CC BY
12УДК 578.74:57.083.3
Е.С.Зайцева1, О.Ю.Талалаева2, Я.Б.Москвичева3, И.В. Нынь4, А.И.Гинак5
На фоне бурного развития биотехнологии во второй половине прошлого столетия, выразившегося, в частности, в изучении процессов иммобилизации различных биологически активных веществ (БАВ), химическая модификация БАВ полимерами в растворе приобрела самостоятельное значение. Это направление, в первую очередь, обусловлено необходимостью создания более эффективных и стабильных лечебных композиций на основе ферментов и других БАВ. Такие препараты на основе стрептокиназы и террилитина, трипсина были разработаны в сПбНИИ вакцин и сывороток и предприятии по производству бактериальных препаратов [1, 2]. Ферментный препарат Терридеказа®, представляющий протеиназу - террилитин, ковалентно связанный с полиглюкином в растворе, выпускается в настоящее время [3].
Модифицированные полимерами ферменты в растворе приобретают повышенную совместимость с организмом больного, менее реактогенны, обладают повышенной стабильностью и сохраняют свою способность взаимодействовать с высокомолекулярными субстратами.
Представляет большой интерес выяснить, каким образом такой метод модификации белков (Б) повлияет на биологические свойства антигенов вируса гриппа.
Изучение образования соединения между белком вируса и полимерами ранее проводилось на примере взаимодействия полиоксидония с антигенами вируса гриппа. В рабо-
ИММУНОГЕННОСТЬ
ХИМИЧЕСКИ
МОДИФИКАЦИРОВАННЫХ ПОЛИСАХАРИДАМИ АНТИГЕНОВ ВИРУСА ГРИППА
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет) 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26
Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактериальных препаратов 198320, Санкт-Петербург, Красное Село, ул. Свободы, д. 52
Изучена реакция химической модификации антигенов различных штаммов вируса гриппа в присутствии окисленного декстрана. Показано, что при уменьшении доли белка по отношению к декстрану при модификации, в основном, происходит уменьшение титра специфических антител в сыворотке крови иммунизированных мышей, но в определенной области соотношения белка и декстрана титр антител может превышать контроль - величину титра специфических антител в сыворотке крови мышей иммунизированных концентратом субъединиц вируса гриппа без модификации. Предполагается, что различие величины титра специфических антител в сыворотке крови животных, иммунизированных модифицированными антигенами вируса гриппа, может быть обусловлено структурой белковых глобул антигенов разных штаммов, а превышение этого титра по сравнению с контролем может быть обусловлено пролонгированным действием модифицированных антигенов в организме животного.
Ключевые слова: антигены вируса гриппа, гемагглютинин, модификация, декстран, титры антител.
те [4] показано, что полиоксидоний представляет сополимер (СП) 1\1-окси-1,4-этиленпиперазина и (1\1-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиния бромида, который обволакивает глобулу белка за счет нековалентных взаимодействий между ними. Этот процесс лежит в основе получения вакцины против гриппа род названием гриппол.
При активации полиоксидония возможно образование ковалентных связей между антигеном и СП.
Целесообразно рассмотреть, как происходит образование модифицированной формы антигена вируса в присутствии жесткоцепного полимера - декстрана. Выбор полимера обусловлен высокой биосовместимостью декстрана, а также тропностью к вакуолярному аппарату клеток иммунной системы [5].
Условия эксперимента
С целью изучения особенностей химической модификации белков вируса гриппа нами был использован метод, основанный на образовании ковалентной связи между аминогруппами аминокислотных остатков белка и альдегидными группами окисленного декстрана - полиглюкина.
