CC BY
13
ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ УДК 541.1
КОЛЛАПС ПОЛИАКРИЛАТНОГО ГЕЛЯ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ПРОТИВОПОЛОЖНО ЗАРЯЖЕННЫМИ БЕЛКАМИ
В.Б. Скобелева, Д.И. Ковригин, В.Б. Рогачева, А.Б. Зезян
(кафедра высокомолекулярных соединений)
Изучено влияние простых солей на коллапс сильно набухшей полимерной сетки и макроскопическое фазовое разделение при взаимодействии слабосшитого полиакрплатного геля с противоположно заряженным белком - цитохромом с. С помощью микрофотометрического метода исследования показано, что характер транспорта белка и распределение его в противоположно заряженном геле определяется степенью контракции сетки в результате интерполиэлекгролитной реакции сетчатый полиэлектролит - белок.
В последние годы большой интерес исследователей вызывает явление коллапса заряженных полимерных сеток при их взаимодействии с противоположно заряженными линейными полиионами и ионами поверхностно-активных веществ (ПАВ) в водных средах [1 - 4]. Существенно, что в отличие от классического коллапса под влиянием температуры [5], состава растворителя [6] и др. сорбция линейных полиионов и ионов ПАВ противоположно заряженными сетчатыми полиэлектролитами (СПЭ) сопровождается локализованным коллапсом геля. Другими словами, гель претерпевает коллапс в зоне реакции между СПЭ и противоположно заряженным полиионом или ПАВ. Поскольку эти реакции протекают как фронтальные процессы, начинающиеся с периферии образца геля, в результате возникают макроскопически гетерогенные системы типа "ядро - оболочка", в которых кол-лапсирует оболочка. Недавно такое же макроскопическое фазовое разделение мы обнаружили при изучении взаимодействия слабосшитого высоконабухшего сетчатого полиакрилата натрия (СПАЫа) с противоположно заряженными белками - цитохромом с, лизоцимом и протамином в водных бессолевых средах [7].Очевидно, что исследование механизма переноса белков в химически комплементарных гелях и факторов, управляющих такими процессами, имеет принципиальное значение для понимания физико-химических механизмов активированного транспорта белков в живых системах, а также для дизайна различных функциональных систем на основе иммобилизованных в противоположно заряженных гелях белков, в том числе ферментов.
В данной работе изучено влияние простых солей на характер взаимодействия цитохрома с с полиакрилатной сеткой, а также распределение белка в продуктах незавершенных реакций. Цигохром с - глобулярный белок неболь-
шой молекулярной массы, окрашенный в водных средах в красный цвет. Окраска белка позволяет визуально наблюдать за движением красного фронта белка в фазе геля.
Гель полиакриловой кислоты (ПАК) синтезировали радикальной сополимеризацией акриловой кислоты (АК) в 10%-м водном растворе с Ы.Ы'-метилен-бис-акриламидом (4% от массы мономера) в качестве сшивателя и персульфатом аммония (ЪГН4)23208 ( 0.2 мас.% от АК) и ме-табисульфитом натрия Иа^С^ (0.2 мас.% от АК) в качестве инициатора [8]. Полимеризацию вели в течение суток при комнатной температуре. Полученный гель ПАК нейтрализовали раствором ЫаОН или М(СН3)4ОН и отмывали водой до установления постоянной величины набуха-емости при рН 8 - 9. Набухаемость Я определяли как Н = (тн - тс)/тс, где тн - масса набухшего образца, тс - масса сухого образца.
В работе использовали цитохром с сердца лошади (фирма ííSigma,\ США) молекулярной массы М = 12384, изоэлектрическая точка (ИЭТ) = 10.3.
Распределение цитохрома с в образцах геля определяли, фотометрируя поперечные срезы образцов поликомплексных гелей толщиной 2 мм при помощи микрофотометра "МФ-4" (Россия). Фотометрирование проводили, как показано на схеме I, лучом света от лампы накаливания без фильтра (размеры щели 0.5 мм х 10 мм) вдоль линии О — А, параллельной грани исходного образца и проходящей через его центр - точку А.
Ранее [7] мы показали, что цитохром с, лизоцим и про-тамин эффективно сорбируются из водных растворов СПАКа в широком интервале концентрации №С1 с образованием интерполимерного комплекса (ИПК), в котором белок и сетка связаны солевыми связями. При недостатке белка в окружающем гель растворе сорбция протекает практически до полного его исчерпания - равновесные
луч
Схема I
концентрации не превышают 10"6- 10~7 моль/л (концентрацию белка здесь и далее будем выражать в расчете на моль глобул белка.) Состав образующихся ИПК определяется степенью диссоциации белка и полиэлектролитной сетки и не зависит от соотношения компонентов в реакционной смеси.
