CC BY
21
УДК 677.494-614:577.15
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНАЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМ
НА ДИАЛЬДЕГИДЦЕЛЛЮЛОЗЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИМ КОМПЛЕКСОМ ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КРАБА
А.А. Белов, Л.А. Белова, В.Н. Филатов, Е.Н. Белова, Г.Н. Донских, М.Н. Горбунова
(НИИ текстильных материалов РИА, Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ РФ, РХТУ им. Д.И. Менделеева)
Изучено взаимодействие протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба (ПК), целлюлозы, диальдегидцеллюлозы (ДАЦ) и иммобилизованного на ДАЦ ПК, используемых в медицинской и косметологической практике, с основными ингибиторами протеиназ плазмы крови. Показано защитное действие текстильного носителя на иммобилизованные ферменты по отношению к внешней среде.
В настоящее время разрабатываются материалы с иммобилизованными на тканевой основе различными ферментными препаратами (лизоцим, коллитин, протео-литический комплекс из гепатопанкреаса краба (ПК) и др.) и физиологически активными веществами (мекси-дол, диметилсульфоксид, мочевина и др.)*. Данные композиции используют для лечения гнойно-некротических ран различной этиологии, а также в косметологии [1, 2]. Повышенное внимание к полиферментным препаратам объясняется их доступностью, простотой выделения и относительно небольшой стоимостью (обычно их цена в десятки, а то и сотни раз ниже, чем стоимость индивидуальных ферментов, получаемых из различных источников). ПК представляет собой набор эндопротеиназ и экзопептидаз и применяется в медицине в виде растворов и различных мазей [3]. При использовании этих препаратов в качестве раневых покрытий (перевязочных средств), необходимо учитывать взаимодействие иммобилизованных веществ и носителей с белками плазмы крови.
В плазме крови человека, наряду с иммуноглобулинами и альбуминами, имеется большое количество защитных белков - ингибиторов протеолиза (около 10% от общего содержания функционально активных белков). Ингибиторный потенциал крови представлен по крайней мере 8 белками: среди них особое значение для клиники имеют а1-протеиназный ингибитор (а1ПИ), а2-макроглобулин (а2-М), антитромбин III, а2-антиплазмин и С1-инактиватор [4]. Ингибитор а1ПИ (ранее называемый а1-антитрипсином) отвечает за 90% антитриптической активности плазмы крови [5]. Когда выяснилось, что физиологическое значение имеет торможение этим ингибитором протеиназ лейкоцитов, а не
трипсина, он был переименован. Этот гликопротеид (Мг = 54000 Да), имеющий самую высокую концентрацию, изучен более других ингибиторов плазмы [6]. Взаимодействие а1ПИ с протеиназами гранулоцитов происходит мгновенно, и комплекс очень трудно диссоциирует (Кинг для таких комплексов составляет 10 9-10 11 М) [7]. В активном центре а1ПИ содержится метионин, который легко окисляется, вследствие чего ингибитор теряет активность [8]. Белок а2М - самый большой из всех белков-ингибиторов (Мг = 725000 Да) - несколько отличается по механизму антипротеолитического действия от остальных ингибиторов плазмы крови и представляет собой ловушку для протеиназ. В отличие от классического механизма ингибирования протеиназа, находясь в комплексе с а2М, сохраняет свойство гидро-лизовать низкомолекулярные субстраты, а кроме того, может взаимодействовать с ингибиторами не очень большого размера (6500-20000 Да), т.е. ее активный центр экранирован, но не блокирован ингибитором [7]. В силу особенностей своего антипротеолитического действия а2М отличается широкой специфичностью и тормозит активность протеиназ всех классов: серино-вых, тиоловых, металло- и карбоксильных [6-9]. Порознь время полужизни протеиназы и а2М в кровотоке составляет ~1 сут, а его комплексы имеют период полужизни 1-2 мин [8, 9]. Причем соотношение ингибитор : фермент может составлять 1:1, 1:2 и 1:3 [9].
По данным литературы [8, 10-12], а1-протеиназный ингибитор а1ПИ), (а-1-антихимотрипсин (а1АХТ), а-2-макроглобулина (а2М) и интер-а-ингибитор трипсина (ИаИ) контролируют развитие инфекции и воспалительных процессов. Причем некоторые из этих ингибиторов являются белками острой фазы и могут быть
* Научно-исследовательский институт текстильных материалов выпускает иммобилизованные на текстильных носителях биологически активные вещества, в том числе трипсин, имеющий торговое название Дальцекс-трипсин (ФС 42-3008-99).
использованы в диагностических и прогностических целях. Наибольший интерес, на наш взгляд, предсталя-ют а1ПИ и а2М, так как а1ПИ - главный антипротео-литический фактор плазмы крови, а а2М является "чистильщиком" крови.
Целью настоящей работы являлось изучение взаимодействия ПК, целлюлозы, диальдегидцеллюлозы (ДАЦ) и иммобилизованного на ДАЦ ПК, используемых в медицинской и косметологической практике, с основными ингибиторами протеиназ плазмы крови.
Экспериментальная часть
В работе использовали протеолитический комплекс (ПК) из гепатопанкреаса краба (НПО "Биопрогресс" МО г. Щелково, Россия), этиловый эфир N-бензоил-Б,Ь-аргинина (BzArgOEt), трис(оксиметил)-аминометан ("Sigma", США), казеин по Гаммерстену (Россия), трипсин ("Spofa", Чехия), ингибитор трипсина из бобов сои ("Reanal", Венгрия).
В качестве носителя в настоящей работе использовали ДАЦ, полученную в результате перйодатного окисления целлюлозных тканых полотен. Степень окисления 1% означает, что из 100 звеньев целлюлозы окислено одно с образованием 2 альдегидных групп. Количество альдегидных групп на ДАЦ определяли либо конденсацией в кислой спиртовой среде с гидроксила-мином, либо окислением йодом в слабощелочных условиях [13]. Для иммобилизации использовали ДАЦ со степенью окисления 5,2±0,8%.
Иммобилизацию ПК проводили в оптимальных условиях, сохранение протеолитической активности ПК после иммобилизации (до высушивания иммобилизованного препарата) составило 100%.
Содержание белка на носителе определяли по методу Лоури-Гартли [14]. В качестве контрольного использовали носитель, обработанный теми же растворами, что и опытные образцы, но без фермента. Для построения калибровочной кривой использовали водный раствор фермента. Содержание белка на носителе составило для образцов, содержащих три фракции, 5,2±2,0 мг/г (в таблицах данный образец обозначен как ДАЦ-ПК), для образцов, отмытых от сорбированного белка водой и 0,1 М NaCl - 2,5±1,2 мг/г (в таблицах данный образец обозначен как ДАЦ-ПК+0,1 М NaCl).
Протеолитическую активность иммобилизованного ПК определяли методом Кунитца (гидролиз 1%-го раствора казеина по Гаммерстену в 1/15 М фосфатном буфере, рН 8,0 [15]). Она составила 700±80; 0,63±0,07 и 0,12±0,07 ПЕ/г для немодифицированного ПК, для образцов ДАЦ-ПК и ДАЦ-ПК+0,1 М NaCl соответственно.
Эстеразная активность немодифицированного ПК по BzArgOEt составила 3,8 мкМоль/мг мин, а по BzТуrOEt - 1,0 мкМоль/мг мин [5].
Для изучения взаимодействия текстильных материа-
Т а б л и ц а 1
Взаимодействие ингибиторов плазмы крови с раствором ПК в зависимости от времени совместной инкубации и концентрации ПК в растворе
Ингибитор Время совместной инкубации ПК и плазмы крови, ч Ингибирующая активность при объеме ПК, мкл
0 25 50
а2М 0,25 6,1±0,2 4,3±0,4 3,6±0,5
1,0 6,3±0,1 4,8±0,5 3,6±0,6
24,0 6,0±0,3 4,0±0,3 2,6±0,4
а:ПИ 0,25 28,0±3,5 19,4±2,5 13,3±2,0
1,0 28,0±3,5 22,7±3,0 13,9±1,5
24,0 25,6±3,5 22,8±3,0 13,7±2,0
лов и ингибиторов плазмы крови образцы носителей инкубировали с плазмой крови (соотношение носитель (вес):плазма (объем) = 1:6,1:10,1:18,1:20) при комнатной температуре. Аликвоты плазмы отбирали через 15 мин, 1 и 24 ч, разбавляли их в 10 раз физиологическим раствором и определяли активность ингибиторов. В специально проведенных опытах было установлено, что изучаемые ингибиторы плазмы крови не подвергаются значительному (в пределах погрешности измерений) расщеплению (с потерей ингибиторной активности) самим ПК. С этой целью раствор плазмы инкубировали при комнатной температуре с раствором ПК (концентрация ПК в физиологическом растворе составляла 5 мг/мл) и через разные интервалы времени определяли остаточную ингибирующую активность, используя в качестве контроля ингибирующую активность раствора плазмы крови без ПК. Полученные данные приведены в табл. 1. Активность а-2-макро-глобулина (а2М) определяли по остаточной активности трипсина, по гидролизу этилового эфира К-бензоил-Ь-аргинина после обработки пробы ингибитором трипсина из сои [5]. Активность а-1-протеиназного ингибитора измеряли по остаточной активности трипсина [5], отбирая для пробы 100 мкл разбавленной в 50 раз плазмы и 10 мкг трипсина.
Результаты и обсуждение
Было изучено взаимодействие ПК, целлюлозы, ДАЦ и иммобилизованного на ДАЦ ПК, используемых в медицинской и косметологической практике, с двумя основными ингибиторами протеиназ плазмы крови: а2М и а1ПИ.
Как было установлено в работе [16], ПК содержит в своем составе помимо истинной коллагеназы, различные протеазы, что и объясняет его широкую субстратную специфичность и уникальные терапевтические свойства.
При изучении взаимодействия иммобилизованного фермента с белками плазмы крови необходимо учиты-
вать, что фермент, содержащийся на носителе после иммобилизации, можно условно разделить на три составляющие: 1) механически включенный, 2) сорбированный, 3) ковалентно связанный.
Механически включенный фермент образуется за счет пропиточного раствора после удаления влаги с носителя. Эта часть фермента образует "ударную дозу" и выходит с носителя в первую очередь. Большая часть этого фермента взаимодействует с тканевыми ингибиторами протеиназ, а оставшаяся свободной (не образовавшая комплекс с ингибиторами) часть начинает процесс протеолиза гнойного отделяемого. В зависимости от условий иммобилизации количество этой фракции может достигать 15%.
Сорбированный фермент, связанный с носителем за счет ионных, водородных, ван-дер-ваальсовых связей и за счет неспецифической сорбции (как молекулами ДАЦ, так и самой немодифицированной целлюлозы). Это самая большая фракция, она обеспечивает депо-свойства наших препаратов.
Ковалентно связанный фермент - это фермент, связанный азометиновой связью аминогруппами белка, не входящими в активный центр, с альдегидными группами ДАЦ. Причем следует иметь в виду, что часть ко-валентно связанного фермента может переходить в раствор вследствие гидролитической деструкции носителя в виде растворимых и нерастворимых высокомолеку-
Т а б л и ц а 2
Взаимодействие а1ПИ и а2М с целлюлозными носителями, не содержащими ПК
Носитель Время Соотношение Сорбция, %
взаимодеи-ствия, ч носитель (вес): плазма (объем) а:ПИ а2М
Целлюлоза 0,25 1:10 5±5 0
1:20 6±4 0
ДАЦ 1:6 35±10 25±5
1:10 12±7 7±3
1:18 7±7 10±5
Целлюлоза 1 1:10 5±5 8±3
1:20 8±3 0
ДАЦ 1:6 48±5 42±8
1:10 18±7 11±5
1:18 25±6 10±8
Целлюлоза 24 1:10 1:20 0 9±6
ДАЦ 1:6 - -
1:10 20±8 37±7
1:18 - -
Т а б л и ц а 3
Взаимодействие иммобилизованного ПК с а1ПИ и а2М в плазме крови (соотношение матрица (вес): плазма крови (объем) = 1:10)
Носитель Время Сорбция, %
контакта, ч а:ПИ а2М
ДАЦ 1 17,5±5,0 11±5
24 20±5 37±5
ДАЦ-ПК 1 28±5 15±5
24 60±6 72±8
ДАЦ-ПК + 0,1 М №С1 1 15±10 11±5
24 35±8 49±5
лярных фрагментов. Чем выше степень окисления ДАЦ и чем более щелочное значение рН среды, тем легче и быстрее идет процесс гидролитической деструкции. Также следует иметь в виду, что в процессе хранения целлюлозный носитель деструктурирует.
В табл. 2, 3 приведены данные об изменении активности двух основных ингибиторов плазмы (за 100% принято содержание соответствующего ингибитора в образце плазмы) при взаимодействии с вышеперечисленными препаратами. При изучении взаимодействия эндогенных ингибиторов трипсина плазмы крови с ПК, иммобилизованным на ДАЦ, необходимо учитывать, что уменьшение активности ингибиторов плазмы крови может происходить в результате следующих процессов: 1) взаимодействие ферментов ПК с ингибиторами; 2) сорбция ингибиторов на ДАЦ и возможная модификация активных центров ингибиторов альдегидными группами носителя; 3) окисление метионина активного центра ингибитора (для а1ПИ) [8].
Как видно из данных табл. 2, сорбция ингибиторов на целлюлозных носителях зависит от соотношения плазмы и целлюлозного носителя. Немодифицирован-ная целлюлоза в отличие от ДАЦ обладает незначительной неспецифической сорбцией белковых молекул, процесс взаимодействия эндогенных ингибиторов протеиназ плазмы крови с иммобилизованным ПК растянут во времени, что связано, по-видимому, с защитным действием текстильного носителя (табл. 3).
Как было установлено в работе [17], санитарно-гигиенические свойства (такие как водопоглощение, воздухопроницаемость и др.) как самих носителей, так и препаратов иммобилизованных на них биологически активных веществ после их модификации йодной кислотой и иммобилизации фермента, не отличаются от соответствующих показателей необработанной медицинской марли. А сорбционные и химические свойства модифицированной целлюлозы и медицинской марли различны. Причем чем больше степень окисления
целлюлозы [18], выше температура, более щелочное значение рН, тем легче протекает гидролитическая деструкция носителя, что способствует высвобождению фермента, находящегося в глубине пор целлюлозы. Диаметр пор хлопковой целлюлозы приблизительно равен среднему гидродинамическому диаметру молекул ферментов (трипсин, химотрипсин, рибонуклеаза и др.)
[19]. В процессе деструкции происходит выделение во внешнюю среду фермента, находящегося в порах после иммобилизации.
Таким образом, представленный материал позволяет сделать вывод о защитном действии текстильного носителя на иммобилизованные ферменты по отношению к внешней среде.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Машковский М.Д. // Лекарственные средства. М., 1993. С. 58.
2. Толстых П.И., Гостищев В.К., Арутюнян Б.Н. и др. Протеоли-
тические ферменты, иммобилизованные на волокнистых материалах, в хирургии. Ереван, 1990. С. 136. 3. Лютова Л.В., Карабасова М.А., Руденская Г.Н. и др. // Вопр. мед. хим. 1998. Вып. 3. 44. С. 292.
4. Веремеенко К.Н. // Врачебное дело. 1987. № 5. С. 45.
5. Нартикова В.Ф., Пасхина Т.С. // Вопр. мед. хим. 1979. 25.
С. 494.
6. Werle E., Zickgraf-Rudel G. //Z. klin. Chem. und klin Biochem.
1972. 10. S. 139.
7. Travis J., Salvesen G.S. //Annu.Rev.Biochem. 1983. 52. Р. 655.
8. Fuchs H.E., Shifman M.A., Pizzo S.V. // Biochem. Biophys. Acta.
1982. 716. Р. 151.
9. Дубровин С.М., Муромцев А.В., Новикова Л.И. // Клин. лаб. Ди-
агностика. 2000. №6. С. 3.
10. Клиническая оценка лабораторных тестов. М., 1986.
11. Fritz H., Jochum M., Duswald K.N. // Proteinases in inflammation
and tumor invasion. Berlin-N.Y., 1986.
12. Hachulla E., Laine A., Blaringhem T. et al. // Presse Med. 1996. 25. P. 661.
13. БеловА.А., РыльцевВ.В., Гриценко С.И. // Сб. научн. тр. ВНИ-ИТГП. М., 1990. С. 36.
14. Белов А.А., Плеханова Н.Ю., Вирник Р.Б., Игнатюк Т.Е. // Сб. научн. тр. ВНИИТГП. М., 1988. С. 25.
15. Белов А.А., Рыльцев В.В., Игнатюк Т.Е. // Химико-фармацевтический журнал. 1992. № 11-12. C. 101.
16. Климова О.А., Чеботарев В.Ю. // Бюлл. эксп. биологии и медицины. 1999. 128. С. 308.
17. Самойлова Т.И., Рыльцев В.В., Коварский А.В., Петрова Н.А. // Сб. научн. тр. ВНИИТГП. М., 1988. С. 29.
18. Рыльцев В.В., Вирник Р.Б. // Антибиотики и химиотерапия. 1989. 34. С. 202.
19. Коликов В.М.,.Мчедлишвили Б.В. Хроматография биополимеров на макропористых кремнеземах. Л., 1986. С. 63.
Поступила в редакцию 25.10.02
