CC BY
74
УДК: 579.61: 579.264
А.М. Шариков 1, Н.В. Пашенова 2, В.Т. Манчук 1
ИЗУЧЕНИЕ АНТИБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МЕТАБОЛИТОВ ГРИБА INONOTUS OBLIQUUS PILAT В ОТНОШЕНИИ ШТАММА MYCOBACTERIUM SMEGMATIS
1 НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск) 2 Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН (Красноярск)
Поиск новых антибиотиков из метаболитов совершенных грибов и их изучение представляется весьма актуальным. Изучали влияние метаболитов гриба-чаги Inonotus obliquus Pilat, содержащих широкий спектр биологически активных веществ, на штамм. Mycobacterium, smegmatis. Выявлено ингибирующее действие метаболитов на изученный микроорганизм. Максимальная зона подавления, роста исследуемого штамма M. smegmatis составляла 26 мм. Полученные данные еще раз подтверждают, перспективность поиска новых антибиотических веществ среди, метаболитов грибов, традиционно используемых в народной медицине.
Ключевые слова: антибиотическая активность, метаболиты, микобактерии
STUDY OF FUNGAL METABOLITES ANTIBIOTIC ACTIVITY INONOTUS OBLIQUUS PILAT FOR STRAIN MYCOBACTERIUM SMEGMATIS
A.M. Sharikov N.V. Pashenova 2, V.T. Manchouk 1 1 Research Institute of Medical Problems of the North SB RAMS, Krasnoyarsk
2 Institute of Forest named after V.N. Sukachev SB RAMS, Krasnoyarsk
The search for new antibiotics of the metabolites of perfect fungi, and their study is very important. The authors studied, the effect of metabolites of the fungus, shelf fungus Inonotus obliquus Pilat, containing a wide range of biologically active substances, the strain Mucobacterium smegmatis. Inhibitory effect of metabolites on the studied, microorganism, was revealed. The maximum, area of growth inhibition, of the investigated, strains of M. smegmatis was 26 mm. The data obtained, confirm, once again promising to find new antibiotic substances among the metabolites of fungi traditionally used, in folk medicine.
Key words: antibiotic activity, metabolites, mycobacterium
Поиск новых веществ с антимикробной активностью — важное направление преодоления лекарственной устойчивости микроорганизмов [11]. Выделение антибиотиков из метаболитов совершенных грибов представляет значительный интерес [1, 5].
Антимикробная активность препаратов гриба-чаги Inonotus obliquus Pilat упоминается в специальной и популярной литературе, однако антибиотические вещества этого гриба относительно слабо изучены; изоляты же, выделенные в Центральной Сибири, изучены еще меньше [4, 6 — 9]. Известно, что метаболиты гриба I. obliquus Pilat содержат широкий спектр биологически активных веществ с установленной антибактериальной активностью [10].
В настоящее время род Mycobacterium включает в себя более 90 видов бактерий, из которых 1/3 обладает способностью вызывать заболевания человека. При этом в последние десятилетия во всем мире отмечается рост числа заболеваний, вызываемых микобактериями, не относящимися к M. tuberculosis complex, называемых сегодня нетуберкулезными микобактериями (НТМ). Это связано, с одной стороны, с увеличением числа так называемых иммунокомпрометированных лиц, а с другой — с совершенствованием методов диагностики этой патологии [3].
M. smegmatis относится к условно-патогенным микроорганизмам. Как и все представители рода
Mycobacterium, отличается повышенным содержанием липидов; миколовые и другие кислоты, входящие в состав липидов, определяют повышенную устойчивость бактерий к некоторым лекарственным препаратам.
Целью данной работы являлось изучение влияния метаболитов гриба чаги Inonotus obliquus Pilat на штамм Mуcobacterium smegmatis.
МЕТОДИКА
Использовали сибирский изолят гриба I. obliquus Pilat, выделенный в 2004 г. из пораженной данным грибом древесины березы, собранной в окрестностях г. Красноярска. Выделенную культуру гриба хранили на скошенном сусло-агаре (4 “Б) при 4 “С. Тест-объектом являлся музейный штамм M. smegmatis.
Инокуляционный мицелий выращивали в чашках Петри на сусло-агаре (4 “Б), помещая небольшой кусочек мицелия в центр агаровой пластинки. Посевы инкубировали при 24 “С в течение 21 дня, пока большая часть среды не покрывалась колонией гриба.
