УДК 579.26, 579.62
ИЗУЧЕНИЕ АНТИБИОТИКОПРОДУКТИВНОСТИ И АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ
РОДА BACILLUS
Тарасова Е.И., студент группы 14Био(ба)Мб, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: ekaterina45828@mail.ru
Садуллоева Т.И., студент группы 14Био(ба)МБ, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: sadulloevat@mail.ru
В статье представлены данные по изучению антибиотикопродуктивности и антибиотикорезистентности пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus, а также изучение эффекта совместного применения антибиотиков и пробиотиков. В ходе проведенных исследований установлена родовая устойчивость бактерий рода Bacillus к цефтазидиму, азтреонаму, колистину и видовая устойчивость B.cereus и B.licheniformis 31 к пенициллину, цефиксиму, цефепиму, B.subtilis 534 к хлорамфениколу. При этом максимальная антагонистическая активность зарегистрирована в отношении S.aureus. Наиболее активным антагонистом является B.subtilis 534, а наименее активным B.cereus IP 5832. Изучение эффекта совместного применения в условиях in vitro позволяет судить о перспективе совместного использования B.subtilis 534 и B.subtilis 3 с пенициллином, B.licheniformis 31 и цефиксимом по отношению к S.aureus, B.licheniformis 31 с пенициллином в отношении S.aureus, B.subtilis 534 и B.cereus с цефиксимом - S.aureus и S.enteritidis, соответственно.
Ключевые слова: антибиотики, пробиотики, Bacillus, аддитивный эффект.
Актуальность. Основной проблемой последних лет является широкое распространение резистентных форм патогенных микроорганизмов и снижение эффективности ряда антибиотиков. Пробиотики, в отличие от антибиотиков, не оказывают отрицательного воздействия на нормальную микрофлору, поэтому их широко применяют для профилактики и лечения дисбактериозов.
Важной особенностью пробиотиков является их способность повышать противоинфекционную устойчивость организма [1,2], оказывать в ряде случаев противоаллергенное действие, регулировать и стимулировать пищеварение. В настоящее время в медицине уже широко используют лактобактерин, бифидум-бактерин, колибактерин, бификол, ацилакт [3] и другие пробиотические препараты.
Целью исследования: изучение антибиотикорезистентности и
антибиотикопродуктивности микроорганизмов рода Bacillus для разработки подходов к совместному применению антибиотиков и пробиотиков.
1) изучить антибиотикорезистентность пробиотических препаратов на основе бактерий рода Bacillus с использованием разных методов;
2) изучить антибиотикопродуктивность пробиотических препаратов на основе бактерий рода Bacillus;
3) определить эффективность совместного применения антибиотиков и исследуемых пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus в условиях in vitro.
Материалы и методы. В качестве объектов исследования использовались чистые культуры микроорганизмов: Bacillus subtilis 534 (из биопрепарата «Споробактерин»), ВасШт сеrеus 1Р 5832 (из биопрепарата «Бактисубтил»), а также были получены отдельные чистые культуры ВасШт subtilis 3 и ВасШт licheniformis 31, входящие в состав препарата «Биоспорин».
Для определения антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus нами использовались следующие методы: диско-диффузионный (ДДМ) и метод последовательных разведений [4]. Для
оценки антибиотикопродуктивности и эффективности совместного действия антибиотиков и пробиотиков нами использовался метод агаровых блочков и лунок [4].
Результаты исследования. По результатам ДДМ бактерии рода Bacillus оказались устойчивыми к цефтазидиму (цефалоспорины), азтреонаму (монобактамы), колистину (полимиксины), а B.cereus и B.licheniformis еще и к пенициллину (пенициллины), к цефепиму и цефиксиму (цефалоспорины), а B.subtillis 534 устойчив к хлорамфениколу (левомицетины). Все 4 штамма бактерии рода Bacillus проявили чувствительность к аминогликозидам, тетрациклинам, линкозамидам, макролидам.
