CC BY
28
Є
Изучение эффективности Ингавирина® in vivo в отношении штаммов пандемического вируса гриппа A(H1N1/09)v
Л. Н. ШИШКИНА1, В. Е. НЕБОЛЬСИН2, М. О. СКАРНОВИЧ1, А. С. КАБАНОВ1, А. А. СЕРГЕЕВ1,
У.Б. ЭРДЫНЕЕВА1, О. А. СЕРОВА1, О. К. ДЕМИНА1, А. П. АГАФОНОВ1, Е. А. СТАВСКИЙ1, И. Г. ДРОЗДОВ1
1 ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, п. Кольцово, Новосибирская обл.
2 ОАО «Валента Фарм», Москва
In vivo Efficacy of Ingavirin® Against Pandemic A(H1N1/09)v Influenza Virus
L. N. SHISHKINA, V. E. NEBOLSIN, M. O. SKARNOVICH, A. S. KABANOV, A. A. SERGEEV,
U. B. ERDYNEEVA, O. A. SEROVA, O. K. DEMINA, A. P. AGAFONOV, E. A. STAVSKY, I. G. DROZDOV
State Scientific Centre of Virology and Biotechnology VECTOR, Koltsovo, Novosibirsk Region JSC Valenta Pharm, Moscow
Ингавирин® эффективно ингибирует размножение штаммов пандемического вируса гриппа А/СаШогпіа/04/2009 (ИШ1)у, А/СаШЬгпіа/07/2009 (НШ1)у, А/Мо«соиУ225/2009 (НШ1)у и А/Мо«сои'/226/2009 (НШ1)у, а также штамма вируса гриппа А/АісМ/2/68 (Н3Ш) в лёгких у инфицированных мышей. Титры этих штаммов вируса гриппа в гомогенатах лёгких понижаются после перорального введения Ингавирина® инфицированным мышам.
Ключевые слова: вирус гриппа А(ИШ1/09)г, мыши, Ингавирин®, противовирусная активность
Ingavirin® was shown to be efficient in inhibition of the pandemic influenza virus strains A/Califomia/04/2009 (H1N1)v, A/California/07/2009 (H1N1)v, A/Moscow/225/2009 (H1N1)v and A/Moscow/226/2009 (H1N1)v. as well as the influenza virus strain A/Aichi/2/68 (H3N2) in the lungs of the infected mice. After oral administration of Ingavirin® the titers of the influenza virus strains in the lung homogenates lowered.
Key words: influenza virus A(H1N1/09)v, mice, Ingavirin®, antiviral activity.
Введение
Грипп является одним из тяжёлых заболеваний, которым ежегодно болеют миллионы людей во всём мире. Смертность от гриппа в период эпидемий в разных возрастных группах может достигать от десятков до сотен случаев на 100 тыс. населения, а в период пандемии до 1000 случаев на 100 тыс. населения. Заболевание гриппом, вызванное в 2009 г. новым вариантом вируса, вначале охватило территории Мексики и США, а затем с потоком туристов молниеносно распространилось на территории других государств мира, в связи с чем ВОЗ 29 апреля 2009 года объявила о введении пятого уровня, а 11 июня того же года впервые более чем за 40 лет — о введении шестого, максимального уровня угрозы пандемии [1]. Предварительный анализ эпидемиологических данных свидетельствует о том, что случаи тяжёлого заболевания и смерти, связанные с гриппом А(Н1Ш/09), в основном, происходят среди ранее
© Коллектив авторов, 2010
Адрес для корреспонденции: 630559 р. п. Кольцово Новосибирского района Новосибирской области. ГНЦ ВБ «Вектор»
здоровых молодых и среднего возраста людей (от 20 до 50 лет). Сообщается, что в смертельных и тяжёлых случаях заболевшие люди обращались за медицинской помощью через 5—7 дней после наступления симптомов заболевания [2].
Поиск эффективных профилактических и лечебных противогриппозных препаратов существенным образом осложнён уникальными биологическими свойствами вируса гриппа — его высокой генетической и антигенной изменчивостью. Более того, генетическая изменчивость вируса гриппа А может привести к возникновению резистентности к противовирусным препаратам, в частности римантадину [1, 3].