Приготовленные жидкие среды (разбавленное 1 : 4 водопроводной водой неохмеленное пивное сусло 16 — 17 “Б) разливали по 100 мл в конические колбы (объемом 500 мл), стерилизовали в автоклаве при 121“ (1 атм.) 30 мин. Среды инокулировали агаровыми блоками с мицелием (диаметр 9 мм), вы-
резанными из края грибной колонии стерильным пробочным сверлом. В каждую колбу стерильно помещали 5 агаровых блоков с мицелием. Показатель рН среды до стерилизации — 5,0; после стерилизации — 5,13.
Засеянные колбы инкубировали в термостате при 22 — 24 °С в течение 32 дней. По окончании культивирования выросший мицелий отфильтровывали, собранную культуральную жидкость после замера объема и уровня рН упаривали в фарфоровых чашках в токе теплого воздуха до состояния густого сиропа.
Для проведения теста на антибиотическую активность с исследуемым штаммом содержимое опытной чашки растворяли в 100 мл дистиллированной воды (рН 6,18), получая «исходный» раствор метаболитов гриба. При таком разведении примерно на треть понижалась концентрация веществ в растворе по сравнению с культуральной жидкостью, взятой для упаривания (70 — 80 мл).
Изучение антибиотической активности исследуемых метаболитов осуществляли методом лунок. Неразбавленный исходный раствор, а также в разведении 1 : 10 и 1 : 100 вносили микропипеткой по
0,1 мл в лунки диаметром 10 мм в предварительно засеянные газоном по Кирби — Бауэру тест-штаммом чашки Петри со средой Мюллера — Хинтон. Контролем в опыте служил физиологический раствор.
Все посевы проводили в пятикратной повторности. Засеянные чашки с лунками, заполненными метаболитами и контролями, помещали в термостат не переворачивая и инкубировали при 37 °С в течение девяти суток. Зону подавления роста замеряли после трех суток инкубирования каждые вторые сутки до окончания срока эксперимента.
При статистической обработке рассчитывали среднее значение и среднеквадратичное отклонение; рассчитывали квантили (процентили) Р25 и Р75 распределения хи-квадрат. Достоверность полученных отличий определяли, используя критерий Стьюдента и непараметрический критерий Манна — Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Проведенные исследования показали, что урожай биомассы использованной культуры
I. obliquus на 32-е сутки инкубирования составил по абсолютному сухому весу 5,03 ± 1,11 г/л. Рост гриба сопровождался изменением рН: от 5,13 в исходной среде до 6,67 в культуральной жидкости.
Было обнаружено, что метаболиты гриба I. obliquus диффундировали в агар, в результате чего образовывались вокруг лунок, где развитие М. smegmatis отсутствовало. Максимальная зона подавления роста исследуемого штамма М. smeg-matis составляла 26 мм, тогда как в контроле эта зона отсутствовала.
При этом зона подавления роста не отличалась значимым образом при увеличении длительности инкубирования штамма М. smegmatis: результат, полученный как на седьмые, так и на девятые сутки является достоверно неразличимым.
Разбавление исходного раствора метаболитов
I. оbliquus в 10 и 100 раз не оказывало значительного влияния на его ингибирующую активность. Однако, слабая тенденция уменьшения зоны подавления роста при увеличении разбавления. В вариантах «исходный раствор» и «разбавление в 100 раз» средние показатели достоверно отличались при (р > 0,05).
Таким образом, полученные данные показали, что при росте на разбавленном сусле мицелий гриба I. оbliquus способен продуцировать метаболиты, оказывающие ингибирующее действие на рост М. smegmatis.
Аналогичные данные были получены нами при изучении действия метаболитов I. оbliquus на штамм F. tularensis линии 15 НИИЭГ. При этом, как и в случае с микобактериями, разбавление культуральной жидкости в 10, 100 и 1000 раз не оказывало большого влияния на величину зон подавления роста микроорганизма; при этом диаметр зоны варьировал незначительно и составлял в среднем 30 мм [9]. Это позволяет предположить, что антибиотики, выделяемые I. оbliquus, обладают сильным действием на клеточную стенку бактерий.
Состав метаболитов, продуцируемых мицелием чаги в искусственных условия роста, пока не расшифрован, хотя в работах, посвященных культивированию мицелия базидиальных грибов, доказано, что биохимический состав биомассы и собранных в природе плодовых тел грибов в достаточной мере совпадают [2].