Наиболее устойчивым является штамм B. cereus - он дает наименьшие зоны подавление антибиотиками, а B.subtillis 534 более чувствителен к антибиотикам, так как для него характерны наибольшие зоны подавления роста. Среди тест-организмов наиболее чувствительным является S.aureus, а устойчивым - S.enteritidis.
Исходя из проведенных предварительных исследований, нами были отобраны те антибиотики, к которым бактерии рода Bacillus оказались устойчивыми. В частности наибольший интерес для дальнейших исследований представили следующие антибиотики: пенициллин (группа пенициллинов); цефиксим (группа цефалоспоринов); колистин (группа полимиксинов); азтреонам (группа монобактамов).
Для проведения дальнейших исследований нам необходимо было определить минимальные подавляющие концентрации (МПК) изучаемых антибиотиков на рост исследуемых микроорганизмов. Для определения МПК использовали метод последовательных разведений. Дальнейшие исследования по определению МПК для комплексного применения антибиотиков и пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus были проведены со следующими антибиотиками: пенициллином (группа пенициллины) и цефиксимом (группа цефалоспорины) (таблица 1).
Анализ ряда разведений растворов антибиотиков, позволил определить концентрации, которые оказывают бактерицидное и бактериостатическое действие на исследуемые микроорганизмы, а также концентрации, которые не оказывают влияния на рост.
Для определения наличия роста исследуемых микроорганизмов пробирки с посевами просматривают в проходящем свете. Рост культуры в присутствии антибиотика сравнивают с контрольной пробиркой, содержащей исходный инокулюм и хранившейся в холодильнике. МПК определяют по наименьшей концентрации антибиотика, которая подавляет видимый рост микроорганизма.
Таблица 1. Определение минимальной подавляющей концентрации пенициллина и цефиксима методом последовательных разведений_
Анти-биотики Исследуемые микроорганизмы Тест-организмы
B.subtil-lis 534 B.cereus IP 5832 B.licheno-formis 31 B.subtil-lis 3 S. aureus E. coli S.enteritidis
Пенициллин тыс. ед. 6,51±1,303 13,02±2,61 13,02±2,607 6,51±1,303 3,25±0,65 1,29±0,33 2,27±0,86
Цефиксим г 0,03±0,007 0,05±0,013 0,05±0,013 0,03±0,007 0,01±0,003 0,12±0,003 0,01±0,002
Процесс образования антибиотиков микроорганизмами находится под контролем системы quorum-sensing (QS), которая проявляется в условиях повышенной плотности бактерий, когда концентрация популяция достигает некоторой критической величины. В результате бактерии начинают продуцировать внеклеточные сигнальные молекулы (аутоиндукторы). Под контролем QS-системы находятся гены, определяющие синтез факторов вирулентности, протеолитических систем, антибиотиков [5].
Для решения второй задачи нами проводились исследования по изучению антибиотикопродуктивности бактерий рода Bacillus, в ходе которых была выявлена их антагонистическая активность относительно тест-организмов. Наибольшая антагонистическая активность была выявлена по отношению к Staphylococcus aureus, так как пробиотики на основе
бактерий рода Bacillus вырабатывают антибиотикоподобные вещества, подавляющие преимущественно грамположительные микроорганизмы.
Первоочередной задачей являлось определение времени наибольшей выработки антибиотикоподобных веществ в питательную среду. Для этого мы использовали метод с агаровыми лунками. Бактерии рода Bacillus выращивали в питательном бульоне в течение 48; 72 и 96 часов. В дальнейшем опыте использовали фильтрат от бактерий, по результатам которого выяснили, что наибольшая выработка антибиотикоподобных веществ происходит на третьи сутки культивирования микроорганизма.
Изначально антибиотикопродуктивность бактерий рода Bacillus изучили при их культивировании на твердых питательных средах с использованием метода агаровых блочков (таблица 2).
