CC BY
25технология высоких урожаев
УДК 633.63:581.143.6 doi.org/10.24411/2413-5518-2020-10705
Изучение биохимических и молекулярно-генетических особенностей межвидовых гибридов сахарной свёклы
е.н. Васильченко, ст. научн. сотрудник
Т.П. ЖУЖЖАЛОВА, гл. научн. сотрудник, д-р биолог. наук, профессор О.А. ЗЕМЛЯНУХИНА, научн. сотрудник, канд. биолог. наук е.о. Колесникова, ст. научн. сотрудник
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова» (e-mail: biotechnologiya@mail.ru)
Введение
В современных условиях развития сельскохозяйственного производства приоритетным направлением в селекции сахарной свёклы является создание высокопродуктивных гибридов на линейной основе. В повышении продуктивности сахарной свёклы и производства сахара из этой культуры важная роль принадлежит созданию принципиально новых исходных материалов и на их основе сортов и гибридов, пригодных для возделывания по интенсивной технологии. Большая экономическая значимость сахарной свёклы в России требует в настоящее время внедрения в селекционный процесс нетрадиционных биотехнологических методов на основе культуры изолированных органов и тканей, позволяющих целенаправленно получать генетически улучшенный исходный материал для создания перспективных гибридов нового поколения. Данные технологии могут быть реализованы лишь с учётом специфики морфогенетических потенций развития органов растений, обеспечивающих в условиях in vitro активные процессы морфогенеза, регенерации и размножения [1].
Важнейшим методом обогащения культурных растений явля-
ется межвидовая гибридизация, посредством которой совершается передача ценных признаков от диких видов к культурным. Это позволяет расширить спектр генетической изменчивости сахарной свёклы, а также получить адаптивные генотипы с хозяйственно ценными признаками [2]. По литературным данным известно, что отдалённая и межвидовая гибридизация являются мощным стрессовым фактором, способным вызывать структурные изменения гибридизуемого генома в процессе его стабилизации [3].
Особое значение при разработке биотехнологических схем культивирования приобретает использование биохимических маркерных признаков, ускоряющих и облегчающих процессы создания и отбора форм растений с новыми свойствами в условиях in vitro. Физиолого-биохимический анализ на начальных стадиях развития созданных форм может помочь выделить наиболее интересные экземпляры с точки зрения устойчивости к разного рода стрессам, включая получение гибридных растений. Это связано с тем, что сами по себе условия in vitro являются стрессовыми, меняют программу работы генов, другими словами — изменяют эпигенетическую программу [4].
Для более эффективного применения в селекции полученных интрогрессивных форм, несущих новые гены устойчивости, представляет интерес исследование особенностей интрогрессии элементов донора.
Детекцию интрогрессии чужеродного генетического материала в геноме сахарной свёклы проводят с помощью ДНК-маркеров. В настоящее время широко используются методы исследования полиморфизма на уровне ДНК — установление нуклеотидной последовательности, метод полимеразной цепной реакции, метод рестрикционного анализа и др.
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), или специфичной амплификации ДНК, — наиболее простой и не требует больших материальных затрат, с его помощью изучают структуру генома, определяют степень гибридности, идентифицируют сорта, гибриды и линии. На данный момент разработаны различные модификации ПЦР и оценена их возможность для решения прикладных задач.
В связи с вышеизложенным целью настоящих исследований явилось выявление физиолого-биохимических и молекулярно-генетических особенностей у растений-регенерантов сахарной свёклы, полученных при межвидовой
34 САХАР № 7 • 2020
ТЕХНОЛОГИЯ ВЫСОКИХ УРОЖАЕВ
гибридизации, культивируемых в условиях in vitro.
Материалы и методы
В работе были использованы материалы Рамонской селекции ФГБНУ ВНИИСС им. А.Л. Маз-лумова.
Для получения межвидовых гибридов использовали мужскостерильную (МС) односемянную форму B. vulgaris L. (2n = 18) и фертильную многосемянную дикую форму B. corolliflora Z. (4n = 36). В целях получения межвидовых гибридов проводили принудительное опыление пыльцой дикого вида. Асептические незрелые зародыши от межвидовой гибридизации B. vulgaris х B corolliflora вводили в культуру in vitro на агаризованные питательные среды. Отбор полученных в результате скрещивания межвидовых форм с разным набором хромосом (2n = 18; 3n = 27; 2n = 27; 18) и их родительских компонентов осуществляли с помощью проточной цитофотометрии на анализаторе плоидности Partec PA.
Активность пероксидазы (ПО; КФ 1.11.1.7) определяли в гомогенатах тканей растений в реакции окисления бензидина. Активность
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД; КФ 1.1.1.49), определяли по методике А.А. Землянухина [5].