Цель настоящего исследования — изучение эффективности нового отечественного препарата Ингавирин®, а также Ремантадина® и Тамиф-лю® in vivo в отношении штаммов пандемического вируса гриппа A(H1N1) 2009 г. и штамма вируса гриппа A(H3N2).
Материал и методы
Вирус. В работе использовали следующие штаммы вируса гриппа (ВГ): A/Califomia/04/2009 (H1N1)v и A/Califomia/07/2009 (H1N1)v, полученные в мае 2009 г. из CDC (США);
e
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
А/Мо8со^'/225/2009 (НШ1)у и А/Мо8со^У226/2009 (НШ1)у, выделенные и охарактеризованные в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» в июне 2009 г., и А/АюЫ/2/68 (Н3К2), полученный из «Коллекции микроорганизмов» ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». При этом штамм А/АюЫ/2/68 (Н3К2) был использован в качестве референс-штамма вируса гриппа, обладающего чувствительностью к Ремантадину®. Штаммы А/Са11Гогша/07/2009 (НШ1)у, А/Moscow/226/2009 (НШ1)у, А/А1сЫ/2/68 (Н3Ш) были наработаны на развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ), штаммы А/СаНГогша/04/2009 (НШ1)у и А/Moscow/ 225/2009 (НШ1)у были наработаны в культуре клеток МОСК. Концентрацию вируса в исследуемых образцах определяли путем титрования на клетках МОСК [4], рассчитывали и выражали в ^ТЦД50/мл (десятичных логарифмах 50% тканевых цитопатических доз в мл) по методу Спирмана-Кербера [5]. Наработанные и использованные в работе серии вирусной аллантоисной жидкости и культуральной жидкости со штаммами вируса гриппа хранили при -70°С.
Животные. В работе использовали линейных мышей Ва1Ь/с, полученных из питомника ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», в количестве 180 голов (самки массой 15—17 г на начало исследований). Животные содержались в клетках в специально оборудованном помещении вивария ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», на которое выдано разрешение для проведения исследований с вирусом гриппа. Мыши содержались при естественном освещении, стандартном рационе питания и свободном доступе к воде. Проведение исследования и содержание животных осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» [Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755] и Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных [6].
Используемые препараты. В работе использовали Ингави-рин® производства Открытого Акционерного Общества «Ва-лента Фармацевтика» (Россия), Тамифлю® (Ф. Хоффманн — Ля Рош Лтд., Швейцария) и Ремантадин® (ООО «Розфарм», Россия).
При проведении исследований препараты вводили животным перорально в течение 5 сут после заражения вирусом гриппа в следующих дозах и схемах: Ингавирин® — 45 мкг/г массы мыши 1 раз в день, Тамифлю® — по 15 мкг/г массы мыши 2 раза в день, Ремантадин® — по 25 мкг/г массы мыши 2 раза в день.
Интраназальное заражение мышей вирусом гриппа. Ин-
траназальное (и/н) инфицирование мышей проводили при относительной влажности 50—70% и температуре 24°С. Инфицирование мышей вирусом гриппа производили интрана-зальным способом под лёгким эфирным наркозом. При этом с помощью автоматической пипетки с наконечником суммарно в обе ноздри мыши вносили соответствующее разведение вируссодержащей жидкости (ВСЖ) в объёме 40 мкл. Биологическую концентрацию вируса в исходной вируссодержащей суспензии определяли по результатам титрования на клетках МОСК, и выражали в ^ТЦП^/мл (десятичных логарифмах 50% тканевых цитопатических доз в мл) по методу Спирмана-Кербера [4, 5].
Определение ИД50 и ИД100 вируса гриппа для мышей. Для определения 50% инфицирующей дозы (ИД50) штаммов вируса гриппа по 6 мышей интраназально заражали пятью разведениями для каждого из штаммов ВГ: 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 и 10-7 в объёме 40 мкл. Через 4 сут животных забивали, получали го-могенаты лёгких и определяли в них наличие или отсутствие вируса посредством инфицирования РКЭ, в которых через 2 сут регистрировали наличие или отсутствие ВГ в реакции ге-магглютинации (РГА) с 0,5% эритроцитов петуха. ИД50 рассчитывали по методу Спирмана-Кербера в ^ТЦД50/голову [4, 5], используя значения вводимых доз ВГ (в ТЦД50) и показатели наличия ВГ в лёгких у инфицированных животных. Аналогичным образом определяли ИД50 вируса в группах животных, которые получали противовирусные препараты в
соответствующих дозах. На основании этих показателей высчитывали индекс нейтрализации (ИН) вируса под влиянием препарата in vivo: ИН = ИД50опыт — ИД50контроль (lg). Кроме того, после определения ИД50 вируса гриппа, для инфицирования мышей использовали дозу 10 ИД50 для каждого штамма, что соответствовало ИД100, применение которой приводило к инфицированию вирусом гриппа 100% животных.
Определение концентрации вируса гриппа в лёгких мышей. При проведении исследований по изучению противовирусной активности препаратов по 5 животных, получавших Ингавирин®, Тамифлю® или Ремантадин®, интраназально инфицировали вирусом гриппа в дозе ИД100 для контрольных животных. Определение концентраций ВГ в лёгких проводили через 5 сут после заражения при титровании объединённых гомогенатов лёгких для мышей каждой группы в культуре клеток MDCK, рассчитывали по методу Спирмана-Кербера [4, 5] и выражали в ^ТЦД,50/мл (lg 50% тканевых цитопатических доз на мл). На основании разницы между титрами вируса в гомогенатах лёгких у мышей в контроле и в опыте рассчитывали индекс подавления продукции вируса под влиянием препарата in vivo.
Оценка противовирусной эффективности препаратов осуществлялась в соответствии с рекомендациями Фармакологического государственного комитета РФ [7]. Между контрольными и опытными группами инфицированных животных оценивали достоверность различий (р=0,05) по ИД50 in vivo штаммов вируса гриппа и по величине титров вируса гриппа в лёгких у инфицированных животных.
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку и сравнение данных проводили общепринятыми методами для биологических исследований [5] с помощью компьютерной программы методом Спирмана-Кербера с оценкой достоверности отличий (^=0,05) для 95% доверительного уровня (I95).
Результаты и обсуждение
В результате интраназального (и/н) заражения вирусом гриппа A(H1N1)v инфекционный процесс начинается в верхних дыхательных путях, но уже через 3—4 сут охватывает лёгкие. Определение ИД50 использованных в работе штаммов вируса гриппа для мышей массой 15—17 г, инфицированных и/н разными дозами вируса гриппа, проводили через 4 сут после заражения по показателям наличия или отсутствия вируса в гомогенатах лёгких. По результатам экспериментов при и/н заражении контрольных мышей (без введения препаратов) различными разведениями вирусного материала для каждого штамма были оценены ИД50, которые представлены в таблице 1 в ^ТЦД50 на животное.
При определении влияния Ингавирина® на инфекционность штаммов вируса гриппа A(H1N1)v и A(H3N2) in vivo было обнаружено, что ИД50 всех исследованных штаммов при инфицировании мышей достоверно увеличивались по сравнению с контролем (табл. 1). При этом диапазон индексов нейтрализации составлял 0,8—1,5 lg с достижением максимального значения для штамма вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2).
Инфекционность штаммов вируса гриппа A(H1N1)v и A(H3N2) in vivo под влиянием Тамифлю® также достоверно уменьшалась, поскольку ИД50 всех исследованных штаммов были более
Є
Таблица 1. Инфекционность (50% инфицирующая доза — ИД50) штаммов вируса гриппа А(Н1№^ П vivо при пе-роральном введении Ингавирина®, Тамифлю®, Ремантадина® и в контроле и через 4 сут после заражения
Штаммы вируса гриппа
ИД50 штаммов in vivo в контроле (в lgim,,/
ИД50 и индекс нейтрализации штамма in vivo при введении Ингавирина®
ИД50 и индекс нейтрализации штамма in vivo при введении Тамифлю®
ИД50 и индекс нейтрализации штамма in vivo при введении Ремантадина®
ИД50 (в ^тцд5о/ гол., +I95> Индекс нейтрализации (в їй) ИД50 (в ^ТЦД5о/ гол., +I95) Индекс нейтрализации (в їй) ИД50 (в ^ТЦД5()/ гол., +I95) Индекс нейтрализации (в їй)
A/California/04/2009 (H1N1)v 1,0±0,3 2,0±0,3* 1,0* 2,3±0,3* 1,3* 1,4±0,3 0,4
A/California/07/2009 (H1N1)v 0,0±0,3 1,0±0,3* 1,0* 1,3±0,3* 1,3* 0,2±0,3 0,2
A/Moscow/225/09 (H1N1)v 0,6±0,3 1,4±0,3* 0,8* 1,6±0,3* 1,0* 0,9±0,3 0,3
A/Moscow/226/09 (H1N1)v -0,5±0,3 0,3±0,3* 0,8* 0,8±0,3* 1,3* -0,5±0,3 0,0
A/Aichi/2/68 (H3N2) 0,8±0,5 2,3±0,5* 1,5* 2,1±0,5* 1,3* 1,6±0,5* 0,8*
Примечание. * - отличия от контроля по ИД50 при р=0,05.
