CC BY
148
УДК 579(222.4)
АККУМУЛЯЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ ПРОБИОТИЧЕСКИМИ ПРЕПАРАТАМИ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS
В УСЛОВИЯХ IN VITRO
Сизенцов А.Н. - к.б.н., доцент; Гальченко Т.А. - студент;
Мартынович Ю.И. - студент Оренбургский государственный университет, тел.: (3532) 37-24-80
Ключевые слова: Bacillus, тяжелые металлы, минимальные
подавляющие концентрации, аккумуляция.
Keywords: Bacillus, heavy metals, the minimum overwhelming concentration, accumulation.
Возрастающий уровень техногенной нагрузки способствует повсеместному накоплению химических поллютантов. Одно из ведущих мест среди большого разнообразия веществ, загрязняющих окружающую среду занимают тяжелые металлы [4, 1].
К тяжелым металлам относят химические вещества периодической системы Д.И. Мендилеева, имеющие относительную атомную массу свыше 50 атомных единиц. Также одним из признаков, которые позволяют относить металлы к тяжелым, является их плотность. Также к тяжелым металлам отнесены элементы, плотность которых более 5 г/см (данная плотность соответствует железу). Из чего следует, что к тяжелым металлам можно отнести 43 из 84. Среди них 10 металлов обладают наряду с металлическими свойствами признаками неметаллов (представители главных подгрупп VI, V, IV, III групп периодической системы, являющиеся р-элементами), поэтому более строгим был бы термин «тяжелые элементы», но общепринятым в литературе термином является «тяжелые металлы» [2].
Загрязнение окружающей среды различными токсичными соединениями, в частности металлами, неуклонно растет с каждым годом. При этом уровень утилизации остается низким. Это привело к накоплению вредных и ядовитых веществ в земле и водоемах, к резкому снижению биопотенциала экосистем и загрязнению пищевых продуктов, в результате чего идет загрязнение внутренней среды организма человека и животных через пищу, воздух, воду [5].
Особенностью металлов является их тенденция к биоаккумуляции. Известно, что способность концентрировать металлы, в том числе и тяжелые, очень широко распространена в природе среди различных организмов. Настоящими «рекордсменами» по извлечению тяжелых металлов из окружающей среды являются микроорганизмы. Так,
представители рода Saccharomyces способны аккумулировать до 30 % меди, что в десятки раз больше, чем в окружающей среде. Большой интерес вызывает изучение данной способности среди микроорганизмов, входящих в состав пробиотических препаратов, в частности у бактерий рода Bacillus, являющихся самоэлеминирующимися антагонистами [3].
Пробиотические препараты обладают такими свойствами, как ярко выраженная антагонистическая активность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, высокая ферментативная активность, иммуностимулирующее действие. Но помимо этого важным свойством является антитоксическое действие пробиотиков, в частности проявляющееся в накоплении и активном выведении тяжелых металлов из организма. Из этого следует, что важным вопросом является оценить эффективность применения пробиотиков на основе рода Bacillus при отравлении тяжелыми металлами. В связи с вышеизложенным целью нашей работы явилось изучение аккумулирующей способности пробиотических штаммов бактерий рода Bacillus в условиях in vitro.
Материалы и методы. В качестве объекта были использованы различные представители бактерий рода Bacillus входящих в состав пробиотических препаратов B. subtilis 534 (споробактерин), B. cereus (бактисубтил), B. subtilis 3 и B. licheniformis (биоспорин). В качестве металлов использовались водные растворы солей: Pb(NO3)2, FeSO4*H2O, ZnSÜ4, MnSO4*H2O, CoSO4*7H2O, CdSO4*8H2O.
Для изучения влияния металлов на рост микроорганизмов нами предварительно были определены минимальные подавляющие концентрации металлов методом последовательных разведений. В результате проведенных исследований были установлены концентрации солей исследуемых металлов, не оказывающие бактерицидный и бактериостатический эффект (табл. 1).
