ВЛИЯНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА РОСТ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

УДК 579.26, 579.62

ВЛИЯНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА РОСТ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS

Чичерина В.Р., студент группы 14Био(ба)МБ, Оренбургский государственный университет, Оренбург

e-mail: valya_chicherinaa@mail.ru

Сапрыкина Е.Ю., студент группы 14Био(ба)МБ, Оренбургский государственный университет, Оренбург

e-mail: ellen-95@yandex.ru

Научный руководитель: Барышева Е.С., доктор медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой биохимии и микробиологии, Оренбургский государственный университет, Оренбург

В статье представлены данные по экспериментальному изучению влияния солей тяжелых металлов на рост пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus. В ходе проведенных экспериментов было установлено, что присутствие различных солей тяжелых металлов по-разному влияет на динамику роста исследуемых микроорганизмов. Но не смотря на это, наблюдается общая закономерность во влиянии одного и того же иона металла на все исследуемые микроорганизмы. Присутствие ионов свинца и железа оказывает стимулирующее действие на рост всех исследуемых микроорганизмов, а присутствие ионов кобальта и кадмия угнетает их рост. Присутствие ионов цинка и марганца не оказывает влияния на динамику роста исследуемых штаммов, исключение составляет лишь B. licheniformis для которого цинк является стимулятором роста.

Ключевые слова: тяжелые металлы, фазы роста, пробиотические штаммы, Bacillus.

Актуальность. В связи с возросшей антропогенной нагрузкой на экологическую систему в виде различных химических соединений, в том числе и соединений тяжелых металлов которые не только попадают в почву, воздух или воду, но также способны аккумулироваться в окружающей среде и переходят по экологическим звеньям из одной цепи в другую и оказывают влияние на жизнедеятельность не только макроорганизмов, но и микроорганизмов [1].

Так же как и макроорганизму для нормального роста и размножения микроорганизмам необходимо наличие в питательном субстрате микро- и макроэлементов ряд которых входит в группу тяжелых металлов, например такие, как кобальт, марганец, железо, медь, цинк.

При рассмотрении закономерностей взаимодействия тяжелых металлов с микроорганизмами необходимо также учитывать токсическое воздействие ионов тяжелых металлов на микроорганизмы. Основным проявлением токсического воздействия на микроорганизмы является задержка их роста и размножение, а также проявление бактерицидности ионов тяжелых металлов, что ведет к гибели микроорганизмов [2, 3].

Из литературных данных известно, что отдельные группы микроорганизмы при взаимодействии с ионами тяжелых металлов способны переводить их в металлическое нетоксичное состояние и накапливать в своей структуре. Причины накопления металлов микроорганизмами разнообразны так одни используют металлы в качестве источников микроэлементов или акцепторов электронов, а другие могут извлекать полезную энергию при окислении восстановленных соединений металлов. При восстановлении окисленных соединений металлов ряд микробов осуществляет процесс, который является, по-видимому, своеобразной формой дыхания [4, 5].

Особый интерес вызывает влияние ионов тяжелых металлов на микроорганизмы, которые оказывают положительное влияние на организм человека. К таким микроорганизмам относятся, например, бактерии входящие в состав пробиотических препаратов. «Пробиотики» в современном понимании - это бактерийные препараты из живых микробных культур,

предназначенные для коррекции микрофлоры хозяина и лечения ряда заболеваний. Наиболее часто в последнее время в качестве основы для таких препаратов используют представителей рода Bacillus.

Материалы и методы. На основании вышеперечисленных данных нами для проведения исследований в качестве объекта были использованы различные представители бактерий рода Bacillus входящих в состав пробиотических препаратов B.subtilis 534 (споробактерин), B.cereus (бактисубтил), B.subtilis 3 и B.licheniformis (биоспорин). В качестве металлов использовались водные растворы солей: Pb(NÜ3)2 FeSO4*H2O, ZnSO4, MnSO4*H2O, CoSO4*7H2O, CdSÜ4*8H2Ü, CrSÜ4 * 8H2O, NiSÜ4 * 7H2O, Hg(NÜ3)2.

Результаты и обсуждения. Для определения влияния металлов на рост микроорганизмов нами предварительно были определены минимальные подавляющие концентрации металлов методом последовательных разведений. В результате проведенных исследований были установлены концентрации солей исследуемых металлов не оказывающие бактерицидный и бактериостатический эффект (табл. 1).