Таблица 2. Титры штаммов вируса гриппа А(Н1№^ в легких инфицированных мышей при пероральном введении Ингавирина®, Тамифлю®, Ремантадина® и в контроле и через 5 сут после заражения
Штаммы вируса Доза Титры Титры и индексы Титры и индексы Титры и индексы
гриппа заражения вируса в подавления продукции подавления продукции подавления продукции
ИД100 лёгких вируса в лёгких вируса в лёгких вируса в лёгких
(в ^ТЦД5о/ мышей в мышей при введении мышей при введении мышей при введении
гол., +I95) контроле Ингавирина® Тамифлю® Ремантадина®
(в 1йТЦД5о/ Тигры Индексы Титры Индексы Титры Индексы
мл, +І95) вируса подавления вируса подавления вируса подавления
(в ^ТЦД5о/ продукции (в ^ТЦД5„/ продукции (в ^ТЦД5о/ продукции
гол., +I95) вируса (в їй) гол., +195> вируса (в ]$ гол., +I95) вируса (в 1й)
A/California/04/2009
(H1N1)v 2,0±0,3 3,7±0,4 2,5±0,7* 1,2* 1,8±0,6* 1,9* 3,5±0,4 0,2
A/California/07/2009
(H1N1)v 1,0±0,3 3,5±0,4 2,2±0,7* 1,3* 1,8±0,6* 1,7* 3,1±0,5 0,4
A/Moscow/225/09
(H1N1)v 1,6±0,3 2,7±0,4 1,4±0,6* 1,3* 1,0±0,4* 1,7* 2,7±0,7 0,0
A/Moscow/226/09
(H1N1)v 0,5±0,3 3,5±0,4 2,1±0,7* 1,4* 1,5±0,6* 2,0* 3,2±0,5 0,3
A/Aichi/2/68
(H3N2) 1,8±0,5 3,9±0,3 2,4±0,6* 1,5* 1,7±0,4* 2,2* 3,0±0,4* 0,9
Примечание. * - отличия от контроля по титрам вируса в лёгких при р=0,05.
высокими, чем в контроле (см. табл. 1). При этом диапазон индексов нейтрализации исследованных штаммов вируса гриппа под воздействием Тамифлю® был 1,0—1,3 ^, то есть практически таким же, как и при введении Ингавирина® (см. табл. 1).
При введении Ремантадина® мышам, и/н инфицированным разными штаммами вируса гриппа, было продемонстрировано отсутствие его влияния на показатели ИД50 всех исследованных штаммов вируса гриппа А(Н1Ш)у и достоверное увеличение ИД50 штамма вируса гриппа А/А1сЫ/2/68 (Н3Ш) с индексом нейтрализации 0,8 ^ (см. табл. 1).
Согласно нашим эмпирическим и литературным данным 100% инфицирование мышей при интраназальном заражении ВГ может наблюдаться в очень широком диапазоне доз от 5 ИД50 до 50 ИД50 [8, 9]. В данной работе при проведении экспериментов по оценке противовирусной эффективности препаратов для 100% заражения мышей ВГ были использованы дозы, рассчитанные для контрольных мышей (без введения препаратов) с помощью пробит-метода [10], приблизительно
равные 10 ИД50 (далее ИД100) для каждого штамма. Использованные в работе ИД100 каждого штамма вируса гриппа, рассчитанные в ^ТЦД50 на животное, представлены в таблице 2.
