CC BY
11
УДК 541.64:547.96
ИЗУЧЕНИЕ ЭНЗИМАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ МОРИКРАЗЫ
В. Б. Скобелева1*, Г. Н. Руденская1, Ю. А. Руденская2
('кафедра высокомолекулярных соединений, кафедра химии природных соединений химического факультета, 2кафедра молекулярной биологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова; Воробьевы горы, Москва ''9899, Россия; тел: (095)-939-3'-24; e-mail: vit@enz.chem.msu.ru)
Суммарный препарат протеиназ камчатского краба Морикраза иммобилизован на неподвижных полимерных носителях с целью использования для удаления белковых загрязнений при реставрации культурных ценностей. Морикразу сорбировали в сшитом хлориде ro.ra-NjNjN-триметиламиноэтилакрилате, который получали радикальной полимеризацией. 85-96% исходного количества протеиназ оказываются включенными в гель, однако, ферментативная активность составляет от 0,2 до 7% от их активности в водном растворе. Общая ферментативная активность иммобилизованных ферментов возрастает при увеличении площади, доступной для субстрата. Иммобилизованная Морикраза сохраняет 20-33% активности в течение 6 месяцев хранения, в то время как растворы Морикразы за это время полностью инак-тивируются, Таким образом, в результате иммобилизации ферментов Морикразы в противоположно заряженном сетчатом полиамине ферменты остаются активными и значительно возрастает стабильность ферментов.
Гепатопанкреас камчатского краба Paralithodes сат-tshatica богат протеолитическими ферментами. Ранее нами был выделен [1] и охарактеризован суммарный препарат протеиназ камчатского краба - Морикраза, содержащий коллагенолитическую сериновую протеиназу, трипсин, эластазу, металлопротеиназу, карбоксипептидазу и аминопептидазу. Благодаря совместному действию этих ферментов препарат легко гидролизует коллаген, фибрин, азоказеин и другие белки. Поэтому Морикраза нашла применение в медицине (лечение ожогов, удаление рубцов). Применение препарата возможно также в области реставрации культурных ценностей (удаление белковых загрязнений с картин, рукописей, икон и др.).
Предварительные испытания растворов Морикразы показали, что раствор препарата в водопроводной воде (0,5 мг/мл, рН 7,0) при 20° в течение 1 ч полностью гид-ролизует осетровый клей, нанесенный слоем в 1 мм на поверхность фильтровальной бумаги. В течение 2 ч в тех же условиях был полностью удален столярный клей, нанесенный между двумя листами фильтровальной бумаги. Бумага после такой обработки и промывания водой стала чистой и белой.
Однако существует проблема, связанная с удалением следов ферментов с поверхности объекта. Поскольку Мо-рикраза является комплексным препаратом, включающим ферменты разных классов, то невозможно подобрать дешевый ингибитор, способный прекратить действие всех протеиназ. Единственный способ - промывание слабо концентрированным раствором соляной или уксусной кислоты, что в ряде случаев недопустимо, так как можно испортить или обесцветить объект реставрации.
Поэтому целью нашей работы стала иммобилизация ферментов морикразы на неподвижных полимерных носителях. Такие носители должны обладать протеолитичес-ким действием при размещении на объекте, а после окончания действия иммобилизованные ферменты могут быть удалены с поверхности объекта вместе с носителем.
Известно [2-6], что равновесно набухшие в воде сетчатые полиэлектролиты способны сорбировать противоположно заряженные белки из водных растворов. Сорбция происходит с поверхности образца геля, при этом образуется слой интерполиэлектролитного комплекса (ИПК) сетчатый полиэлектролит - белок, стабилизированный солевыми связями. Затем этот слой утолщается, и при достаточном количестве белка в растворе весь образец сетчатого полиэлектролита превращается в поликомплекс. Максимальное количество белка, включенного в гель, определяется химической природой реагентов и условиями проведения сорбции (рН и ионная сила среды) и не зависит от соотношения реагентов.
В данной работе мы иммобилизовали морикразу в геле слабосшитого хлорида поли-Ы,Ы,Ы-триметиламиноэ-тилакрилата.
Материалы и методы
Сшитый хлорид поли-Ы,Ы,Ы-триметиламиноэтилакрила-та (СПТМАЭА) получали радикальной полимеризацией. Использовали 80 мас.%-й водный раствор хлорида Ы,Ы,Ы-триметиламиноэтилакрилата (ТМАЭА), полученный в НИИ полимеров им. В .А. Каргина (г. Саратов). Гель СПТМАЭА синтезировали по следующей методике. Водный раствор, содержащий 50 вес.% ТМАЭА, 1,0 мол.%
*Адресат для переписки.
от ТМАЭА бифункционального сшивателя, К,К'-метилен-бис-акриламида, продували аргоном в течение 15 мин, затем добавляли по 0,2 вес.% от ТМАЭА персульфата калия и метабисульфита натрия, продували аргоном в течение 10 мин и запаивали в ампулы. Полимеризацию проводили в течение 3 сут при 40°. По окончании полимеризации гель СПТМАЭА отмывали водой до установления постоянной величины набухаемости.
Набухаемость гелей и продуктов завершенных ИПР определяли весовым методом и характеризовали величиной набухаемости
H = (m1 - m2 )/m2,
где m1 - вес набухшего образца, m2 - вес сухого образца.
Набухаемость (H) геля СПТМАЭА (рН 7,2) составляет 100.
Протеолитические ферменты Морикразы представляют собой кислые белки с изоэлектрическими точками pI = 2-4,3. Содержание в Морикразе трипсина и коллагеноли-тической сериновой протеиназы составляет 1,8 и 7,9 вес.% соответственно.
Измерение pH растворов производили на рН-метре «PHM 83 AUTOCAL» («Radiometer», Дания).
При определении активности ферментов Морикразы использовали реакцию ферментативного гидролиза я-нит-роанилидов (для трипсина - BzArgpNa [7], для коллагена-зы - GlpAALpNa [8]). Концентрацию я-нитроанилина определяли спектрофотометрически по поглощению растворов при длине волны X = 410 нм, молярный коэффициент экстинции я-нитроанилина £ = 8900 л/(моль.см).
Результаты и их обсуждение
При погружении в нейтральные бессолевые растворы Морикразы равновесно набухшего геля СПТМАЭА на поверхности прозрачного геля образуется тонкая матовая пленка поликомплекса, которая с течением времени утолщается. Образец геля при этом уменьшается в объеме и при достаточном количестве белка в окружающем растворе в конечном счете превращается в компактный непрозрачный продукт.
Как и для изученных ранее систем сетчатый полиэлектролит (СПЭ) - белок [2, 4], взаимодействие Морикразы с СПТМАЭА наблюдается лишь при таких значениях pH, когда молекулы ферментов и сетка противоположно заряжены (рН > pI). Это означает, что сорбция Морикразы
происходит в результате интерполиэлектролитнои реакции (ИПР), сопровождающейся образованием солевых связей между отрицательно заряженными карбоксилатными группами, экспонированными на поверхности глобул ферментов, и положительно заряженными аминогруппами сетки. Эта ИПР представлена на схеме
Щг+ ncie-bnX®,
где для простоты обозначены только избыточные отрицательные заряды фермента, нейтрализованные низкомолекулярными противоионами. В действительности часть отрицательно заряженных групп молекул ферментов может быть включена в цвиттер-ионные пары.
Для изучения активности ферментов, иммобилизованных в результате ИПР в противоположно заряженном сетчатом полиамине, в нейтральный бессолевой водный раствор Морикразы (V = 5 мл) погружали равновесно набухший гель СПТМАЭА (тг=0,1-0,7 г). Ферментативную активность исходного раствора морикразы (Ц), этого раствора после ИПР (и2), а также активность иммобилизованных в геле ферментов (из) рассчитывали по следующим формулам:
У рКЛ •А 410
и 1 ( и 2 )=--V ,
U 3 =
V pNA •A 410 £-i-t
где - объем я-нитроанилина (л); А410 - оптическая плотность раствора я-нитроанилина; г - молярный коэф-фициент поглощения я-нитроанилина при X = 410 нм, г = 8900 л/(моль-см); ! - длина поглощающего слоя (толщина кюветы спектрофотометра), ! = 1 см; V - объем
аликвоты раствора фермента (мл); / - время реакции ферментативного гидролиза (мин); V - объем раствора Морикразы (мл).
В табл. 1 приведены данные по активности трипсина и коллагеназы в растворах морикразы после проведения ИПР, и2, а также относительного понижения активности
Т а б л и ц а 1
Номер образца Ш, а Шм, а Трипсин (BzArgpNa) Коллагеназа (GlpAALpNa)
U2108, моль/мин (U1-U2)/U1, % U2108, моль/мин (U 1- U 2)/ U1, %
1 0,5137 0,0075 2,91 85 3,60 97
2 0,3752 0,0111 4,02 86 0,82 97
3 0,5134 0,0060 1,81 88 0,21 85
4 0,6698 0,0219 5,82 90 1,25 88
5 0,5744 0,0337 5,03 94 2,36 97
6 0,4203 0,0432 6,21 94 3,46 95
7 0,3204 0,0704 6,92 96 3,62 96
Т а б л и ц а 2
Номер образца Трипсин (BzArgpNa))
S Шг / Шм U31010, моль/мин U3(b)/ U3(a)-1, %
1a исходная 32 2,04 -
1b увеличенная 32 2,65 30
2a исходная 16 1,88 -
2b увеличенная 16 3,01 60
Номер образца Коллагеназа (GlpAALpNa)
S Шг / Шм №10'°, моль/мин U3(b)/ U3(a)-1, %
3a исходная 16 1,51 -
3b увеличенная 16 1,60 6
4a исходная 16 1,68 -
4b увеличенная 16 1,81 7,5
растворов (Uj - U2)/Uj. Высокие значения понижения ферментативной активности растворов после иммобилизации части ферментов в геле свидетельствуют об эффективности иммобилизации ферментов Морикразы в результате ИПР. Как видно из табл. 1, 85-96% исходного количества трипсина и 85-97% исходного количества колла-геназы оказываются включенными в гель. Это соответствует крайне малым равновесным концентрациям Морикразы в окружающем гелевые образцы растворе, что находится в хорошем согласии с данными работы [2] по равновесным концентрациям цитохрома с в его реакции с полиакрилатной сеткой.
Исследование иммобилизованных ферментов показало, что они обладают ферментативной активностью, причем активность иммобилизованного трипсина и коллагеназы составляет соответственно 1,2-7,0 и 0,2-2,7% от их активности в водном растворе.
На рисунке приведена зависимость относительной активности иммобилизованного в геле трипсина, U3/(U1-U2),
Т а б л и ц а 3
Трипсин (BzArgpNa)
Номер образца U3I010, моль/мин U3I010, моль/мин U 3(6)/ U 3(0), %
0 мес 6 мес
1 7,9 1,5 19
2 6,0 1,2 20
3 7,0 1,5 21
4 6,1 1,3 21
Среднее U 3(6)/ U 3(0), % 20
Коллагеназа (GlpAALpNa)
Номер образца U3I010, моль/мин U3I010, моль/мин U 3(6)/ U 3(0), %
0 мес 6 мес
5 13,7 3,1 23
6 9,4 3,0 32
7 8,5 3,4 40
8 8,6 3,2 37
Среднее Ui(6)/U3(0), % 33
от разности активности раствора трипсина до и после ИПР (U1 - U2). Эта зависимость характеризует изменение общей активности иммобилизованного фермента при увеличении его содержания в геле. Как видно из рис. 1, при небольшом содержании фермента в геле наблюдается линейный рост активности при увеличении количества фермента, что очевидно. Однако затем наблюдается снижение общей активности иммобилизованного трипсина при увеличении степени заполнения им геля. Это может быть связано с недоступностью для субстрата фермента, включенного во внутренние слои геля.
С целью проверки этого предположения мы сравнили общую ферментативную активность иммобилизованных трипсина и коллагеназы в образцах гелей, часть из которых после ИПР разрезали на несколько мелких частей с целью увеличения площади поверхности (S), доступной для субстрата. Полученные данные приведены в табл. 2, где показано, что общая ферментативная активность иммобилизованных ферментов возрастает при увеличении площади доступной для субстрата поверхности.
Следовательно, полученные нами невысокие значения ферментативной активности иммобилизованных в гель ферментов Морикразы не являются следствием значительной потери активности ферментов при иммобилизации (хотя некоторое снижение активности происходит), а может объясняться недоступностью значительной части
(U1 - U2)-109, мол/мин
Зависимость относительной активности иммобилизованного в геле трипсина, из/(и1 - и2), от разности активности раствора трипсина до и после ИПР (и1 - и2)
фермента, включенного во внутренние слои сетчатого полиэлектролита, для субстрата. Возможно, использование более набухающего в воде геля, а также подбор оптимального соотношения Морикразы и сетчатого полиамина в ИПР позволит избежать этой проблемы. В табл. 3 приведены данные по активности иммобилизованных в сетку ферментов Морикразы при различном времени инкубирования системы. Как видно из табл. 3, через 6 мес иммобилизованные трипсин и коллагеназа сохраняют соответственно около 20 и 33% своей первоначальной активности. Следует отметить, что нейтральные бессолевые водные
растворы Морикразы за это время полностью теряют свою активность.
Таким образом, в результате иммобилизации ферментов Морикразы в противоположно заряженном сетчатом полиамине ферменты остаются активными, хотя их активность и снижается, и при этом значительно возрастает стабильность ферментов. Это позволяет считать использованный в работе способ иммобилизации ферментов Морикразы многообещающим для создания композиций, которые могут найти свое применение в области реставрации культурных ценностей.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Rudenskaya G.N., Isaev V.A., Shmoilov A.M., Karabasova M.A.,
Shvets S.V, Miroshnikov A.I., Brusov A.B. // Appl. Biochem. Biotech. 2000. 84 (in press).
2. Карабанова В.Б., Рогачева В.Б., Зезин А.Б., Кабанов В.А. // Вы-
сокомол. соед. 1995. А37. С. 1861. 3. Скобелева В.Б., Рогачева В.Б., Зезин А.Б., Кабанов В.А. //
ДАН. 1996. 347. С. 207. 4. Скобелева В.Б., Ковригин Д.И., Рогачева В.Б., Зезин А.Б. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1998. 39. С. 201.
5. Скобелева В.Б., Зинченко А.В., Рогачева В.Б., Зезин А.Б. //
Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1998. 39. С. 268.
6. Скобелева В.Б. Дис. ... канд. хим. наук. М., 1997.
7. Erlanger B.F., Kokovsky N., Cohen W. // Arch. Biochem. Biophys.
95. Р. 271.
8. Люблинская Л.А., Хайду И., Баландина Г.Н., Филиппова И.Ю.,
Маркарян А.Н., Лысогорская Е.Н., Оксенойт Е.С., Степанов В.М. // Биоорганическая химия. 1987. 13. С. 748.
Поступила в редакцию 20.06.00