Для изучения влияния исследуемых солей металлов на рост и размножение тестируемых микроорганизмов, нами определялись сроки наступления начальной, экспоненциальной и стационарной фаз роста бактерий рода Bacillus в периодической культуре в их присутствии.

Для определения фаз роста микроорганизмов в периодической культуре осуществлялось культивирование на жидких питательных средах. Влияние металлов на рост тест-организмов определяли путем измерения оптической плотности на фотоэлектроколориметре с интервалом 3 часа от фонового значения (рисунок 1, 2, 3, 4).

Исходя из полученных данных следует, что достоверно изменяются значения плотности относительно контроля при воздействии на кривые роста солей цинка, марганца, кобальта, кадмия, хрома, никеля и ртути. Также достоверные изменения наблюдаются при воздействии солей железа на кривые роста B. cereus, B. subtilis 3 и B. licheniformis.

Таблица 1. Определение минимальных подавляющих концентраций солей металлов не оказывающие бактерицидный и бактериостатический эффект_

Минимальные концентрации солей металлов не оказывающие бактерицидный и бактериостатический эффект, моль/л

Исследуемый штамм О) О & Рч О К * о сл <и Рч О сл й N о к * о сл о к о сл о о о к 8 о сл 13 о О к 8 о сл 1-4 и О к о сл № о & eg к

B.subtilis 534 0,05 0,00125 0,0006 0,0001 0,00001 0,000009 0,00004 0,00001 0,000004

B.cereus 0,0025 0,00063 0,0003 0,00008 0,000009 0,0000048 0,00001 0,000009 0,000001

B.subtilis 3 0,05 0,00125 0,0006 0,0001 0,00001 0,000009 0,00004 0,00001 0,000004

B.licheniformis 0,05 0,00125 0,0006 0,0001 0,00001 0,000009 0,00004 0,00001 0,000003

Согласно полученным данным достоверные изменения показателей плотности относительно предыдущих значений наблюдаются при воздействии на кривую роста В^пЬИИз 3 солей свинца, никеля и хрома. Так же достоверные изменения наблюдаются при воздействии данных солей металлов на кривые роста В.жЫШз 534, В.сегеш и B.licheniformis, аналогичная ситуация наблюдается при воздействии солей железа, цинка, кобальта, кадмия, никеля и ртути после 30 часов культивирования.

Q

^

л н о о К н о

4 с

5

и о <и сг К н с

о

0,2 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0

- Контроль

— FeSO4

—А— -ZnSO4

—■- -Pb(NO3)2

—♦— -MnSO4

—•-- - CoSO4

—■- CdSO4

—Ж— - CrSO4 * 8H2O

—0- -Hg(NO3)2

—X— NiSO4 * 7H2O

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 Сроки замеров (ч.)

Рисунок 1. Влияние солей тяжелых металлов на кривую роста B. subtilis 534.

Исходя из данных представленных на графиках (рисунок 1, 2, 3, 4) полученных в результате исследований можно сделать выводы, что лаг-фаза бактерий рода Bacillus длится примерно 3 часа. Экспоненциальная фаза роста длится у B. subtilis 534, у B. ссгсш и у B. subtilis 3 примерно 21час, у B. licheniformis примерно 24 часа.

0,2

Q О

ь т с о н

нто

л п

5

к с е ч и т п

о

0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0

0 3 6 9

Контроль

—•- FeSO4

—A— ZnSO4

— Pb(NO3)2

—♦— MnSO4

—•-- CoSO4

—■— CdSO4

—Ж— CrSO4 * 8H2O

—HEI— Hg(NO3)2

—X— NiSO4 * 7H2O

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 Сроки замеров (ч.)

Рисунок 2. Влияние солей тяжелых металлов на кривую роста B. cereus.

Стационарная фаза у B. св^т, у B. suЫШs 534, у B. suЫШs 3 наступает через 24 часа культивирования, у B. licheniformis через 27 часа. Также исходя из графиков было сделано заключение, что действие солей тяжелых металлов на время наступление и продолжительность фаз роста неоднозначно.

О

О

ь т с о н т о л п

5

к с е ч и т п О

0,2 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 Сроки замеров (ч.)

