CC BY
160
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© ШАРИКОВ А.М., ПАШЕНОВА Н.В., НОВИЦКИЙ И. А.
ВЫРАЖЕНННОСТЬ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ ГРИБА INONOTUS OBLIQUUS PILAT В ОТНОШЕНИИ FRANCISELLA TULARENSIS ЛИНИИ 15 НИИЭГ
А.М. Шариков, Н.В. Пашенова, И. А. Новицкий
Институт медицинских проблем Севера СО РАМН, г. Красноярск, дир. - член-корр. РАМН В. Т. Манчук;
Институт леса СО РАН*, г. Красноярск, дир. - д.б.н. А.А. Онучин.
Резюме. Поиск новых антибиотиков из метаболитов высших грибов остаётся актуальным и перспективным. Показано бактерицидное действие метаболитов гриба-чаги Inonotus obliquus Pilat на вакцинный штамм F. tularensis линии 15 НИИЭГ.
Ключевые слова: туляремия, высшие грибы, культивирование, метаболиты, грамнегативные бактерии, метод лунок, бактерицидное действие.
Francisella tularensis, один из самых патогенных микроорганизмов, вызывает зоонозное заболевание - туляремию, распространённое в Северном полушарии и сохраняющееся во внешней среде, в том числе и в виде хронически протекающей эпизоотии. Наибольшей патогенностью отличается F. tularensis subsp. tularensis; последняя встречается в Северной Америке. Считается, что для аэрогенного заражения человека этим типом франсиселл достаточно десяти клеток [3].
Бактерии F. tularensis вызывают системное заболевание млекопитающих; относятся к внутриклеточным патогенам, для которых выживаемость в фагоцитах является одной из ключевых характеристик. Процессы внутриклеточного паразитирования возбудителя туляремии остаются невыясненными [10].
Широкое распространение природных очагов туляремии в нашей стране требует совершенствования средств профилактики, диагностики и лечения
данного заболевания. Особое значение последнее приобретает после описания некультивируемых форм F. tularensis, способных длительно персистировать в макроорганизме [14,7,15]. Установлен факт перехода возбудителя туляремии в авирулентную форму, сопровождаемый множественной антигенной
изменчивостью [9]. Один из подвидов - F. tularensis subsp. novicida -отличается от других трёх известных подвидов антигенной структурой липополисахаридов и не вызывает типичную туляремийную инфекцию [4,5,13].
Одним из направлений преодоления лекарственной устойчивости
микроорганизмов является поиск новых веществ с антимикробной активностью. Актуальность этой проблемы подтверждается тем, что несмотря на большое количество антимикробных препаратов, номенклатура которых насчитывает более двухсот наименований, их число постоянно увеличивается. Каждый год появляется один-два новых препарата, и многие из них пополняют арсенал антимикробных лекарственных средств [12].
В последнее время весьма актуальным представляется своеобразный «возврат к истокам» - поиск и выделение мощных антибиотиков из метаболитов некоторых высших грибов. Антибиотическая активность
макромицетов (высших грибов) была показана в 70-е годы прошлого века; она обычно обусловлена присутствием низкомолекулярных соединений с различными типами структур. Несмотря на то, что, по имеющимся данным, антимикробная активность данных веществ уступает антибиотикам, продуцируемым микромицетами, исследования в этой области продолжаются [1]. Большой интерес в данном отношении представляет изучение съедобных и лекарственных видов высших грибов.
Антибиотические вещества широкоизвестного в официальной и народной медицине гриба Inonotus obliquus РПа1 мало изучены, хотя упоминание об антимикробной активности препаратов чаги можно встретить в специальной и популярной литературе [8,6].
В связи с этим целью данной работы являлось изучение антибиотической активности уже полученных метаболитов гриба I. obliquus РПа! на штамм
F. tularensis линии 15 НИИЭГ методом лунок.
Материалы и методы
В работе использовали сибирский изолят гриба I. obliquus, выделенный в 2004г. из поражённой данным грибом древесины берёзы, собранной в окрестностях г. Красноярска. Выделенную культуру хранили при 4°С на скошенном сусло-агаре; пересев на свежую среду производили один раз в год.
Грибной мицелий выращивали на жидкой среде в стационарных условиях. В качестве среды использовали неохмелённое пивное сусло (4 Б). Культивирование проводили в конических колбах объёмом 500 мл, содержащих по 100 мл стерильной среды. Показатели рН в среде перед стерилизацией находились на уровне 5,47, после стерилизации - 5,13.
Посевной материал чаги выращивали в чашках Петри на сусло-агаре (4°Б). При засеве чашек Петри небольшой кусочек мицелия помещали в центр агаровой пластинки. Посевы инкубировали при 24°С в течение 21 суток, пока большая часть агара не покрывалась колонией гриба. Для засева жидких сред использовали агаровые блоки с мицелием (диаметр - 9мм), вырезанные из края грибной колонии пробочным сверлом. В каждую колбу помещали по пять агаровых блоков с мицелием гриба.