В данной работе было изучено распределение цитох-рома с в продуктах незавершенных реакций полиакри-латного геля с белком. Сорбцию цитохрома с полиакри-латной сеткой проводили в нейтральных водных средах, содержащих различное количество №0 или М(СН3)4С1 (концентрацию соли варьировали в пределах 0 - 0.08 N ). Использовали образцы исходного равновесно набухшего в соответствующих солевых средах полиакрилатного геля в форме параллелепипеда с размером ребра 12 - 18 мм и массой 3.9 г для системы СПАЫа - ЫаС1 и с размером ребра 9 - 12 мм и массой 1 г для системы СПАМ(СН3)4 -М(СН3)4С1. Во всех случаях степень превращения в интерполимерной реакции (ИПР) составляла 0.2. Здесь Г - количество бежа, поглощенного образцом геля, отнесенное к максимальному количеству белка, которое способен поглотить гель при заданных условиях (рН и концентрация соли). Образцы частично превращенных гелей вьщерживали в равновесных растворах в течение определенного времени, затем делали срезы для фотометрирования.
На рис. 1,2 приведены фотометрические кривые таких срезов в терминах зависимости относительной оптичес-
кой плотности £>/£>
от расстояния г, которое отсчи-
тывали от края среза исследуемого образца вдоль линии О-С (см. схему I). Исходный равновесно набухший гель полностью прозрачен. Кривые 1-6 на рис.1 отвечают фотометрированию образцов продуктов незавершенных реакций между СПАЫа и цитохромом с полученных в растворах №С1 различных концентраций (рис.1). Конец
г, мм
Рис. 1. Кривые фотометрирования срезов гелевых образцов продуктов незавершенных ИПР между СПАЫа и цитохромом с при различных См<а (моль/л): 1- 0, 2 - 0.01, 3 - 0.02, 4 - 0.04, 5 - 0.06, 6 - 0.08 (рН 7, Г = 20°)
каждой кривой соответствует центру среза образцов. На оптическую плотность ИПК наряду с характеристическим поглощением цитохрома с при длине волны 409 нм влияет также и рассеяние света от слабонабухающего ИПК. Последнее обстоятельство не позволяет преобразовать фотометрические кривые в кривые распределения цитохрома с по образцу. Тем не менее кривые 1-6 на рис. 1 ясно отражают изменение характера распределения белка в продуктах незавершенных ИПР от ступенчатого (кривые 1 и2) до равномерного (кривая 6). Ступенчатый характер распределения цитохрома с соответствует наличию резкой границы между превращенной в ИПК периферийной частью образца, содержащей весь сорбированный цитохром с и внутренней частью образца, не содержащей белка и не отличающейся по оптическим характеристикам от исходного геля.
Такая картина наблюдается для образцов, полученных при сорбции белка СПАЫа в бессолевых средах или растворах с низкой концентрацией ЫаС1 (ниже 0.02 N), как показано на схеме П.
слой ИПК
Схема II
ИПК
= -18(///о), где / - интенсивность света, прошедшего через срез образца, /0 - интенсивность света, прошедшего через инверсионную среду (водный или водно-солевой раствор), £>,„„. - максимальное значение оптической плотности для каждого образца
При увеличении концентрации соли до 0.02 N ИаС1 и выше (кривые 3-6 на рис. 1 ) наблюдается прокрашивание всего образца геля. При этом в зависимости от концентрации №С1 распределение белка в объеме образца оказывается различным. Так, при концентрации соли 0.02 - 0.06 N наблюдается явно выраженный градиент концентрации белка ( кривые 3 - 5 ), а при концентрации ЫаС1 = 0.08 N образец геля прокрашивается равномерно (кривая 6). Кривые 1-6 на рис. 1 получены после выдерживания образцов в течение двух недель. При дальнейшем выдерживании образцов в равновесных растворах (в течение 3-4 недель), распределение белка в гелевых образцах, полученных при СМаС1= 0 - 0.0 Ш, сохраняется (микрофотометрические кривые совпадают с кривыми 1, 2 на рис.1). В образцах, полученных при СЫаС1 = 0.02 -0.06 Ы, с течением времени наблюдается все более и более равномерное распределение цитохрома с (микрофотометрические кривые приближаются к кривой б на рис.1).