- Контроль

—•— Бе804

---А- - -2п804

-Ш~ -РЬ(Ш3)2

-♦— -Мп804

— - Со804

Сё804

—Ж— - Сг804 * 8Н20

—0-- -^(N03)2

—*— -N1804 * 7Н20

Рисунок 3. Влияние солей тяжелых металлов на кривую роста B. suЬtilis 3.

О О

ь т с о н т о л п

к с е ч и т п О

0,2 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0

0369

Контроль

—•— Бе804

—А— -2п804

—■- -РЬ(Ш3)2

—♦— Мп804

—•-- Со804

—■— Сё804

—Ж— Сг804

—ЕН -^(N03)2

—К- -N1804 * 7Н20

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 Сроки замеров (ч.)

Рисунок 4. Влияние солей тяжелых металлов на кривую роста B. licheniformis.

Так, железо и свинец, способствуют уменьшению времени наступления и продолжительности фаз роста у B. з^иМз 534, B. cereus и B. з^иМз 3, при этом продолжительность лаг-фазы составляет примерно 2 часа, экспоненциальной фазы 15 часов, стационарной фаза 21 час. В отношении кривой роста B.licheniformis железо и свинец действуют аналогично. Такое же действие на кривую роста B.licheniformis оказывает и цинк. При этом продолжительность лаг-фазы составляет примерно 2 часа, экспоненциальной фазы примерно 18 и стационарная фаза 24 часа, соответственно. На кривые роста других исследуемых микроорганизмов цинк влияния не оказывает.

Противоположное действие действию железа и свинца, в отношении кривых роста всех исследуемых микроорганизмов оказывают хром, никель, кобальт, кадмий и ртуть. Они способствуют удлинению времени наступления фаз роста. Так лаг-фаза у исследуемых микроорганизмов длится примерно 5-6 часов. Экспоненциальная фаза у B.suЬtilis 534 и у B.suЬtilis 3 под воздействием хрома и никеля длится примерно 24 часа, под воздействием кобальта и кадмия - 27 часов, ртути примерно 30 часов. У B.licheniformis экспоненциальная фаза в результате воздействия этих металлов составляет 30, 33 и 36 часов соответственно; у

B.cereus - 27, 30 и 33 часа соответственно. Стационарная фаза в результате воздействии солей хрома, никеля, кобальта, кадмия и ртуть, у B.suЫШs 534 и у B.subtШs 3 наступает примерно через 27, 30, 30 и 33 часа культивирования, у B.licheniformis она наступает через 33, 36, 36, и 39 часов, у B.cereus через 30,33 и 36 часов соответственно. Соли марганца влияния на время наступления и продолжительность фаз роста не оказывают.

Расчет Критерия Стьюдента показал, что статистически достоверные изменения значений плотности для всех исследуемых микроорганизмов в присутствии ионов кобальта и кадмия наблюдаются, начиная с экспоненциальной фазы роста, а в присутствии ионов железа, свинца, цинка и марганца по мере приближения и в течение стационарной фазы роста

Таким образом, соли металлов оказывают различное воздействие на кривые роста исследуемых микроорганизмов. Это также отражает дисперсионный анализ.

В результате проведения дисперсионного анализа было выяснено, что значительную степень влияния из используемых металлов на динамику роста B.suЫШs 534 оказывают ионы свинца, железа, кобальта и кадмия (рисунок 5).

£^0000000^

ОСОСОСОСОСОСОСО

^^ййОтз^р^гх

¡грнМ^ОО^^^

Рисунок 5. Степень влияния солей тяжелых металлов на кривую роста B.subtШs 534

Степень влияния ионов двух оставшихся металлов (цинк и марганец) незначительна. Такая же закономерность по результатам дисперсионного анализа наблюдается для B.suЫШs 3 и B.cereus Ш 5832 (рисунки 6 и 7).