Таблица 2. Сравнительная таблица по антибиотикопродуктивности бактерий рода Bacillus методом агаровых блочков_
Название штамма B.subtillis 534 B.cereus IP 5832 B.lichenoformis 31 B.subtillis 3
Staphylococcus aureus 27,7±0,33 23,3±0,33 24,3±0,33 23,0±0,58
Escherichia coli 24,0±0,58 22,3±0,33 22,7±0,33 22,3±0,33
Salmonella enteritidis 26,0±0,58 22,7±0,33 23,3±0,33 24,3±0,67
Дальнейшие исследования по определению антибиотикопродуктивности бактерий рода Bacillus проводили при культивировании на жидких питательных средах, а именно, с помощью метода агаровых лунок (рисунок 1) и метода наложения дисков, пропитанных антибиотиками.
Рисунок 1. Антибиотикопродуктивность бактерий рода Bacillus методом агаровых лунок
На рисунке 1 представлены зоны подавления тест-организмов вокруг лунок. Ранее мы определили, что именно на третьи сутки происходит наибольшая выработка антибиотикоподобных веществ у бактерий рода Bacillus.
Данные по зонам подавления тест-организмов Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis методом агаровых лунок представлены в таблице 3.
Исходя из анализа данных (таблицаЗ), полученных в результате эксперимента следует, что наибольшей антагонистической активностью обладает B.subtillis 534, а наименьшей -B.cereus. Диаметр зоны подавления тест-организмов находится в прямой зависимости от количества вырабатываемых антибиотических веществ бактериями рода Bacillus.
Таблица 3. Сравнительная таблица по антибиотикопродуктивности бактерий рода Bacillus методом агаровых лунок_
Название штамма B.subtillis 534 B.cereus IP 5832 B. lichenoformis 31 B.subtillis 3
Staphylococcus aureus 12,7±0,33 10,3±0,33 12,3±0,33 11,0±0,58
Escherichia coli 9,0±0,58 8,3±0,33 9,7±0,33 9,3±0,33
Salmonella enteritidis 11,0±0,58 8,7±0,33 10,3±0,33 9,3±0,67
При применении метода с наложением дисков также были получены диаметры зон подавления роста тест-организмов. Данные представлены в таблице 4.
Таблица 4. Сравнительная таблица по антибиотикопродуктивности бактерий рода Bacillus методом наложения дисков
Название штамма B.subtillis 534 B.cereus IP 5832 B. lichenoformis 31 B.subtillis 3
Staphylococcus aureus 15,0±0,58 11,3±0,33 14,0±0,58 12,3±0,67
Escherichia coli 12,7±0,33 12,7±0,67 14,7±0,33 11,3±0,88
Salmonella enteritidis 14,3±0,33 14,0±0,58 13,7±0.33 11,7±0,33
Из таблицы 4 следует, что при определении антибиотикопродуктивности бацилл методом наложения дисков B.subtillis 534 также является лидером по подавлению условно-патогенных микроорганизмов, а B.subtillis 3 в меньшей степени проявил свою активность.
При необходимости антибактериальной терапии рекомендовано совместное применение с антибиотиками пробиотиков [6]. И в такой ситуации очень важно чтобы штаммы, входящие в состав пробиотика были антибиотикоустойчивые.
Для каждой группы антибиотиков характерна своя мишень действия. Совместное применение пробиотика с антибиотиком может не только предотвратить развитие дисбактериоза, но и усилить эффект подавления патогенной и условно-патогенной микрофлоры, путем выработки пробиотиком антибиотикоподобных веществ, которые оказывают влияние на другую мишень действия. В этом случае можно установить явление синергизма (или аддитивность), когда происходит суммация антагонистического действия антибиотиков и пробиотиков, что имеет большую практическую значимость. Также можно зарегистрировать либо негативный эффект (антагонизм), когда антибиотикоподобные вещества, вырабатываемые бактериями, могут блокировать мишени действия антибиотиков, либо отсутствие какого-либо эффекта.
При необходимости антибактериальной терапии рекомендовано совместное применение с антибиотиками пробиотиков [6]. И в такой ситуации очень важно чтобы штаммы, входящие в состав пробиотика были антибиотикоустойчивые.