Таблица 1
Зона отсутствия роста штамма M. smegmаtis вокруг лунок, содержащих растворы культуральной жидкости гриба I. obliquus, мм
Разведения культуральной жидкости Длительность инкубирования штамма М. smegmatis, сутки (Ме (Р25; Р75))
7-е 9-е
нативная 23,0 ± 1,7 23,3 ± 1,5
1:10 22,7 ± 1,5 23,3 ± 1,5
1:100 20,0 ± 0,1 20,3 ± 0,3
Примечание: достоверных статистически значимых отличий между показателями на 7-е и 9-е сутки не обнаружено ф > 0,05).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные исследования показали, что вещества, продуцируемые мицелием гриба I. obliquusпри росте на разбавленном пивном сусле, способны оказывать ингибирующее действие на рост M. smegmatis.
Учитывая вариабельность физиологических и биохимических характеристик грибов и бактерий очевидно, что подобные исследования необходимо повторить с использованием большего количества штаммов как продуцента, так и патогена. Немаловажной стороной работ в этом направлении является разделение, изучение, идентификация и тестирование отдельных метаболитов чаги, полученных в условиях искусственного культивирования мицелия. Тем не менее, полученные данные еще раз подтверждают перспективность поиска новых антибиотических веществ среди метаболитов грибов, традиционно используемых в народной медицине.
ЛИТЕРАТУРА
1. Белова Н.В. Природа биологической активности высших грибов. Успехи медицинской микологии: матер. I Всерос. конгр. по мед. микологии / под ред. Ю.В. Сергеева. — М. : Изд. Национ. акад. микологии, 2003. — Т. 1. — С. 230 — 233.
2. Бухало А.С. Высшие съедобные базидиоми-цеты в чистой культуре. — Киев : Наукова Думка, 1988. - 144 с.
3. Краснова М.А. и др. Применение молекулярногенетических методов для определения вида микобактерий комплекса mais и M. tuberculosis complex // Проблемы туберкулеза. — 2007. — № 11. — С. 29 — 32.
4. Саакян К.Р., Ващенко К.Ф., Дармограй Р.Э. Чага (черный березовый гриб) FUNGUS BETULI-NUS. Аналитический обзор // Интернет-журнал «Провизор». — www.provisor.com.ua/archive/2004/ N16/art 16.htm
5. Чхенкели В.А., Шкиль Н.А. Противотуберкулезная активность базидиомицета CORIOLUS PUBESCENS (SHUM.: FR.) QUEL. и препарата, получаемого на его основе // Сиб. мед. журн. — 2005. — № 1. — С. 67 — 71.
6. Шариков А.М. Изучение антибактериальной активности in vitro метаболитов некоторых высших грибов Средней Сибири // Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири: матер. конф. 24 — 25 июня 2008 года. — Кызыл, 2008. — Вып. 7— С. 152 — 154.
7. Шариков А.М. К вопросу об антибиотической активности грибов-макромицетов //«Проблемы гармонии и закономерности в развитии современного мира: научн. и практические аспекты : сб. трудов Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, 26 марта 2009 г. / науч. ред. Ю.Л. Александров; Краснояр. гос. торг.-экон. ин-т. — Красноярск, 2009. — С. 387 — 388.
8. Шариков А.М., Пашенова Н.В. Антибиотическая активность метаболитов гриба Inonotus obliquus Pilat // Вопросы сохранения и развития здоровья населения республики Хакасия : матер. конф., 3 — 4 июня 2009 г. — Абакан, 2009. — Вып. 8. — С. 294 — 295.
9. Шариков А.М., Пашенова Н.В., Новицкий И.А. Выраженность бактерицидной активности гриба INONOTUS OBLIQUUS PILAT в отношении FRANCISELLA TULARENSIS линии 15 НИИЭГ // Сиб. мед. обозрение. — 2008. — № 1 (49). — С. 19—21.
10. Шиврина А.Н. Химическая характеристика действующих начал чаги. Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. — М. — Л. : Наука, 1966. — С. 49 — 57.
11. Яковлев В.П., Яковлев С.В. Перспективы создания и внедрения новых антимикробных препаратов // Инфекц. и антимикроб. химиотерапия. — 2002. — № 4 (2). — С. 1—5.
Сведения об авторах
Шариков Андрей Михайлович - научный сотрудник лаборатории клеточно-молекулярной физиологии и патологии НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН (660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 3, корпус «Г»; тел.: (391) 22806-83; e-mail: loengrinionessi@bk.ru)
Пашенова Наталья Вениаминовна - старший научный сотрудник, кандидат биологических наук, доцент, отдел физикохимической биологии и биотехнологии древесных растений, Учреждение РАН Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН (660036, г. Красноярск, Академгородок, д. 50, стр. 28; тел. сл.: (391) 249-44-66; факс: (391) 243-36-86; e-mail: pasnat@ksc.krasn.ru) МанчукВалерий Тимофеевич - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, директор НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН
