CC BY
9БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ УДК 579.26, 579.62
АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ И АНТИБИОТИКОПРОДУКТИВНОСТЬ НЕ ОБРАЗУЮЩИХ СПОР ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
Ефремова А.В., студент группы 13Био(ба)Бх, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: efrusik95@mail.ru
Володченко В.Ф., студент группы 15Био(м)МВ, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: viktorinka0312@mail.ru
Научный руководитель: Барышева Е.С., доктор медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой биохимии и микробиологии, Оренбургский государственный университет, Оренбург
Применение антибактериальных препаратов приводит к нежелательным последствиям, нарушает состав и активность нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта. К сожалению, в настоящее время нельзя полностью отказаться от использования антибактериальных препаратов в клинической практике. Накопленные научные данные подтверждают эффективность совместного использования антибиотиков и пробиотиков. А именно, что сочетанное применение с антибиотиком пробиотика может не только предотвратить развитие дисбактериоза, но и усилить эффект подавления патогенной и условно-патогенной микрофлоры, путем выработки пробиотиком антибиотикоподобных веществ, которые оказывают влияние на другую мишень действия. Полученные экспериментальный в условиях in vitro данные свидетельствуют, комплексное применение антибиотиков и пробиотиков в одном случае приводит к негативному эффекту (E. faecium+цефтриаксон по отношению к S. аureus), в другом к положительному результату (E. coli M-17+ванкомицин по отношению к E. coli), а в третьем случае нейтрально (E. faecmm+канамицин по отношению к B.subtilis 534).
Ключевые слова: Escherichia coli M-17, Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus, пробиотики, антибиотики, антибиотикорезистентность.
Актуальность. Основной проблемой последних лет является широкое распространение резистентных форм патогенных микроорганизмов и снижение эффективности ряда антибиотиков. Пробиотики, в отличие от антибиотиков, не оказывают отрицательного воздействия на нормальную микрофлору, поэтому их широко применяют для профилактики и лечения дисбактериозов.
Важной особенностью пробиотиков является их способность повышать противоинфекционную устойчивость организма, оказывать в ряде случаев противоаллергенное действие, регулировать и стимулировать пищеварение. В настоящее время в медицине уже широко используют лактобактерин, бифидум-бактерин, колибактерин, бификол, ацилакт и другие пробилтические препараты.
В наши дни большинство врачей назначают антибиотики и пробиотики вместе, с тем, чтобы снизить неблагоприятные последствия антибиотикотерапии [1, 2, 3]. Это связано с тем, что антибиотики убивают не только патогенную микрофлору, но также и определенные полезные бактерии, которые живут в желудочно-кишечном тракте. Пробиотики помогают в поддержании природного равновесия полезных бактерий в кишечнике. В связи с этим в настоящее время чрезвычайно актуальным является совместное применение антибиотических и пробиотических препаратов [4].
Полезная микрофлора нашего организма обеспечивает нам защиту, необходимую для здорового существования. Но, к сожалению, полезные бактерии защитить некому. Даже разовое сильное стрессовое состояние способно привести к уничтожению всех лактобактерий в тонком кишечнике. Одна доза такого препарата, как антибиотик, который вынужденно применяется против инфекций, убивает в тысячи раз больше полезных организму бактерий, чем все население нашей планеты [5, 6].
Целью исследования: изучение антибиотикорезистентности и
антибиотикопродуктивности исследуемых микроорганизмов для разработки подходов к совместному применению антибиотиков и пробиотиков.
Для достижения поставленной цели нами были выдвинуты следующие задачи:
1. Изучить антибиотикорезистентность Escherichia coli M-17, Enterococcus faecium и Lactobacillus acidophilus, входящих в состав пробиотических препаратов, с использованием различных методов (с применением тест-систем и диско-диффузионным).
2. Изучить антибиотикопродуктивность Escherichia coli M-17, Enterococcus faecium и Lactobacillus acidophilus, входящих в состав пробиотических препаратов.
Определить эффективность совместного применения антибиотиков и исследуемых пробиотиков в условиях in vitro.
Материалы и методы. В качестве объектов наших исследований были выбраны штаммы Escherichia coli M-17 (из пробиотика «Колибактерин»), Enterococcus faecium («Линекс») и Lactobacillus acidophilus («Линекс»).
Диско-диффузионный метод (ДДМ) определения чувствительности основан на способности антибиотика диффундировать из стандартных дисков, пропитанных антибиотиками в питательную среду, угнетая рост микрооганизмов, посеянных на поверхность агара [7].
Метолд серийных разведений. Данный метод используется для определения количества антибиотика в культуральных жидкостях, растворах или экстрактах. Для работы подготавливаем питательный бульон, пригодный для развития выбранного тест-организма. Непременное условие - бульон должен быть прозрачным. Одновременно с этим подготавливаем и культуру тест-организма. Стерильный питательный бульон разливаем в чистые стерильные пробирки. Количество бульона должно обеспечивать нужную степень разведения изучаемого антибиотика [7].
Метод определение антибиотиотикопродуктивности микроорганизмов при культивировании их в жидких питательных средах. Антибиотикопродуктивность бактерий определяют путем культивирования бактерий в жидких питательных средах с определенной периодичностью, для того, чтобы определить на какое время приходится наибольшая выработка антибиотикоподобных веществ. Для того, чтобы это определить, мы использовали метод с агаровыми лунками [7].
Совместное применение антибиотиков и пробиотиков чашечным методом [7]. Выше изложенные методы изучения антибиотикорезистентности и антибиотикопродуктивности послужили ключом для разработки подходов к совместному применению антибиотиков и пробиотиков.
Чашки Петри с МПА засеяли сплошным «газоном» тест-организмами (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, B. subtilis, B.cereus). Затем наложили диски из фильтровальной бумаги, промоченные: первый-фильтрат, второй - антибиотик определенной концентрации, к которому условно-патогенные микроорганизмы оказались умеренно чувствительными, а третий - фильтрат и антибиотик, для того, чтобы узнать их влияние друг на друга.
Результаты и обсуждения. Первоначальным этапом нашего исследования было определение антибиотикорезистентности пробиотических препаратов («Колибактерин» и «Линекс») на основе Escherichia coli М 17, Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus с применением тест-систем «Bio Merieux» и диско-диффузионного метода.
Критерием отбора антибиотиков для диско-диффузионного метода к которым исследуемые штаммы микроорганизмов проявляли резистентность послужило определение антибиотикочувствительности с использованием тест-систем «Bio Merieux» чтобы отобрать антибиотики, к которым исследуемые микроорганизмы устойчивы, а тест-организмы -умеренно-чувствительны.
Полученные на первом этапе данные по определению антибиотикорезистентности с использованием тест-систем «Bio Merieux» свидетельствуют, что все три исследуемых штамма оказались устойчивы к пенициллину, ампициллину, к цефуроксиму (из группы цефалоспоринов), к линкомицину (из группы линкозамидов), колистину (из группы полимиксинов). Escherichia coli и Enterococcus faecium оказались устойчивы к тикарциллину, мециллинаму (из группы пенициллинов), к цефтазидиму (из группы цефалоспоринов), к имипенему (из группы карбопенемов), к эритромицину и ристомицину (из группы макролидов). Escherichia coli-M17 устойчива к аминогликозиду (из группы пенециллинов), цефатоксиму, цефатетану (из группы цефалоспоринов), гентамицину (из группы аминогликозидов). В свою очередь Enterococcus faecium проявляет устойчивость к цефокситину (из группы цефалоспоринов), стрептомицину, канамицину (из группы аминогликозидов), азтреонаму (из группы монобактамов). А Lactobacillus acidophilus оказался устойчивым к стрептомицину и канамицину (из группы аминогликозидов), цефоперазону (из группы цефалоспоринов), тетрациклину (из группы тетрациклины). Эти антибиотики нам необходимы в дальнейших исследованиях определениях антибиотикорезистентности диско-диффузионным методом.
Из условно-патогенных микроорганизмов S. enteritidis умеренно-чувствительна к пенициллину, ко всем антибиотикам из группы аминогликозидов, к цефуроксиму, цефокситину, цефоперазону, цефиксиму (цефалоспорины), к хлорамфениколу (левомиценины). А S. aureus и E. coli устойчивы к пенициллину, но умеренно-чувствительны к ампициллину, мециллинаму (пенициллины), к стрептомицину (аминогликозиды).
Оба штамма бактерии рода Bacillus оказались устойчивы к пенициллину, оксациллину, тикарциллину, мециллинаму (из группы пенициллинов), к цефуроксиму, цефтазидиму, цефлулодину, цефиксиму (из группы цефалоспоринов), к имипенему (из группы карбопенемов), к линкомицину (из группы линкозамидов), к хлорамфениколу (из группы левомицетинов), к азтреонаму (из группы монобактамов) и к колистину (из группы полимиксинов).
Антибиотикорезистентность определяли также диско-диффузионным методом (ДДМ) при использовании стандартных дисков, содержащих антибиотики.
По результатам ДДМ (таблица 1, 2, 3) исследуемые микроорганизмы оказались устойчивыми к пенициллину, ампициллину, оксациллину (пенициллины), Escherichia coli-M17 и Enterococcus faecium к эритромицину, пристамицину (макролиды), линкомицину (линкозамиды), колистину (полимексины), а E. faecium проявляет устойчивость к цефуроксиму, цефоперазону, цефазолину (цефалоспорины), Escherichia coli-M17 в ванкомицину (гликопептиды), Lactobacillus acidophilus проявил устойчивость еще и к гентамицину (из группы аминогликозидов), цефотаксиму и цефуроксиму (из группы цефалоспоринов), тетрациклину (тетрациклины )
Наиболее устойчивым является штамм Lactobacillus acidophilus - он дает наименьшие зоны подавление антибиотиками, а Escherichia coli-M17 более чувствителен к антибиотикам, так как для него характерны наибольшие зоны подавления роста. Среди тест-организмов наиболее чувствительным является S. aureus, а устойчивым - S. enteritidis.
Исходя из проведенных предварительных исследований, нами были отобраны те антибиотики, к которым исследуемые микроорганизмы оказались устойчивыми. В частности наибольший интерес для дальнейших исследований представили следующие антибиотики:
- пенициллин, ампициллин, оксациллин (группа пенициллинов);
- цефуроксим, цефоперазон, цефазолин, цефотаксим (группа цефалоспоринов);
- канамицин, гентамицин (группа аминогликозидов);
-эритромицин, пристамицин (группа макролидов);
- линкомицин (группа линкозамидов);
-колистин (группа полимексинов)
Таблица 1. Значения МПК для Escherichia coli-M17
Penicilline мкг. Ampicilline мкг. Vancomycine мкг. Lincomycine мкг. Erytromycine мкг.
14293,356 ±1559,3 200,35±4,069 814±20 15620±30 651±20
Для проведения дальнейших исследований нам необходимо было определить минимально подавляющие концентрации (МПК) изучаемых антибиотиков на рост исследуемых микроорганизмов. Для определения МПК использовали метод последовательных разведений.
Таблица 2. Значения МПК для Enterococcus faecium
Penicilline мкг. Ampicillin мкг. Cefazoline мкг. Cefuroxim мкг. Ceftriaxon мкг. Cefoperazone мкг. Erythromycine мкг. Canamycine мкг.
8281,4±718,6 6510±13 10410±26 4883±976 5208±13 5208±13 203±40 5208±13
Таблица 3. Значения МПК для Lactobacillus acidophilus
Penicilline мкг. Ampicilline мкг. Oxaciline мкг. Cefotaxime мкг. Cefuroxim мкг. Gentamycine мкг. Tetracycline мкг.
8281,4±718,6 6510±1302 5208±1302 5208±1302 4883±976,3 10416,3±2604 5208±1302
Анализ ряда разведений растворов антибиотиков, позволил определить концентрации, которые оказывают бактерицидное и бактериостатическое действие на исследуемые микроорганизмы, а также концентрации, которые не оказывают влияния на рост.
Для определения наличия роста исследуемых микроорганизмов пробирки с посевами просматривают в проходящем свете. Рост культуры в присутствии антибиотика сравнивают с контрольной пробиркой, содержащей исходный инокулюм и хранившейся в холодильнике. МПК определяют по наименьшей концентрации антибиотика, которая подавляет видимый рост микроорганизма.
Исходя из данных таблиц следует, что Enterococcus faecium обладает большей устойчивостью, чем Escherichia coli-M17, для которой необходима меньшая концетрация антибиотика для ее подавления.
Для решения второй задачи нами проводились исследования по изучению антибиотикопродуктивности исследуемых микроорганизмов, в ходе которых была выявлена их антагонистическая активность относительно тест-организмов. Наибольшая антагонистическая активность была выявлена по отношению к Escherichia coli (таблица 4).
В первую очередь, мы попытались определить, на какие сутки происходит наибольшая выработка антибиотикоподобных веществ в питательную среду. Для этого мы использовали метод с агаровыми лунками. Исследуемые микроорганизмы выращивали в питательном бульоне в течение 48, 72 и 96 часов (рисунок 1). В дальнейшем опыте использовали фильтрат от
бактерий, по результатам которого выяснили, что наибольшая выработка антибиотикоподобных веществ происходит на вторые сутки у Escherichia coli М-17 и Lactobacillus acidophilus, на третьи сутки культивирования Enterococcus faecium. Это можно объясняснить ростом популяции бактерий и конкуренцией за питательные компоненты среды.
Таблица 4. Сравнительная таблица по антибиотикопродуктивности методом наложения
дисков
Название штамма Bacillus subtillis 534 Bacillus cereus IP 5832 Staphylococcus aureus Escherichia coli Salmonella enteritidis
Escherichia coli M-17 - - 9,0±0,58мм 12,3±0,33мм -
Enterococcus faecium - - 10,3±0,33мм 10,0±0,58мм -
Lactobacillus acidophilus 7,8±0,56 8,0±0,58 8,4±0,58 —
Исходя из анализа данных (таблица 4), полученных в результате эксперимента следует, что наибольшей антагонистической активностью обладает Escherichia coli M-17, а наименьшей - Lactobacillus acidophilus.
Все вышеизложенные данные послужили основой для решения последней задачи, а именно, эффективности совместного использования антибиотиков и пробиотиков.
При необходимости антибактериальной терапии рекомендовано совместное применение с антибиотиками пробиотиков. И в такой ситуации очень важно чтобы штаммы, входящие в состав пробиотика были антибиотикоустойчивые.
Рисунок 1. Антибиотикопродуктивность Escherichia coli M-17 по отношению к Escherichia coli методом наложения дисков из фильтровальной бумаги
Для каждой группы антибиотиков характерна своя мишень действия. Совместное применение с антибиотиком пробиотика может не только предотвратить развитие дисбактериоза, но и усилить эффект подавления патогенной и условно-патогенной микрофлоры, путем выработки пробиотиком антибиотикоподобных веществ, которые оказывают влияние на другую мишень действия. В этом случае можно установить явление синергизма (или аддитивность), когда происходит суммация антагонистического действия антибиотиков и пробиотиков, что имеет большую практическую значимость. Также можно зарегистрировать либо негативный эффект (антагонизм), когда антибиотикоподобные вещества, вырабатываемые бактериями могут блокировать мишени действия антибиотиков, либо отсутствие какого-либо эффекта.
В связи с этим учитывая результаты определения антибитикорезистентности исследуемых микроорганизмов к антибиотикам, нами был проведен опыт по определению
эффективности совместного действия антибиотиков и пробиотиков на условно-патогенные микроорганизмы.
Совместное использование пробиотических препаратов на основе E. coli M-17 с пенициллином и линкомицином, а также Enterococcus faecium с цефуроксимом и пенициллином при подавлении тест-организма Salmonella enteritidis является неэффективным (рисунок 2). А практический интерес представляет сочетанное применение пробиотического препарата «Колибактерина» с линкомицином, ампициллином и пенициллином при подавлении Staphylococcus aureus и Escherichia coli, а также использование препарата «Линекс» с цефоперазоном, ампициллином, пенициллином, эритромицином по отношению к Escherichia coli
А Б
Рисунок 2. Совместное применение антибиотиков и пробиотиков
Определение аддитивного эффекта взаимодействия Enterococcus faecium с цефуроксимом (А) и пенициллином (Б) при подавлении тест-организма Salmonella enteritidis
Выводы. Все исследуемые микроорганизмы оказались устойчивыми к пенициллину, ампициллину, оксациллину (пенициллины), Escherichia coli-M17 и Enterococcus faecium к эритромицину, ристамицину (макролиды), линкомицину (линкозамиды), колистину (полимексины), а E. faecium проявляет устойчивость к цефуроксиму, цефоперазону, цефазолину (цефалоспорины), E. coli-M17 в ванкомицину (гликопептиды), L. acidophilus проявил устойчивость еще и к гентамицину (из группы аминогликозидов), цефотаксиму и цефуроксиму (из группы цефалоспоринов), тетрациклину (тетрациклины )
В результате исследований было установлено, что исследуемые микроорганизмы, входящие в состав пробиотических препаратов (E. coli M-17 и E. faecium) вырабатывают антибиотикоподобные вещества по отношению к S. aureus и E. coli.
Комплексное применение антибиотиков и пробиотиков в одном случае приводит к негативному эффекту (E. faecium+цефтриаксон по отношению к S. aureus), в другом к положительному результату (E. coli M-17+ванкомицин по отношению к E. coli), а в третьем случае нейтрально (E. faecium+канамицин по отношению к B.subtilis 534).
Литература
1. Ефременкова, О.А. Антибиотики: жизнь продолжается / О.А. Ефременкова // Наука и жизнь. - 2006. - №8. - С. 48-56.
2. Никитин, А.В. Антибиотики и макроорганизм / А.В. Никитин // Антибиотики и химиотерапия. - 2000. - № 12. - С. 31-36.
3. Reid, G. Probiotics to Prevent the need for, and augment the use of, antibiotics / G. Reid // Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. - 2006. - Vol.17. - № 5. - pp. 291-295.
4. Сизенцов, А.Н. Эффективность совместного применения пробиотиков и антибиотиков в условиях in vitro / Сизенцов А.Н., Ильясова Р.В. // Вестник ОГУ. - 2011. -№ 12 (131). - С. 355-357.
5. Новик, Г.И. Биологическая активность микроорганизмов-пробиотиков / Г. И. Новик, Г.И. Мелентьев, А.А. Самарцев, Н.И. Астапович, М.А. Каврус, А.Н. Михалюк // Журнал прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - Т 42. - № 2. - С. 187-194.
6. Городецкий, О.И. Антибиотики: жизнь против жизни [Электронный ресурс] - Режим доступа: http:// www.health-ua.com/articles/1156.html
7. Сизенцов, А.Н. Методы определения антибиотикопродуктивности и антибиотикорезистентности. Методические указания к лабораторному практикуму / А.Н. Сизенцов. - Оренбург. - 2009. - 107 с.
Научно исследовательская работа проводится в рамках:
1. Госбюджетная инициативная НИР «Экологические, биотехнологические и медико-ветеринарные аспекты применения пробиотиков» Номер госрегистрации: №01201176501.
2. Госбюджетная инициативная НИР «Изучение механизмов биоаккумуляции тяжелых металлов пробиотическими штаммами микроорганизмов и оценка эффективности их применения при интоксикации тяжелыми металлами, и лечении инфекционных заболеваний в комплексе с антибиотиками и экстрактами лекарственных растений» Номер госрегистрации: № АААА-А16-116110310071-0.