В связи с этим, учитывая результаты определения антибитикорезистентности бактерий рода Bacillus к антибиотикам, нами был проведен опыт по определению эффективности совместного действия антибиотиков и пробиотиков на условно-патогенные микроорганизмы.
На рисунке 2 показан результат совместного применения антибиотика цефиксима (левый рисунок) и B.cereus при подавлении Salmonella enteritidis, пенициллина (правый рисунок) и B.lichenoformis 31 при действии на Staphylococcus aureus.
Рисунок 2. Метод по совместному применению антибиотика и пробиотика на основе бактерий рода Bacillus (Примечание: 1 - фильтрат; 2 - антибиотик; 3 - антибиотик + фильтрат)
Обобщенные данные по эффективности совместного применения антибиотиков и пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus свидетельствуют, что совместное использование пробиотических препаратов на основе бактерий рода Bacillus с пенициллином и цефиксимом при подавлении тест-организма Escherichia coli является неэффективным. А практический интерес представляет сочетанное применение пробиотических препаратов «Спорбактерин» и «Бактисубтил» с цефиксимом (группа цефалоспоринов, 3 поколение) при подавлении Staphylococcus aureus и Salmonella enteritidis, а также использование препарата «Биоспорин» с пенициллином (группа пенициллинов) по отношению к Staphylococcus aureus.
Выводы. 1) установлена родовая устойчивость бактерий рода Bacillus к цефтазидиму, азтреонаму, колистину и видовая устойчивость B.cereus и B.licheniformis 31 к пенициллину, цефиксиму, цефепиму, B.subtilis 534 к хлорамфениколу;
2) установлена высокая антагонистическая активность исследуемых штаммов бактерий рода Bacillus в отношении тест-организмов с наиболее выраженным эффектом к S.aureus. Наиболее активным антагонистом является B.subtilis 534, а наименее активным B.cereus IP 5832;
3) установлена эффективность совместного использования B.subtilis 534 и B.subtilis 3 с пенициллином, а также B.licheniformis 31 и цефиксимом по отношению к S.aureus.
4) установлен аддитивный эффект при совместном применении B.licheniformis 31 пенициллином в отношении S.aureus, B.subtilis 534 и B.cereus с цефиксимом - S.aureus S.enteritidis, соответственно, что свидетельствует об их возможном комплексном применении.
Литература
1. Сизенцов, А.Н. Эффективность совместного применения пробиотиков и антибиотиков в условиях in vitro / А.Н. Сизенцов, Р.В. Ильясова // Вестник ОГУ. - 2011. -№ 12 (131). - С. 355-357.
2. Абрамова, Л.Л. Морфологическое обоснование эффективности применения пробиотических препаратов при лечении сальмонеллеза крыс / Л.Л. Абрамова, А.Н. Сизенцов, Н.В. Шеботина // Известия ОГАУ. - 2011. Т. 1. - № 29-1. - С. 192-195.
3. Абрамова, Л.Л. Оценка эффективности применения пробиотических препаратов при лечении сальмонеллеза на основании исследования показателей крови / Л.Л. Абрамова, А.Н. Сизенцов, Н.В. Шеботина // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2011. Т. 2. - № 30-1. - С. 249-253.
4. Сизенцов, А.Н. Методы определения антибиотикопродуктивности и антибиотикорезистентности / А. Н. Сизенцов // Методические указания к лабораторному практикуму. - Оренбург: ИПК ГОУ ОГУ, 2009. - 107 с.
5. Лыкова, Е.А. Пробиотики: характеристика препаратов и выбор в педиатрической практике / Е.А. Лыкова, Л.Н. Мазанкова // Антибиотики и химиотерапия. - 2001. - № 3. - С. 1418.
6. Clabots, C. R. Acquisition of Clostridium difficile by hospitalized patients: evidence for colonized new admissions as a source of infection / C. R. Clabots, S Johnson, M. M. Olson, L. R. Peterson // J Infect Dis. - 1992. - Vol. 166. - Vol. 5. - P. 561-567.