Взаимодействие белков с предварительно активированным полиглюкином происходит с образованием N1-замещенного имина (основания Шиффа), возникающего в результате реакции между альдегидными группами полимера
1 Зайцева Елена Сергеевна, инженер-химик ФГУП СПбНИИВС ФМБА России, Moskvichev.36@mail.ru
2 Талалаева Олеся Юрьевна, инженер-химик ФГУП СПбНИИВС ФМБА России, Moskvichev.36@mail.ru
3 Москвичева Яна Борисовна, мл. науч. сотр. ФГУП СПбНИИВС ФМБА России, Moskvichev.36@mail.ru
4 Нынь Игорь Владимирович, канд. техн. наук, директор ФГУП СПбНИИВС ФМБА России, Moskvichev.36@mail.ru
5 Гинак Анатолий Иосифович, д-р хим. наук, профессор, зав. каф. молекулярной биотехнологии СПбГТИ(ТУ), mbt@lti-gti.ru
Дата поступления - 30 января 2012 года
и аминогруппами белка [2, 3]. Активацию биополимера проводят путем окисления глюкопиранозных звеньев декстрана полиглюкина перйодатом калия до альдегидных групп. Восстановление связей -CH=N- в продукте реакции осуществляют так, чтобы происходила не только их полная трансформация в —CH2-NH- связи, но и трансформация избытка альдегидных групп (непрореагировавших) до первичных спиртовых -СН2ОН.
В работе использованы концентраты субъединиц (КСЕ) вируса гриппа B/Florida/04/2006/ и A/Brisbane/59/2007/ (IVR-148), полученные при производстве инактивированной субъединичной вакцины против гриппа в ФГУП СПбНИИВС ФМБА России.
Определение белка производили в соответствии с методикой, изложенной в ВФС 42-0053-07, используя метод Лоури (метод без предварительного осаждения белка). Метод основан на биуретовой реакции с солями меди (II) в щелочном растворе и восстановлении фосфорномолибденовольфрамового реактива (или реактива Фолина) в гетеромолибденовый краситель с максимумом поглощения при длине волны 750 нм в результате окисления ароматических аминокислот белка.
Декстран использовали в форме 6% раствора полиглюкина для инфузий по ФСП 42-0088-4747-03. Определение глюкопиранозных звеньев в декстране проводили в соответствии с методикой, изложенной в статье Roe J.H. [6]. Метод основан на способности углеводов после дегидратации образовывать производные фурфурола, которые дают цветную реакцию сантроном.
Содержание гемагглютинина в исходных образцах КСЕ вируса гриппа B/Florida/04/2006/ и A/Brisbane/59/2007/ (IVR-148) определяли методом ОРИД [7].
В качестве окислителя применяли перйодат калия марки ч.д.а. Для поддержания необходимого значения рН использовали раствор содового буфера (0,1 М №2СОз) рН 9,2 и фосфатный буферный раствор pH 7,2. Боргидрид натрия использовали марки PS 96%. Содержание альдегидных групп в активированном полиглюкине, а также содержание невосстановленных альдегидных групп в модифицированном белке оценивали потенциометрическим методом, основанном на реакции взаимодействия этих групп с гидроксиламином, сопровождающейся высвобождением кислоты [2].
Степень окисления (y) полиглюкина определяли как долю окисленных глюкопиранозных звеньев в исходной макромолекуле декстрана, принимая молекулярную массу глюко-пиранозного звена равной 162 Да.
Деминерализацию растворов, в том числе очистку модифицированных антигенов, проводили на ультрафильтра-ционной установке Vivaflow 200 с мембранными модулями 10 кДа PES и 5 кДа PES, отсекающими минеральные соли и низкомолекулярные компоненты.
Спектрофотометрические измерения осуществляли на регистрирующем автоматическом спектрофотометре Hitachi U 2900.
На основе предыдущих работ [1, 2] использовали декстран со степенью окисления y = 20%. При получении окисленного декстрана - диальдегид декстрана готовили 5% раствор полиглюкина. К 100 мл 5% раствора Д добавляли 2,3 г перйодата калия. Окисление проводили при температуре 18-20°С в течение часа. Полученный ДАД очищали ультрафильтрацией на модуле, отсекающем вещества с массой менее 5 кДа, десятикратным объемом воды. Контроль очистки вели спектрофотометрически по оптической плотности при длине волны 235 нм до величины < 0,25. Определяли степень окисления полиглюкина, которая составила y = 18%.
Для получения модифицированных антигенов вируса гриппа B/Florida/04/2006 и A/Brisbane/59/2007/ (IVR-148) исходный раствор концентрата субъединиц предварительно промывали на ультрафильтрационной установке Vivaflow 200, используя мембранный модуль 10 кДа PES 5 раз и концентрировали в 10 раз (от 1000 мл до 100 мл). Далее проводили связывание очищенного и сконцентрированного антигена в объеме 100 мл с очищенным активированным полиглюкином при температуре 18-20°С, рН 9,35±0,01, при постоянном перемешивании на магнитной мешалке 40 об/мин в течение 1 часа.
Для восстановления азометиновых связей, образовавшихся между атомами азота в белке и атомом углерода в карбонильной группе окисленного полиглюкина, добавляли раствор боргидрида натрия в 0,1 М содовом буфере рН 9,2. Реакцию восстановления вели при температуре 2-6°С, при постоянном перемешивании 40 об/мин в течение 1 часа. Очистку полученного раствора модифицированного концентрата субъединиц (МКСЕ) проводили водой очищенной на установке ультрафильтрации Vivaflow 200, используя мембранный модуль 10 кДа РЕБ или 5 кДа РЕБ. Из деминерализованного раствора МКСЕ отбирали пробы для анализа содержания белка, декстрана, 1\1Н2 - групп, а так же геммаглютинина(ГА).
Изучали химическую модификацию КСЕ вируса гриппа В/Florida/04/2006/ и А/ВпБЬапе/59/2007/ (^-148) при различных соотношениях белка ГА и декстрана в растворе = 1:1; 1:10; 1:20; 1:40; 1:100.
Представляло интерес выяснить, как влияет на им-муногенность модифицированных антигенов вируса гриппа соотношение белка и декстрана в реакционном растворе.
Для этого изучали иммунобиологические свойства образцов вакцинных препаратов на основе модифицированных антигенов в опытах на белых мышах весом 12 г. Животных иммунизировали внутрибрюшинно в дозе ГА 26 мкг/0,5 мл двукратно с интервалом 7 суток. Контролем служила группа животных иммунизированных концентратом субъединиц вируса гриппа без модификации. Через 21 день после начала вакцинации от животных получали сыворотку и исследовали ее в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).
Постановку РТГА микрометодом осуществляли по МУ 3.3.2.1758-03 [7]. В качестве антигенов использовали диагно-стикумы гриппозные тип В/Florida/04/2006/ и тип А/ВпБЬапе/59/2007 (^-148) для РТГА. Для подтверждения специфичности реакцию РТГА ставили с диагностикумом гриппозным тип А/Н^/ ВпБЬапе/10/07/.
Результаты и обсуждение
В таблице 1 представлены результаты определения средних титров специфических антител в сыворотке крови животных, иммунизированных модифицированным антигеном вируса гриппа В/Florida/04/2006/ в зависимости от соотношения Б и Д в реакционном растворе при модификации.
Таблица 1. Условия химической модификации образцов вакцинного препарата на основе вируса гриппа В/Р!опёа/04/200б/ и характеристики модифицированного антигена
Состав и свойства исходного раствора КСЕ взятого для модификации
№ се- рий Частей белка (Б) Частей декст- рана (Д) Доля белка в исходном растворе в=Б/Д nh2 групп/Б моль/мо ль Средние титры антител
1* 1 0 1,000 3,22 247±115
2 1 10 1/11 = 0,091 2,59 704±212
3 1 20 1/21 = 0,048 1,65 416±152
4 1 40 1/41 = 0,024 0,54 342±82
5 1 100 1/101=0,0 10 0,14 168±51
Характеристика модифицированного антигена
*Примечание: серия 1 является контролем - исходный образец концентрата субъединиц без модификации
Из данных таблицы 1 видно, что увеличение доли Б при модификации приводит к увеличению величины среднего титра (ВСТ) специфических антител, причем начиная с соотношения Б и Д равном 1:40 (в = 0,024) происходит увеличение ВСТ по сравнению с контролем.
Изменение ВСТ (таблица 2) специфических антител к модифицированному антигену вируса гриппа А/Brisbane/59/2007 (^К-148) отличается от описанной зависимости в таблице 1.
Таблица 2. Условия химической модификации образцов вакцинного препарата на основе вируса гриппа А/БпзЬапе/59/2007 __________(ТУЯ-148) и характеристики модифицированного антигена
Состав и свойства исходного раствора КСЕ взятого для модификации
№ серий Частей белка (Б) Частей декстрана (Д) Доля белка в исходном растворе в=Б/Д N42 групп/Б моль/моль Средние титры антител
1* 1 0 1,000 1,31 408±211
2 1 1 1/2 = 0,500 1,07 150±102
3 1 10 1/11 = 0,091 0,68 47±26
4 1 20 1/21 = 0,048 0,63 209±167
5 1 40 1/41 = 0,024 0,38 424±200
Характеристика модифицированного антигена
* Примечание: серия 1 является контролем - исходный образец КСЕ без модификации.
Данные, приведенные в таблице 2, показывают зависимость ВСТ специфических антител к модифицированному антигену вируса гриппа А/Brisbane/59/2o07 (^К 148) от соотношения Б и Д в реакционном растворе, имеющую сложный характер с минимумом на кривой. Тем не менее при соотношении Б:Д равном 1:40 ВСТ специфических антител в сыворотке крови животных, иммунизированных модифицированным антигеном, соответствует ВСТ специфических антител в сыворотке крови животных контрольной группы.
Зависимость ВСТ специфических антител в сыворотке крови иммунизированных модифицированными антигенами вируса гриппа животных от соотношения Б:Д в реакционном растворе представлена на рисунке 1.
Рисунок 1. Зависимость среднего титра специфических антител в сыворотке крови животных, иммунизированных модифицированными антигенами вируса гриппа от соотношения Б и Д в реакционном растворе. По оси абсцисс отложена величина отношения белка (Б) и декстрана (Д) в реакционном растворе при модификации КСЕ: 1 -антиген вируса гриппа В/Р!опёа/04/200б/, 2 - антиген вируса гриппа А/БпзЬапе/59/2007/ (1УЯ-148). Пунктиром указаны титры специфических антител в сыворотке крови животных контрольной группы (животные иммунизированные антигенами вируса гриппа без модификации).
Очевидно, что при модификации антигенов вируса гриппа окисленным декстраном количество аминогрупп в полученном модифицированном белке-гемагглютинине должно быть меньше чем в исходном КСЕ. Как эта зависимость проявляется видно на рисунке 2.
Действительно, чем меньше доля белка в модифицированном антигене (справа налево) тем меньше аминогрупп приходится на единицу массы белка.
Рисунок 2. Зависимость количества аминогрупп, выраженная в молях
аминокислотных остатков к одному молю антигена 1 - В/Яопса/04/200б/, 2 - А/БпБЬапе/59/2007/ (Ш-148)
По оси абсцисс отложена величина отношения белка (Б) и декстрана (Д) в исходном растворе КСЕ, по оси ординат - количество аминокислотных остатков приходящихся на одну химически модифицированную макромолекулу гемагглютинина.
Из рисунка 2 видно, что количество аминогрупп в модифицированном антигене вируса гриппа, выраженное в молях и отнесенное к одному молю белка, возрастает при увеличении доли белка в исходном растворе КСЕ.
По сути, на оси ординат отражено количество остатков лизина [2], входящих в первичную структуру гемагглютинина, не затронутых в реакции химического связывания с окисленным декстраном.
В модифицированных антигенах вируса гриппа В/Поп<^а/04/200б/ и А/ВгіБЬапе/59/2007/ (^-148) количество молей аминогрупп не затронутых модификацией под действием ДАД возрастает с увеличением доли белка в растворе КСЕ, но степени возрастания для каждого из антигенов сильно различаются. Несмотря на то, что количество £-лизиновых остатков в глобуле ГА вируса гриппа В/Поп<^а/04/200б/ и А/ВгіБЬапе/59/2007/ (^-148) одинаковое, ГА вируса гриппа В/Р1о^а/04/200б/ имеет почти в два раза больше ароматических аминокислотных остатков, в то же время остатков аргинина в два раза меньше [8]. Можно полагать, что глобула ГА вируса гриппа А/ВпБЬапе/59/2007/ (ІУК-148) построена так, что на ее поверхности доступных остатков лизина меньше, чем в глобуле антигена В/Р1о^а/04/200б/. Поэтому в исходном белке ГА различных штаммов вируса определяется различное количество аминогрупп в одной глобуле, несмотря на то, что количество остатков лизина в антигенах В/Поп<^а/04/200б/ и А/ВгіБЬапе/59/2007/ (^-148) одинаковое и составляет 38 остатков на одну макромолекулу белка [8].
Особенности строения глобулы белка ГА, по-видимому, являются причиной различной зависимости ВСТ специфических антител в сыворотке крови иммунизированных животных от соотношения Би Д в исходном растворе и различий в поведении кривых на рисунке 1.
На данном этапе исследования процесса модификации антигенов вируса гриппа трудно определить причины значительного различия в зависимостях ВСТ специфических антител к модифицированному антигену от доли декстрана в нем. Но можно утверждать, что модификация белковых антигенов вируса гриппа декстраном в растворе при определенных соотношениях белка и дек-страна приводит к увеличению среднего титра специфических антител в сыворотке крови иммунизированных животных по сравнению с контролем - антигеном без модификации. Одна из причин упомянутого различия лежит в особенностях молекулярной структуры белковых глобул ГА.
Из результатов проведенных исследований можно сделать вывод, что при иммунизации животных антигеном вируса гриппа, модифицированным декстраном,
происходит выработка специфических антител к ГА. Причём, величина титра специфических антител в сыворотке крови зависит от соотношения Б:Д в реакционном растворе. Можно предполагать, что, как это показано нами ранее на примере ферментов [1, 2], белок, окружённый жесткоцепным декстраном, приобретает стабильность и способность длительное время циркулировать в организме животного, оказывая влияние на иммунную систему. Кроме того декстран, являясь «тимуснезависимым» антигеном, сам предпочтительно и непосредственно стимулирует В-лимфоциты и обладает тропностью к вакуолярному аппарату макрофагов, которые в свою очередь также активируют В лимфоциты.
В дальнейшем предполагается изучить более подробно механизм действия вируса гриппа, модифицированного декстраном, на иммунную систему животных, установить зависимость иммунологической активности модифицированных антигенов разных штаммов от особенностей строения белка ГА, и, наконец, разработать технологию получения модифицированных антигенов, которая послужила бы основой создания вакцинного препарата нового поколения.
Литература
1. Москвинев Б.В. Многоцелевая модификация гидрофильными полимерами биологически активных веществ как средство создания новых препаратов и технологических процессов в медицинской промышленности: дис. ... д-ра хим. наук, Л., 1986. С. 143-156, 166-169.
2. Таратина Т.М. Синтез и свойства полимерных производных стрептокиназы: дис. . канд. хим. наук, Л., 1985. С. 84- 92, 148-155.
3. Нынь И.В. Терридеказа - усовершенствованная лекарственная форма протеолитического фермента продуцируемого Aspergillus terricola. // Поликлиника. 2007. № 6. С. 87.
4. Kabanov Victor A. From synthetic polyelectrolytes to polymer-subunit vaccines // Pure Appl. Chem. 2004. Vol. 76, No. 9. P. 1659-1677.
5. Шкурупий В.А. Туберкулезный гранулематоз. Цитофизиология и адресная терапия. М: Изд-во РАМН, 2007. С. 109-150.
6. Roe J.H. The determination of dextran in blood and urine with anthrone reagent // J. Biol. Chem. 1954. Vol. 208. № 2. P. 889-896.
7. Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа: метод. указания МУ 3.3.2.1758-03 Утв. Гл. гос. санитарным врачом РФ 28.09.2003.. 22 с.
8. Inflluenza Research Database // [Электронный ресурс]: http://www.fludb.org/