Детекцию интрогрессии чужеродного генетического материала в геном сахарной свёклы проводили методом ПЦР-амплификации с использованием видоспецифических праймеров [6].
Результаты исследований
В результате исследований выявлено, что диплоидные (2n = 18), триплоидные (3n=27) и миксопло-идные (2n = 27; 18) гибридные растения, полученные от скрещивания B. vulgaris L. х B. corolliflora Z., различались по общей активности фермента пероксидазы (ПО). Так, у диплоидных растений она оказалась примерно равной активности ПО у материнской формы и составила 9 ФЕ/мл; эта активность примерно на 4 ФЕ/мл выше, чем у отцовского компонента — дикой свёклы (рис. 1).
Следует отметить, что активность пероксидазы миксоплоид-ных растений-регенерантов была значительно (почти в 3 раза) ниже, чем у материнской формы, и её показатель соответствовал 3,5 ФЕ/мл. Триплоидные растения характеризовались понижен-
ной активностью данного фермента по сравнению с культурной свёклой в 3 раза (3,8—3,9 ФЕ/мл) и в 1,5 раза в сравнении с дикими видом B. corolliflora.
Изучение общей активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (глюкозо-6-Ф-ДГ) выявило значительное её повышение по сравнению с родительскими формами, которая у 27-хромосомных растений была выше в 2 раза (0,12 ФЕ/мл), а у 18-хромосомных растений — в 3,5 раза (0,18 ФЕ/мл). У миксоплоидных форм этот показатель составил 0,06 ФЕ/мл и практически не отличался от родительских компонентов (рис. 2).
Изменения ферментативной активности вызваны, по-видимому, стрессовым состоянием метаболизма гибридных растений при интрогрессии генома дикой свёклы в геном сахарной, а также изменением плоидности клеток.
В результате молекулярного анализа методом ПЦР у части растений, полученных от скрещивания B. vulgaris L. х В. corolliflora Z., был выявлен чужеродный генетический материал, присущий дикому виду. ПЦР-анализ позволил выявить у диплоидных и миксопло-
ФЕ/мл
12
ФЕ/мл 0,2 _
\о~ И
*5
\§-н
<2^
Рис. 1. Общая активность пероксидазы у родительских форм и межвидовых гибридов
Рис. 2. Общая активность глюкозо-6-Ф-ДГ родительских форм и гибридных растений
№ 7 • 2020 САХАР 35
технология высоких урожаев
идных гибридных потомств са-теллитные участки ДНК (размер амплифицированного фрагмента составил 161 п. н.), видоспецифичные для В. corolliflora Z. (рис. 3). У материнских МС-растений и 27-хромосомных растений данный фрагмент отсутствовал.
Выявленный продукт полимеразной цепной реакции (161 п. н.) является результатом специфического связывания праймера с матрицей, что подтверждает наличие сателлитной последовательности Нае III, которая представляет собой видоспецифический признак дикого вида свёклы В. comUiflom в геноме исследуемых растений. Результаты экспериментов указывают на то, что в составе генетического аппарата растений, полученных от скрещивания B. vulgaris х В. corolliflora, присутствуют некоторые элементы дикой свёклы. Это позволило нам предположить, что 18-хро-мосомные растения, несущие фенотип культурной свёклы, являются гибридными, имеющими отдельные элементы генома дикого вида; поэтому их можно использовать при отборе исходных форм для селекционной работы [7]. Кроме того, для выявления межвидовых гибридов свёклы ис-
пользуют также праймеры к са-теллитной ДНК, видоспецифичной для B. vulgaris.
Амплификация ДНК родительских форм и растений от межвидового скрещивания B. vulgaris х х B. corolliflora показала наличие элементов генома культурной свёклы в гибридных формах (рис. 4).
В результате амплификации геномных ДНК растений, полученных от скрещивания B. Vulgaris х х B. corolliflora, со специфическими праймерами, было установлено, что искомая сателлитная ДНК присутствует в диплоидной, миксоплоидной и триплоидной формах гибридов в разной степени выраженности. В миксопло-идной форме чётко выражены 4 тандемных повтора, в то время как в диплоидных и триплоидных растениях сателлитная последовательность повторяется большее число раз, о чём свидетельствует наличие минорных продуктов амплификации. Результаты указывают на то, что в составе генетического аппарата как диплоидных, триплоидных, так и мик-соплоидных растений, полученных от скрещивания B. vulgaris х х B. corolliflora, присутствуют элементы ДНК культурной свёклы. Анализ полученных электрофоре-грамм свидетельствует, что в гено-
6
ме B. vulgaris наблюдается наличие двух тандемов сателлитной ДНК. В геноме B. corolliflora таких повторов обнаружено не было.