Засеянные колбы инкубировали в термостате при 22-24°С в течение 32 дней. Одновременно в термостат были помещены колбы со стерильной средой (контроль). Культивирование проводили в трёх повторностях.
По окончании культивирования выросший мицелий отфильтровывали, биомассу высушивали до постоянного веса при 105°С. Собранную культуральную жидкость после измерения объема и уровня рН упаривали в фарфоровых чашках в токе теплого воздуха до состояния густого сиропа. В каждой чашке содержалась порция культуральной жидкости, полученная из отдельной колбы. Упаренная культуральная жидкость хранилась в фарфоровых чашках, закрытых пленкой «Парафилм» и фольгой при 8° С в течение месяца.
Для проведения теста на антибиотическую активность были взяты по одной фарфоровой чашке, содержащие каждая соответственно упаренную среду
(сусло) и культуральную жидкость (сусло+чага). Содержимое чашки растворяли в дистиллированной воде (рН 6,18), доводя конечный объём раствора до 100 мл. Полученные растворы сусла (контроль 1) и культуральной жидкости гриба I. obliquus (опыт) разводили стерильно в пробирках в 10, 100 и 1000 раз.
Вакцинный штамм F. tularensis линии 15 НИИЭГ засевали на БТ-агар производства ФГУП «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», инкубировали в течение трёх суток в термостате при 37 °С. Полученные изолированные типичные колонии отбирали петлёй и суспендировали в пробирках со стерильным физиологическим раствором по стандарту мутности 0,5 Мак-Фарланда (1,5х10 КОЕ/мл). Полученную суспензию засевали отжатым ватным тампоном в трёх направлениях на пластины подсушенного БТ-агара, разлитого толстым слоем. После подсушивания посевов в чашках стерильным пробочным сверлом делали лунки.
В лунки БТ-агара с посевом F. tularensis линии 15 НИИЭГ вносили микропипеткой со сменными стерильными носиками по 0,1 мл культуральной жидкости: концентрированную, в разведении 1:10, 1:100 и 1:1000. Кроме того, в отдельные лунки вносили по 0,1 мл дистиллированной воды (контроль 2), использованной для разведения упаренных растворов сусла и культуральной жидкости.
Все посевы проводили в пятикратной повторности. Засеянные чашки с лунками, заполненными культуральной жидкостью, суслом или водой помещали в термостат, не переворачивая, и инкубировали при 37 °С в течение 12 суток.
Наблюдения за ростом тест-культур начинали после трёх суток инкубирования и выполняли каждые вторые сутки до окончания срока эксперимента.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ ЗТЛТТБТТСЛ у.6.0; рассчитывались среднее
арифметическое, стандартная ошибка; достоверность различий определяли по критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Как показали выполненные исследования, рост мицелия сибирского изолята гриба І.оЬЩиш на жидком сусле в стационарных условиях не характеризовался высокой интенсивностью. Урожай биомассы на 32 сутки роста достигал 5,03±1,11 г/л (по абсолютно сухому весу). Рост мицелия чаги сопровождался увеличением показателя рН: от 5,13 (исходная среда) до 6,67 (культуральная жидкость). Цвет среды изменялся от коричневато-жёлтого до тёмно-коричневого.
В ходе наблюдений было обнаружено, что заметный рост культуры F.tularensis линии 15 НИИЭГ обнаруживался на третьи сутки инкубирования. Вокруг лунок в агаре, содержащих дистиллированную воду (контроль 2), концентрированные и разбавленные растворы сусла (контроль 1) отсутствовали признаки ингибирования бактериального роста.
Вокруг лунок, содержащих растворы культуральной жидкости чаги различной концентрации, зоны отсутствия роста наблюдались уже на третьи сутки культивирования. Ширина зон варьировала незначительно и в среднем достигала 30 мм. Зоны сохранились в течение всего периода наблюдения - 12 суток.
Рис.1. Зоны отсутствия роста штамма F. tularensis линии 15 НИИЭГ вокруг лунок, содержащих растворы культуральной жидкости гриба I.obliquus: в разведении 1:10 (а); 1:100 (б). 1 - опыт (сусло + чага), 4 - контроль 1 (сусло).
Как можно видеть из данных, приведённых в таблице, разбавление культуральной жидкости не оказывало большого значения на величину стерильных зон вокруг лунок. С увеличением разбавления отмечалась слабая тенденция к снижению диаметра зоны, но статистический анализ не подтвердил достоверных различий между средними значениями в столбцах.
Таблица 1
Величина зон отсутствия роста штамма F. tularensis линии 1S НИИЭГ вокруг лунок, содержащих культуральную жидкость гриба I. obliquus (мм)
Выполненные исследования показали, что при росте гриба I.obliquus на пивном сусле в культуральной жидкости накапливались вещества, оказывающие ингибирующее действие на рост штамма F. tularensis линии 15 НИИЭГ.
Для многих базидиомицетов установлено, что мицелий, выращенный на жидких средах in vitro, в большей или меньшей степени соответствует биохимическому составу плодовых тел грибов [2]. Как известно, препараты чаги, полученные из сырья, собранного в природе, содержат широкий спектр биологически активных веществ [11,8]. Для таких веществ, как фенолы, флавоноиды и щавелевая кислота известна антибактериальная активность. Однако для идентификации компонентов, ингибировавших рост штамма F. tularensis линии 15 НИИЭГ, требуются дополнительные исследования.
Таким образом, полученные результаты дают предпосылки для дальнейших исследований биологической активности метаболитов гриба
I. obliquus в отношении F. tularensis, ряда других условно-патогенных и патогенных микроорганизмов.
MARKED BACTERICIDAL ACTIVITY OF FUNGI INONOTUS OBLIQUUS PILAT REGARDING FRANCISELLA TULARENSIS 15 НИИЭГ
А.М. Sharikov, N.V. Pashenova, I.A. Novitskij Institute of medical problems of the North regions, Krasnoyarsk
The search of new antibiotics from metabolites of the highest fungi is still actual and perspective. The bactericidal activity of the metabolites of fungus-chaga Inonotus obliquus Pilat is proved on the vaccine stain F. tularensis 15 НИИЭГ.
Литература
1. Белова Н.В. Природа биологической активности высших грибов. Успехи медицинской микологии: мат. I Всерос. конгр. по мед. микологии / Под ред. Ю.В. Сергеева. - М.: Национ. акад. микологии, 2003. - Т.1. -С.230-233.
2. Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре.
- Киев: Наукова думка, 1988. - 165 с.
3. Домарадский И.В. Проблемы патогенности франсиселл // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиологии. - 2005. - №1. - С. 106-110.
4. Маслова Н.Н., Павлович Н.В., Сорокин В.М. и др. Характеристика структуры и антигенной активности липополисахаридов у разных видов Francisella // Молекул. генет., микробиол., вирусол. - 1998. - №3. - С. 2629.
5. Мещерякова И.С., Кормилицына М.И., Родионова И.В. и др. Характеристика новых видов патогенных микроорганизмов рода Francisella // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиологии. -1995. - № 5.- С.3-9.
6. Пашенова Н.В., Шариков А.М., Чо Н.-С. и др. Культивирование
мицелия INONOTUS OBLIQUUS PILAT: мат. IV съезда общ.
биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова / Под ред. Р.Г. Василова. -М.: МАКС Пресс, 2006. - 324 с.
7. Романова Л.В., Мишанькин Б.Н., Пичурина Н.Л. и др. Некультивируемые формы Francisella tularensis // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиологии. - 2000. - №2. - С. 11-15.
8. Саакян К.Р., Ващенко К.Ф., Дармограй Р.Є. Чага (чёрный
берёзовый гриб) FUNGUS BETULINUS. Аналитический обзор // Интернет-журнал «Провизор».
www.provisor.com.ua/archive/2004/N16/art_16.htm.
9. Сухарь В.В. Химическая и биологическая характеристика антигенов туляремийного микроба: автореф. дисс. ...канд. мед. наук. - Ростов-на-Дону, 1988. - 24с.
10. Шеенков Н.В., Опочинский Э.Ф., Валышев А.В. и др. Факторы персистенции FRANCISELLA TULARENSIS //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиологии. - 2006. - № 1. - С.63-66.
11. Шиврина А.Н. Химическая характеристика действующих начал чаги. Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. - М.-Л.: «Наука», 1966. - С.49-57.
12. Яковлев В.П., Яковлев С.В. Перспективы создания и внедрения новых антимикробных препаратов // Инфекц. и антимикроб. химиотерапия. - 2002. - № 4(2). - С. 1-5.
13. Ellis J., Oyston P.C.F., Green M. et al. Tularemia // Clin. Microbial. Rev.
- 2002. - Vol.15, №4. - P. 631-646.
14. Mishankin B.N., Romanova L.V., Pichurina N.L. Nonculturable forms of Francisella tularensis and their possible epidemiological significance // Vojenske zdravotnickё listy. Supl. Odborny casopic vojenskych tekam a tekafiM vydavany Vojenskou tekafskou akademii JEP. - 1997. - Roc. 66, № 1. - S. 25.
15. Romanova L.V., Mishankin B.N., Pichurina N.L. Transfer of Francisella tularensis to the nonculturable state: Induction and conditions favourable for reversion // The 3 rd Int. conf. on tularemia. Umea, 2000. - P. 25.
Таблица 1
Величина зон отсутствия роста штамма F. tularensis линии 15 НИИЭГ вокруг лунок, содержащих культуральную жидкость гриба I. obliquus
(мм)
Разведения культуральной жидкости Длительность инкубирования штамма F. tularensis l5 НИИЭГ, сутки
S 12
конц. раствора 33,33 і 5,77 33,33 і 5,77
1:10 3G,GG і G,GG 3G,33 і G,5S
1:100 29,33 і 1,15 29,GG і 2,65
1:1000 27,GG і 2,64 28,67 і 3,51