Изменение характера распределения белка в сетке (от ступенчатого до равномерного ) наблюдается и при выдерживании продуктов незавершенной ИПР между СПАИа и цитохромом с, полученных в бессолевой среде, в водных растворах ЫаС1, СЫаС1 > 0.02Ы. При этом делая срезы гелевого образца через определенные промежутки времени можно визуально или микрофотометрически прослеживать постепенное размывание границы ИПК - свободный СПАЫа. Прокрашивание всего объема геля (т = 3.9 г) происходит за 2 - 4 недели, т.е. перераспределение белка по всему объему образца - процесс медленный по сравнению с сорбцией белка гелем. Показано, что общая ско-
О/Эмакс 1.0
МЙШ
0.8
0.6
0.4
0.2
■ А « +
X» х _ *
■*#
А««
Ъ А
х * ж •
♦ 1 т 2
а 3
* 4 ж 5
• 6
+ 7
о 8
*Ч_А ** • +
V-
♦X V
Рис. 2. Кривые фотометрирования срезов гелевых образцов
продуктов незавершенных ИПР между СПАЛ(СН3)4 и цитохромом с при различных С СПАЫ(СНЗ)4(моль/л): 1- 0.01, 2 - 0.02, 3 - 0.03, 4 - 0.05, 5 - 0.06, б - 0.07, 7 - 0.08, 8 - 0.08 (рН 7, Т =20°)
0.06 0.08 С, моль/л
Рис.3. Зависимости набухаемости (Я) от концентрации низкомолекулярной соли в растворе для: 7 - СПАЫа ,2 -СПАК(СН3)„ 3 - ИПК СПА - цитохром с
рость сорбции белка гелем достаточно высока (образец геля т = 3.9 г превращается в ИПК за четверо суток).
Таким образом, при проведении сорбции цитохрома с СПАЫа и в бессолевых и в водно-солевых средах в продуктах незавершенных реакций имеется более или менее резкая граница между ИПК и СПАИа. Однако, если в бессолевых средах эта граница сохраняется сколь угодно долго при выдерживании образца в воде, то в водно-солевых средах при СЫаС1 > 0.02М она со временем размывается, и равновесное состояние образца отвечает равномерному распределению белка в объеме геля. Такое перераспределение белка по объему геля в последнем случае не связано с разрушением ИПК СПАИа - цитохром с и переходом к пассивной диффузии белка в химически инертной среде. В предыдущей работе [7] нами было показано, что ИПК СПА№ - цитохром с стабилен вплоть до С да 0.12 N. Таким образом, во всем изученном интервале СЫаС ,= 0 - 0.08 N сорбция белка представляет собой активированный перенос с образованием в фазе геля химического соединения - ИПК. Однако характер сорбции ( наличие резкого фронта или постепенное размывание границы) существенно зависит от концентрации соли в растворе.
Можно думать, что тот или иной характер распределения белка в продуктах незавершенных реакций связан с особенностями коллапса полиэлектролитной сетки в результате взаимодействия с белком. Поэтому нами изучено влияние концентрации соли на степень контракции по-лиакрилатной сетки при взаимодействии с цитохромом с в водно-солевых средах.
На рис.3 представлены зависимости набухаемости исходного геля СГЪШа (кривая 1) и ИПК СПА - цитохром с
(кривая 3) от концентрации ИаС1 в растворе. Как видно из рис.3, в бессолевых водных растворах значения набухае-мости исходных гелей и ИПК различаются более чем на два порядка. В интервале СНаС1 = 0 - 0.02 N наблюдается резкое уменьшение ЯСПАНа, в то же время Ну^ остается практически неизменной. Таким образом, при СЫаС, > 0.02Ы значения набухаемости исходного геля и ИПК различаются мало, другими словами, в этих средах степень контракции сетки при взаимодействии с белком невысока. При сопоставлении этих данных с характером распределения цитохрома с в продуктах незавершенных ИПР оказывается, что в средах, в которых наблюдается ярко выраженное диспропорционирование в продуктах незавершенных ИПР, взаимодействие СПАИа с цитохромом с сопровождается сильной контракцией образца (масса образца уменьшается более чем на порядок). В солевой среде (СНаС1 > 0.02 И) взаимодействие менее набухшего в этих условиях полиак-рилатного геля с белком сопровождается незначительной контракцией образца. И именно в этих условиях наблюдается более или менее равномерное распределение белка в продуктах незавершенных реакций.
Очевидно, набухаемость полиэлектролитной сетки зависит не только от концентрации низкомолекулярной соли в системе, но и химической природы малых ионов. На рис. 3 (кривая 2) приведена зависимость СПАК(СН3)4 от концентрации 1Ч(СН3)4Вг в растворе. Как видно из рис. 3, при замене в системе ЫаС1 на К(СН3)4Вг удается увеличить набухаемость исходного полиакрилатного геля при постоянной ионной силе среды. Более высокая набухаемость геля СПА№ объясняется тем, что катион значительно сильнее связывается с карбоксилат-анионом чем катион К(СН3)4 [9] и оказывает более сильное экранирующее действие.
Следовательно, катион тетраметиламмония является слабым конкурентом в ИПР по сравнению с катионом натрия. Исследования стабильности ИПК СПАМ(СН3)4-цигохром с в водных растворах Ы(СН3)4Вг показали, что ИПК устойчив в водных растворах вплоть до С Ы(СНЗ)4Вг» 0.25 N.
Увеличение набухаемости исходного геля приводит к существенному расширению интервала концентрации соли, в котором ИПР СПА - цитохром с имеет фронтальный характер. Из рис.2 видно, что распределение бежа в продуктах незавершенных ИПР с СПАЫ(СН3)4 соответствует ступенчатому в интервале С Н(СНЗ)4Вг = 0 - 0.07 N (кривые 1- 6). При С Ы(СНз)4Вг= N начинается размывание границы между превращенной в ИПК внешней частью образца и внутренней областью (кривая 7). Кривые 1-7 получены микрофотометрированием срезов гелевых образцов, предварительно выдержаных в равновесных растворах в
течение 15 сут. При дальнейшем выдерживании образцов в равновесных растворах в течение 1-2 недель перераспределения цитохрома с в образцах, полученных в средах с С N(CH3)4Br ~ 0 ~ 0-07 N> не происходит (микрофотометрические кривые таких образцов совпадают с кривыми 01 - 6). Однако в гелевом образце продукта незавершенной ИПР CrLAN(CH3)4 с цитохромом с, полученном при С N(CH3)4Br = 0.08 N, граница между слоем ИПК CIIAN(CH3)4- цитохром с и внутренней частью непрореа-гировавшего CIIAN(CH3)4 еще больше размывается. Микрофотометрические данные, полученные для такого образца через 4 недели, представлены на рис.3, кривая 8 и соответствуют более или менее равномерному прокрашиванию бежом всего образца геля.
Таким образом, характер переноса полиионов в противоположно заряженных сетках определяется величиной контракции сетки в результате ИПР. Чем выше контракция, тем ярче выражен фронтальный характер интерполиэ-лектролитной реакции и в продуктах незавершенной ИПР наблюдается локализованный коллапс. Фронтальный характер ИПР непосредственно связан с энтропийной упругостью набухшей полимерной сетки. Ситуация, при которой в продукте незавершенной реакции контракции подвергается только часть геля, оказывается термодинамически предпочтительной. Действительно, проигрыш конфор-мационной энтропии системы при диспропорционирова-нии должен быть существенно меньше, чем в случае равномерного распределения пенетранта в сетке, поскольку в последнем случае контракции должен подвергнуться весь объем образца.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Рогачева В.Б., Превыш В.А., Зезин А.Б., Кабанов В. А. II Высокомо-лек.соед. 1988.30. С. 2120.
2. Рябина В.Р., Стародубцев С.Г., Хохлов А.Р. II Высокомолек. соед. 1990.32. С. 969.
3. Хохлов А.Р., Стародубцев С.Г., Василевская В.В. Conformational Transitions in Polymer Gels: Theory and Experiment. Adv.Polym.Sci., 1993,109-123.
4. Хандурина Ю.В., Рогачева В.Б., Зезин А.Б., Кабанов В.А. //Высо-комолек.соед.1994.36. С. 229.
5. Amiya Т., Tanaka Т.Н Macromolecules. 1987. 20. Р.1162.
6. Tanaka T.И Phys. Rev. Lett. 1978. 40. P. 820.
1 .Караганова В.Б., Рогачева В.Б., ЗезинА.Б., Кабанов В.А. II Высо-комолек.соед. 1995.37. С.1861.
8. Чупятов А.М., Рогачева В.Б., ЗезинА.Б., Кабанов В.А. //Высоко-молек.соед. 1994.36. С. 212.
9. ПергушовД.В., Изумрудов В.А.,Зезин А.Б., Кабанов В.А. //Высо-комолек.соед. 1993,35. С. 844.
Поступила в редакцию 05. 11. 96
