякова И.Н.*, Шитикова Г.СД Нынь И.В.*
Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов Федерального медико-биологического агентства, г. Санкт-Петербург
Изучали химическую модификацию ремантадина (Р) с помощью декстрана-полиглюкина. Показано что Р при взаимодействии с окисленным полиглюкином образует полимерное растворимое производное (МР). При испытании на куриных эмбрионах МР обладает токсичностью в 20 раз меньшей исходного Р. При лечении мышей, зараженных вирусом, МР показал высокий уровень защиты животных. Коэффициент защиты мышей, зараженных клещевым энцефалитом, при использовании МР в 1,4 раза выше, чем у исходного Р. Дальнейшее изучение МР позволит определить возможность применения в медицине.
Ремантадин (Р) представляет собой солянокислую соль а-метил-1-адамантил-метиламина и используется в настоящее время (в виде таблеток) при лечении гриппа и ОРЗ. Препарат оказывает угнетающее действие только на вирус гриппа типа А, а также на вирусы Herpes simplex типа I и II, вирусы клещевого энцефалита.
* Научный сотрудник НПК «Новые лекарственные формы».
♦ Руководитель научно-производственного комплекса «Вирусные препараты», кандидат медицинских наук.
" Директор.
Представляло интерес изучить, как повлияет нейтральная полимерная матрица, ковалентно связанная с ремантадином, на его свойства. Поскольку Р представляет собой соль первичного амина как основания и соляной кислоты, то в своей работе мы использовали ранее разработанный нами подход [1-3] при образовании ковалентной связи между первичной е-аминогруппой остатков лизина в молекуле белков-ферментов и карбонильной группой гидрофильного полимера.
Взаимодействие Р с предварительно активированным полиглюкином происходит с образованием М-замещенного имина (основания Шиффа), возникающего в результате реакции между альдегидными группами полимера и аминогруппой Р. Активация биополимера осуществлялась окислением глюкопиранозных звеньев декстрана-полиглюкина перйодатом калия до альдегидных групп. Отметим, что восстановление связей -СН=М в продукте реакции осуществляли так, чтобы происходила не только их полная трансформация в -СН2-ЫН- связи, но и трансформация избытка альдегидных групп (непрореагировавших) - до первичных спиртовых -СН2ОН. В реакцию восстановления боргидрид натрия (калия) брали в двухкратном избытке по отношению к количеству альдегидных групп.
На начальном этапе изучения модификации Р мы выбрали молярное соотношение окисленного декстрана - полиглюкина и ремантадина по аналогии с тем, которое было апробировано при связывании белков и полисахаридов, равное [СО] / [КН2] ~ 4,4. [2]
При хроматографическом исследовании образовавшегося продукта на колонке размером 50 х 1,2 см с гелем в-75 было показано, что, действительно, зона Р находится во фракциях высокомолекулярных веществ. То есть, Р оказался химически связанным с высокомолекулярным полиглюкином.
Большой интерес представляло изучить влияние полимерной химической модификации на основные биологические свойства Р. Для исследования токсичности модифицированного ремантадина (МР) был взят образец полимерного производного, в котором доля Р составляла 10 %, остальные 90 % - декстран.
Изучение токсичности МР на куриных эмбрионах (КЭ) проводили при введении препарата в дозах 15,0 мг; 7,5 мг; 4,0 мг; 1,0 мг; 0,25 мг; 0,05 мг и 0,005 мг в хорионаллантоисную полость 9-10-дневных эмбрионов. На каждую дозу препарата использовали 10 куриных эмбрионов.
Определение противовирусной активности производили на развивающихся КЭ (по 10 куриных эмбрионов на каждый препарат).
Определение острой токсичности проводили в опытах на мышах массой 15-20 г. В каждую группу брали по 10 животных.
Действие МР на вирус клещевого энцефалита изучали на препаратах содержащих 20 % Р и 80 % декстрана-полиглюкина. В каждую группу брали по 20 животных.
Опыты на мышах проводили по методике описанной В.И. Ильенко [4] следующим образом. Концентрация Р в растворах модифицированного и исходного ремантадина была выбрана одинаковой из расчета по исходной субстанции - 0,1 %. На каждую мышь подкожно вводили 0,2 мл раствора.
Белым мышам, зараженным вирусом клещевого энцефалита (КЭ) (штамм Абсеттаров), вводили Р или МР за 24 и 1 час до заражения и через 24, 48 и 72 часа после заражения. В контроле вместо препарата использовали 0,9 % раствор натрия хлорида.
На рис.1 показана хроматограмма МР в сравнении с исходным ремантадином и голубым декстраном. Видно, что зона МР практически совпадает с зоной высокомолекулярного голубого декстрана. В то же время зона исходного Р характеризуется большим объемом (64 мл) удерживания. Таким образом, действительно, МР представляет собой высокомолекулярный продукт ковалентно связанного Р с окисленным декстраном.