244444442 £^0000000^

/-\GOGOGOGOGOGOGO

Н ^ се о тз ^ -л Н

х> ад

Рисунок 6. Степень влияния солей тяжелых металлов на кривую роста B.cereus

я и н

л в ь н е п е т С

90 80 70 60 50 40 30 20 10

77

2) 3)

0

£ Ь(

Р

65

59

66

48

18

ИШ

23

53

4 0 8 е

Рн

4 0 8 п

N

4 0 8 п

4 0 8 о С

4 0 8

тЗ

С

4 0 8 г

гС

4 0 8

2) 3)

0

£ Д

Рисунок 7. Степень влияния солей тяжелых металлов на кривую роста B.suЬtilis 3

Данные дисперсионного анализа для B.licheniformis характеризуются практически такой же закономерностью, что и для других трех штаммов, исключение составляет цинк. Так, в соответствии с рисунком 8, присутствие его ионов оказывает значительную степень влияния на динамику роста данного штамма.

я и н я и л в ь н е п е т С

90 80 70 60 50 40 30 20 10

78

2) 3)

0

£ Ь(

Р

63

54

13

49

Г777777]

62

69

4 0 8 е

Рн

4 0 8 п

N

4 0 8 п

4 0 8 о С

4 0 8

тз

С

4 0 8 г

гС

55

4 0 8

74

2) 3)

0

Ъ

ад Д

Рисунок 8. Степень влияния солей тяжелых металлов на кривую роста B.licheniformis

В итоге, по результатам дисперсионного анализа все анализируемые металлы по степени влияния на динамику роста исследуемых микроорганизмов можно разделить условно на: металлы, оказывающие высокую степень влияния на динамику роста исследуемых микроорганизмов - свинец, железо и кадмий; металлы, степень влияния которых составляет 50 % - кобальт, а в случае B.licheniformis еще и цинк; и металлы степень влияния, которых незначительна - цинк и марганец, в случае B.licheniformis только марганец. Также, анализируя результаты дисперсионного анализа, мы получили подтверждение вышеописанных графических данных динамики роста.

Выводы. В результате эксперимента было установлено, что присутствие различных солей тяжелых металлов по-разному влияет на динамику роста исследуемых микроорганизмов. Не смотря на это, наблюдается общая закономерность во влиянии одного и того же иона металла на все исследуемые микроорганизмы.

Присутствие ионов свинца и железа оказывает стимулирующее действие на рост всех исследуемых микроорганизмов, а присутствие ионов кобальта и кадмия угнетает их рост. Присутствие ионов цинка и марганца не оказывает влияния на динамику роста исследуемых

штаммов, исключение составляет лишь B. licheniformis для которого цинк является стимулятором роста.

Литература

1. Влияние тяжелых металлов на рост пробиотических штаммов E. coli M 17, E. faecium, L. acidophilus, L. Bulgaricus LB 51 и бактерий рода Bacillus в условиях in vitro / Сизенцов А.Н., Нугаманова Э.М., Пешков С.А. // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2011. - № 12 (131). - С. 358-360.

2. Sizentsov, A. The use of probiotic preparations on basis of bacteria of a genus Bacillus during intoxication of lead and zinc / A. Sizentsov, O. Kvan, A. Vishnyakov, A. Babushkina, E. Drozdova // Life Science Journal. - 2014. - Vol. 11 (10). - Access: http://www.lifesciencesite.com -(reference date: 15.09. 2016).

3. Холопов, Ю. А. Тяжелые металлы как фактор экологической опасности: Методические указания к самостоятельной работе по экологии для студентов / Ю. А. Холопов -Самара: СамГАПС, 2003. - 42 с.

4. Савельева, Т. А. Спорообразующие аэробные бактерии, используемые для получения пробиотиков [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.blagovesta.su. - (дата обращения: - 07.10.09).

5. Пешков, С.А. Исследование биоаккумуляции тяжелых металлов бактериями рода Bacillus с использованием рентгенофлюоресцентного анализа и атомно-силовой микроскопии // С.А. Пешков, А.Н. Сизенцов, А.Н. Никиян, Г.И. Кобзев / Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 4. - С. 526.

Научно исследовательская работа проводится в рамках:

1. Госбюджетная инициативная НИР «Экологические, биотехнологические и медико-ветеринарные аспекты применения пробиотиков» Номер госрегистрации: №01201176501.

2. Госбюджетная инициативная НИР «Изучение механизмов биоаккумуляции тяжелых металлов пробиотическими штаммами микроорганизмов и оценка эффективности их применения при интоксикации тяжелыми металлами, и лечении инфекционных заболеваний в комплексе с антибиотиками и экстрактами лекарственных растений» Номер госрегистрации: № АААА-А16-116110310071-0.