1. Минимальные концентрации солей металлов, не оказывающие бактерицидный и бактериостатический эффект, моль/л
Исследуемый штамм Соли металлов
Pb(NÜ3)2 FeSÜ4*H2Ü ZnSO4 MnSÜ4*H2Ü CoSÜ4*7H2Ü CdSÜ4*8H2Ü
B. subtilis 534 0,05 0,00125 0,00063 0,0001 0,00001 0,000009
B. cereus 0,0025 0,00063 0,0003 0,00008 0,000009 0,0000048
B. subtilis 3 0,05 0,00125 0,00063 0,0001 0,00001 0,000009
B.licheniformis 0,05 0,00125 0,00063 0,0001 0,00001 0,000009
Перед внесением инокулята в жидкие питательные среды вносились соли исследуемых металлов в концентрациях, приведенных в таблице 1. Количественное определение поглощенного железа и свинца микроорганизмами B. subtШs 534, B. subШis 3 и B. cereus в биомассе и фильтрате жидкой питательной среды осуществлялось через 21 час; цинка
- и марганца - 24 часа; кобальта и кадмия через 30 часов у B. subtШs 534, B. suЫШs 3 через 33 часа культивирования. Определение количества поглощенного свинца, железа и цинка тест-организмом B.licheniformis осуществлялось через 24 часа; кобальта и кадмия через 36 часов; марганца
- 27 часов культивирования в биомассе и фильтрате жидкой питательной среды.
Культивирование исследуемых микроорганизмов проводилось до наступления стационарной фазы, после чего производили отделение биомассы от питательной среды путем фильтрации и центрифугирования. Пробы выпаривали на плитке и отжигали в муфеле, затем осуществлялось определение количества адсорбированного металла отдельно в биомассе и питательной среде с помощью атомно-адсорбционного спектрофотометра.
Предварительной работой являлось определение количества исследуемых металлов в питательном субстрате до внесения рабочих концентраций с целью исключить возможное влияние на показатели накопления.
Из полученных данных, представленных в таблице 2, следует, что концентрации металлов, содержащиеся в питательном субстрате, находятся ниже порога определения атомно-абсорбционного спектрофотометра (ААСФ). Исключение составляет железо, но его содержание в субстрате не значительно и не оказывает влияния на полученные результаты [2].
2. Количественное содержание металлов в питательной среде до внесения
рабочих концентраций их солей, М/л
Металл Концентрации, вносимые в питательную среду Минимальные концентрации определяемы в ААСФ Концентрации металлов в питательной среде
Бе 0,0006 - 0,00125 0,0000002 0,000002
2п 0,0006 - 0,00125 0,000003 не обнаружено
РЬ 0,005 - 0,01 0,00003 не обнаружено
Мп 0,00008 - 0,00015 0,00006 не обнаружено
Со 0,00001 - 0,00002 0,0000003 не обнаружено
Сё 0,00001 - 0,00002 0,0000009 не обнаружено
Определение способности исследуемых микроорганизмов к избирательной в накоплению тяжелых металлов проводилось с помощью атомно-абсорбционного метода. Основное отличие от предыдущего эксперимента заключают в том, что в среду для культивирования одновременно вносились все исследуемые металлы в рабочих концентрациях, а также в сроках культивирования. Время культивирования, для данного эксперимента, определялось путем изучения динамики роста исследуемых микроорганизмов в присутствии всех
используемых металлов и установления времени наступления стационарной фазы роста.
Результаты исследования. Нами было установлено, что всеми исследуемыми культурами наиболее активно поглощается свинец. На втором месте для B. cereus, B. subtilis 3 и Bacillus licheniformis цинк, на третьем месте железо. Для штамма B. subtilis 534 на втором месте находится железо, на третьем цинк. В небольших количествах данные культуры микроорганизмов накапливают марганец, кобальт и кадмий (р<0,01).
Лучшими биосорбентами из всех исследуемых культур относительно свинца, железа и кадмия является B. subtilis 534 «Споробактерин» и B. subtilis 3 «Биоспорин», относительно цинка и марганца - B. cereus «Бактисубтил». Поглощение кобальта в больших количествах относительно других исследуемых микроорганизмов наблюдалось у B. licheniformis, входящего в состав препарата «Биоспорин» (р<0,01).
В результате проведенного эксперимента по изучению избирательного накопления тяжелых металлов были получены данные, из которых следует, что все исследуемые микроорганизмы избирательно аккумулируют ионы свинца, железа, цинка и практически не накапливают ионы марганца, кобальта и кадмия. Степень взаимосвязи поглощения металлов между собой была установлена с помощью кореляционного анализа.
Проведение расчета корреляционной зависимости показателей накопления ионов металлов для исследуемых микроорганизмов показала, что наблюдается разная степень их корреляции. Так, расчет данного критерия для B.subtilis 534 показал, что наблюдается сильная положительная зависимость между показателями накопления ионов свинца, железа, цинка и кобальта, слабая положительная корреляция между показателями накопления кадмия с другими металлами и отрицательная зависимости между ионами марганца и других металлов. При этом положительная корреляция свидетельствует о том, что накопление одного металла ведет к накоплению другого, а отрицательная свидетельствует об обратном.
Исключение составляют показатели корреляционной зависимости накопления ионов марганца с ионами других металлов, они характеризуются отрицательной корреляцией в отличие от данных показателей у B.subtilis 534. Также наблюдаются различия в показателях зависимости накопления ионов железа и кобальта (в случае B.cereus IP 5832) от других металлов, которые характеризуются обратной корреляционной зависимостью. В случае B.licheniformis не наблюдается положительной связи между показателями накопления всех исследуемых металлов, а в случае показателей зависимости накопления ионов кобальта с другими металлами отмечается ее отсутствие.
Заключение. Лучшим биосорбентом ионов свинца и железа является штамм B.subtilis 534. Максимальные значения по накоплению ионов цинка отмечаются для штамма B.subtilis 3, марганца для B.cereus, кобальта для B.licheniformis. Значительных различий в значениях накопления ионов кадмия между исследуемыми штаммами не наблюдается.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Вишняков А.И., Лебедев С.В. Особенности влияния кадмия на минеральный обмен и морфологическое состояние репродуктивной системы млекопитающих и птиц // Фундаментальные исследования. 2011. - № 9-1. - С. 135-138. 2. Ливинская С.А.,
Владимирский П.В., Данильчук В.П. Разработка метода подготовки проб атомно-абсорбционному спектральному анализу для определения содержания тяжелых металлов в растительных маслах // Вестник ВГУ. -2005. - № 2. - С. 38-42. 3. Савельева, Т.А. Спорообразующие аэробные бактерии, используемые для получения пробиотиков [Электронный ресурс]. // 2008. - Режим доступа: http://www.blagovesta.su. - 7.10.09. 4. Сизенцов, А.Н. Влияние тяжелых металлов на рост пробиотических штаммов E.coli M-17, E.faecium, L.acidophilus, L.bulgaricus и бактерий рода Bacillus в условиях in vitro / Сизенцов А.Н., Нугаманова Э.М., Пешков С.А. // Вестник ОГУ. - 2011. - №12. - С. 358-360. 5. Холопов Ю.А. Тяжелые металлы как фактор экологической опасности: Методические указания к самостоятельной работе по экологии для студентов / Ю. А. Холопов - Самара: СамГАПС, 2003. - 42 с.
АККУМУЛЯЦИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ ПРОБИОТИЧЕСКИМИ ПРЕПАРАТАМИ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS В УСЛОВИЯХ IN VITRO
Сизенцов А. Н., Гальченко Т. А., Мартынович Ю. И.
Резюме
Изучена устойчивость бактерий рода Bacillus к различным концентрациям тяжелых металлов. Установлены штаммовые особенности бактерий рода Bacillus к накоплению тяжелых металлов в условиях in vitro. Получены результаты степени взаимосвязи поглощения металлов между собой с помощью кореляционного анализа.
ACCUMULATION OF HEAVY METALS PROBIOTIC PREPARATIONS ON THE BASIS BACTERIA OF SORT BACILLUS IN THE CONDITIONS OF IN VITRO
Sizentsov A.N., Galchenko TA., Martinovich Y.I.
Summary
Stability of bacteria of sort Bacillus to various concentration of heavy metals is studied. Are established shtammovie features of bacteria of sort Bacillus to accumulation of heavy metals in conditions in vitro. Results of degree of interrelation of absorption of metals among themselves with the help korrelation the analysis are received.