100 <30 80 /0 60
S 50 ■10 30 20 10 о
0 3 16 24 32 40 43 56 64 72 30 SS 96 104 112 120
мл
Рис. 1. Гель - хроматограмма исходного Р (♦), голубого декстрана (вертикальная линия, соответствующая 24 мл), Р (•) связанного с полиглюкином (■)
Колонка размером 50 х 1,2 см заполнена сефадексом G-75.
Полученное высокомолекулярное производное Р предстояло охарактеризовать в зависимости от условий его получения по соотношению Р и полиглюкина.
При введении МР в куриные эмбрионы было обнаружено, что ранняя гибель куриных эмбрионов (2-4 дня инкубации) и поздняя гибель КЭ (5-10 дней инкубации) не наблюдалась. Вылупляемость цыплят во всех группах, включая контрольную, составила 80-90 %. Таким образом, МР не проявлял раннего и позднего токсического действия на куриных эмбрионах.
В табл. 1 представлены результаты по изучению действия МР и Р на КЭ зараженные различными штаммами вируса гриппа.
Таблица 1
Индекс защиты на модели куриных эмбрионов
Штамм вируса Индекс защиты, %
МР Р
A/Moscow/10/99 (H3N2) 70 70
A/New Caledonia/20/99 (H1N1) 100 0
А/Рг/8/34/ (H0N1) 100 0
B/Yamanashi/166/98 50 9
Примечание: р < 0,05.
Индекс защиты (ИЗ) определяется по формуле:
КЗ -1
ИЗ =--100%
КЗ
где КЗ - коэффициент защиты, равный отношению показателя летальности в контроле к показателю летальности в опыте.
При лечении мышей, зараженных вирусом гриппа типа А - А/Рг/8/34 (И0Ш), при внутривенном введении препаратов в изученных дозах от 60 до 300 мг/кг МР показывал стабильно высокий уровень защиты животных.
Таким образом, первые оценки биологической активности нового продукта - МР показали интересные отличия при переходе от основного низкомолекулярного вещества к новой полимерной форме.
Определение токсичности МР и Р на мышах показало, что: средняя смертельная (летальная) доза токсического вещества, необходимая для того, чтобы погибла половина группы испытуемых животных (ЬБ50) МР составляет 740 мг/кг, ЬБ50 Р составляет 36 мг/кг.
Результаты изучения противовирусной активности МР и Р на мышах приведены в табл. 2.
Таблица 2
Противовирусная защита мышей в зависимости от формы Р
Количество выживших животных / исходное количество животных (в
Группа Доза, скобках % от исходного количества животных)
мг/г Время между заражением и введением исследуемых субстанций, часы
24 48 72
Контроль 8/20 (40 %) 5/20 (25 %) 10/20 (50 %)
Р 120 10/20 (50 %) 2/20 (10 %) 10/20 (50 %)
30 4/20 (20 %) 4/20 (20 %) 18/20 (90 %)*
МР 60 18/20 (90 %)* 20/20 (100 %)* 18/20 (90 %)*
150 15/20 (75 %) 17/20 (85 %)* 20/20 (100 %)*
300 18/20 (90 %)* 14/20 (70 %)* 20/20 (100 %)*
Примечание: * р < 0,05 по сравнению с соответствующей контрольной группой.
Определение противовирусной активности в опытах на мышах на модели клещевого энцефалита показало, что МР превосходит исходный Р.
Коэффициент защиты (КЗ) мышей, получивших МР, оказался выше в 1,4 раза, нежели у мышей, получивших Р в соответствующей концентрации. Можно предположить, что увеличение защитного эффекта привнесено модифицирующим фактором, составляющим дополнительные 4/5 части препарата.
Таким образом, химическая модификация ремантадина водорастворимым декстраном оказала существенное влияние на биологические свойства полученного продукта.
Дальнейшее изучение состава МР, его молекулярной массы и химического состава позволит определить перспективы его изучения и применения как лечебного средства.
Авторы благодарны А. А. Гаврилову за проведение биологических тестов с модифицированным ремантадином на модели заболевания вирусом гриппа, Е.М. Дементьевой за статистическую обработку результатов.
Список литературы:
1. Иммобилизация протеолитического фермента террилитина на водорастворимой полимерной матрице / Т.Б. Тенникова // Химико-фармацевтический журнал. - 1977. - Т. 11, Вып. 7. - С. 86-90.
2. Изучение физико-химических свойств протеолитического фермента террилитина, модифицированного сополимером на основе винилпирроли-дона / Т.Б. Тенникова // Биохимия. - 1980. - Т. 45, вып. 3. - С. 438-448.
3. А.с. 790785 СССР / Е.И. Чазов, В.Н. Смирнов, Б.В. Москвичев и др. (СССР).
4. Ильенко В.И. Методы исследования и оценки противовирусной активности химических соединений в отношении вируса гриппа: методические указания. - Л.: ВНИИгриппа, 1977. - С. 14-18.