Выводы
Представленные результаты показывают физиолого-биохимические особенности у растений свёклы в условиях in vitro, позволяющие проследить изменения активности фермента окислительного стресса - пероксидазы и некоторых ключевых ферментов основных метаболических циклов клетки.
В результате молекулярного анализа у диплоидных гибридов (2n = 18) и миксоплоидов (2n = 27; 18), полученных от скрещивания B. vulgaris L. х В. corolliflora Z., были выявлены сателлитные участки ДНК, видоспецифичные для дикого вида В. corolliflora Z.
Проведённый ПЦР-анализ родительских и гибридных форм с использованием праймеров к видоспецифической сател-литной ДНК B. vulgaris является точным методом идентификации
1 2 3 4 5 М
Рис. 4. Амплификация геномной ДНК родительских форм свёклы и гибридных растений со специфическими праймерами к сателлитной ДНК B. vulgaris: 1 — B. vulgaris; 2 — B. т-rolliflora; 3 — диплоидные растения (2n = 18); 4 — миксоплоидныерастения (2n = 27; 18); 5 — триплоидные растения (3n = 27); М — маркеры молекулярной массы ДНК
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Рис. 3. ПЦР-продуктыродительских форм и межвидовых гибридов: 1 — маркер молекулярной массы; 2, 6 — материнская МС-форма; 3, 8 — растения (3n = 27); 4, 9 — растения-миксоплоиды (2n = 27; 18); 5 — растение (2n = 18);
7 — B. corolliflora; 10 — отрицательный контроль (вода)
36 САХАР № 7 • 2020
чужеродного материала в геноме гибридных растений. В частности, метод амплификации геномной ДНК со специфическими праймерами к данной сателлит-ной ДНК можно использовать для оценки генетического родства гибридных и родительских форм свёклы.
В результате экспериментов выделены и отобраны межвидовые гибриды сахарной свёклы с морфологическими и функциональными изменениями генома, которые можно использовать в качестве исходных форм в процессе селекционной работы.
Список литературы
1. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. — Р.Г. Бутенко. — М., 1999. - 160 с.
2. Бунин, М.С. Межвидовая гибридизация в роде Capsicum L. и её использование в селекции. Методика / М.С. Бунин [и др.]. — М., 2008 — 82 с.
3. Тютерев, С.Л. Экологически безопасные индукторы устойчивости растений к болезням и физиологическим
стрессам / С.Л. Тютерев // Вестник защиты растений. — 2015. — Т. 1. — № 83. — С. 3—13.
4. Ванюшин, Б.Ф. Эпигенетика сегодня и завтра // Вавиловский журнал селекции и генетики. — 2013. — Т. 17. — № 4—2. — С. 805—832.
5. Землянухин, А.А. Большой практикум по физиологии и биохимии растений / А.А. Землянухин, Л.А. Землянухин. — Воронеж : ВГУ, 1996. — 188 с.
6. Буренин, В.И. Генетические ресурсы рода Beta (свёкла) / В.И. Буренин. — СПб., 2007. — 274 с.
7. Федулова, Т.П. Использование ПЦР-анализа для идентификации межвидовых гибридов Beta vulgaris х х Beta corolliflora zoss / Т.П. Федулова [и др.] // Биотехнология: состояние и перспективы развития. Пятый московский международный конгресс. Ч. 1. — М., 2009. — Стр. 312—313.
Аннотация. В статье приведена физиолого-биохимическая и молекулярногенетическая оценка межвидовых форм сахарной свёклы в культуре in vitro. Показано, что диплоидные (2n = 18), триплоидные (3n = 27) и миксоплоидные (2n = 27; 18) растения, полученные от скрещивания B. vulgaris L. х B. corolliflora Z., различались по общей активности пероксидазы и глюкозо-6-Р-дегидрогеназы.
В результате проведённого молекулярного анализа методом ПЦР у части растений, полученных от скрещивания, был выявлен чужеродный генетический материал, присущий дикому виду.
Ключевые слова: сахарная свёкла, межвидовые гибриды, биохимическая оценка, ПЦР-анализ.
Summary. The article presents a physiological-biochemical and molecular-genetic assessment of interspecific forms of sugar beet in in vitro culture. It was shown that diploid (2n = 18), triploid (3n = 27) and mixoploid (2n = 27; 18) plants obtained from crossing B. vulgaris L. х B. corolliflora Z. differed in the total activity of peroxidase and glucose-6-P-dehydrogenase. As a result of the conducted molecular analysis by PCR in some plants obtained from crossing, foreign genetic material inherent in the wild species was identified.
Keywords: suger beet, interspecific hybrids, biochemical assessment, PCR analysis
№ 7 • 2020 САХАР 37