Было показано, что через 5 сут после заражения мышей дозами ВГ, равными ИД100, то есть дозами, при применении которых наблюдается 100% инфицирование контрольных животных, титры вируса гриппа в лёгких мышей, получавших Ингавирин®, были достоверно ниже соответствующих контрольных величин (см. табл. 2). Из данных, приведенных в таблице 2, видно, что индексы подавления продукции вируса под воздействием Ингавирина® для всех исследованных штаммов вируса гриппа были практически одинаковыми, и находились в диапазоне 1,2—1,5 ^.
Также было показано, что через 5 сут после заражения мышей дозами ВГ, равными ИД100, титры всех штаммов вируса гриппа в лёгких мышей, получавших Тамифлю®, значительно понижались по сравнению с соответствующими контрольными значениями (см. табл. 2). Индексы
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
подавления продукции вируса под воздействием Тамифлю® для всех исследованных штаммов вируса гриппа были практически одинаковыми, и изменялись в диапазоне 1,7—2,2 (см. табл. 2).
Под влиянием Ремантадина® через 5 сут после заражения мышей ИД100 ВГ значения титров всех исследованных штаммов вируса гриппа A(H1N1)v в гомогенатах лёгких не изменялись относительно соответствующих контрольных показателей (см. табл. 2). Тогда как концентрация штамма вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) в лёгких у мышей, получавших Ремантадин®, достоверно снижалась, при этом индекс подавления продукции вируса составлял 0,9 lg (см. табл. 2).
Обнаруженное нами подавление продукции вируса гриппа A под влиянием Ингавирина®, действующим веществом которого является ими-дазолилэтанамид пентандиовой кислоты, в экспериментах in vivo может осуществляться благодаря его прямому противовирусному действию,
ЛИТЕРАТУРА
1. Пандемия гриппа (H1N1) — 2009: обзор ситуации в Европейском регионе ВОЗ //http://www.euro.who.int/influenza/AH1N1/200910 26_1?language=Russian.
2. Пандемический грипп (H1N1) — 2009, Украина//http://www.who.int/ csr/don/2009_11_01/ru/index.html.
3. Глобальная стратегия ВОЗ по сдерживанию устойчивости к противо-микробным препаратам. WH0/CDS/CSR/DRS/2001/2 //http://www. who.int/drugresistance/WH0_Global_Strategy_Russian.pdf.
4. Вирусология. Методы / Пер. с англ. Мейхи Б. М.: 1988; 344.
5. Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика; 1976; 598.
6. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. Washington, D.C.: National Academy Press: 1996; 138.
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Хабриева Р. У. М.: 2005; 832.
которое основано на подавлении репродукции вируса гриппа на этапе ядерной фазы, задержке миграции нового синтезированного нуклеопро-теина вируса из цитоплазмы в ядро [11, 12].
Заключение
Таким образом, при изучении эффективности Ингавирина®, Тамифлю® и Ремантадина® в экспериментах на мышах, интраназально инфицированных штаммами пандемического вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1)v, A/California/07/ 2009 (H1N 1)v, A/Moscow/225/09 (H1N1)v, A/ Moscow/226/09 (H1N1)v, было показано наличие чувствительности этих штаммов к Ингавирину® и Тамифлю® и отсутствие их чувствительности к Ремантадину®. При этом использованный в работе референс-штамм вируса гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) был чувствительным к Ингавирину®, Та-мифлю® и Ремантадину®.
8. Сергеев А. Н., Жуков В. А., Порываев В. Д. и др. Разработка простого метода прямой оценки наличия инфекционного процесса у мышей и крыс, аэрогенно инфицированных вирусом гриппа. Вопр вирусол 2002; 4: 44—46.
9. Шишкина Л. Н., Сергеев А. Н., Пьянкова О. Г. и др. Изменение устойчивости мышей к вирусу гриппа (A/Aichi/2/68) под влиянием глюкокортикоидного иммунодепрессанта кеналога. Там же 1999; 44: 6: 272—275.
10. Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: 1962; 161.
11. Небольсин В. Е., Новиков Ф. Н., Строганов О. Л. и др. Поиск терапевтических мишеней и исследование механизма противогриппозной активности нового препарата Ингавирин. Тезисы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды», Казань, 23—27 июня 2009; 103.
12. Семенова Н. П., Прокудина Е. Н., Львов Д. К., Небольсин В. Е. Влияние противовирусного препарата Ингавирин® на внутриклеточные преобразования и импорт в ядро нуклеокапсидного белка (NP) вируса гриппа. Вопр вирусол 2010 (в печати).
—è
