CC BY
16
УДК 519.16+591.26:616-003.219 © А.А. Николаев, Р.В. Ветошкин, П.В. Логинов, 2012
А.А. Николаев1, Р.В. Ветошкин2, П.В. Логинов1
ИЗМЕНЕНИЯ ПРОТЕОГЛИКАНОВ СЕМЕННИКОВ КРЫС
В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
СЕРОСОДЕРЖАЩИМ ГАЗОМ
1ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России 2ГБУЗ АО «Городская клиническая больница № 3 им. С.М. Кирова», г. Астрахань
Изучено строение и состав протеогликанов эпидидимисов и семенников крыс, находящихся в условиях хронической интоксикации природным газом Астраханского газоконденсатного месторождения. Хроническая интоксикация серосодержащим газом приводит к дисбалансу формирования электрофоретического профиля протеогликанов и сопровождается увеличением доли кислых фракций. Анализ содержания сульфатов в ткани эпидидимисов и семенников крыс и во фракциях протеогликанов указывает на увеличение их уровня и объясняет увеличение кислых фракций протеогликанов.
Ключевые слова: протеогликаны, сперматогенез, хроническая интоксикация.
A.A. Nikolaev, R.V. Vetoshkin, P.V. Loginov
THE CHANGES OF PROTEOGLYCANS OF TESTIS IN RATS UNDER CONDITIONS OF EXPERIMENTAL CHRONIC INTOXICATION WITH SULFUROUS GAS
The structure and composition of proteoglycans of epididymis and testis in rats were studied under conditions of chronic intoxication with natural gas of the Astrakhanian gas deposit. The chronic intoxication with sulfurous gas leaded to disturbance of proteoglycan electrophoretic profile and was accompanied by the increase in the ratio of acidic fractions. The analysis of sulfate content in the tissue of epididymis and testis in rats showed the increase of sulfate level and explained the increase of acidic fractions of proteoglycans.
Key words: proteoglycans, spermatogenesis, chronic intoxication.
Введение. Протеогликаны (ПГ) - сложные макромолекулы, состоящие из цепей гликозаминог-ликанов (ГАГ), ковалентно связанных с белковым кором. Они являются обязательным компонентом всех животных клеток и участвуют в таких фундаментальных биологических процессах, как диффе-ренцировка, морфогенез, пролиферация [3, 5, 8, 12]. В частности, имеются данные об активной роли протеогликанов в регуляции сперматогенеза [9, 11, 13]
Протеогликаны представляют собой очень гетерогенный класс макромолекул, которые отличаются друг от друга по молекулярному весу, составу, тонкой структуре ГАГ цепей и функциям.
Особенностью этого класса биологических молекул является их строгая органная специфичность и отсутствие видовой специфичности [3, 5]. Это, в частности, делает протеогликаны прекрасным объектом исследования в токсикологических экспериментах, когда выявленные на животных изменения могут смело экстраполироваться на человека.
Исследования воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды в Астраханской области, в первую очередь, связаны с воздействием природного газа Астраханского газоконденсатного месторождения. Представляет особый интерес изучение строения и состава протеогликанов эпидидимисов и семенников крыс, находящихся в условиях хронической интоксикации. Такая постановка вопроса позволит объяснить постоянное увеличение числа случаев идиопатического бесплодия в Астраханском регионе [2].
Цель: изучить уровень протеогликанов в семенниках крыс в условиях хронического воздействия сероводородсодержащего газа.
Материалы и методы. Объектами исследования стали экстракты эпидидимисов и семенников интактных беспородных белых крыс и крыс, подвергавшихся воздействию природного газа Астраханского газоконденсатного месторождения.
В экспериментальной части работы использовались беспородные белые крысы. Все животные соответствовали показателям биологической нормы. Возраст крыс составлял 6-7 месяцев (половозрелые особи). Масса тела крыс - 180-240 г.
Забор семенников и эпидидимисов у крыс проводили под эфирным наркозом (экспериментальные исследования проводились в строгом соответствии с Хельсинской декларацией о гуманном отношении к животным). Контрольная группа состояла из 56 самцов, а опытная - из 162 самцов.
Опытная группа подвергалась воздействию смеси природного газа Астраханского газового месторождения и воздуха в камере Курляндского. Концентрация природного газа определялась по сероводороду как наиболее активному его компоненту [4]. Во время эксперимента в камере создавалось и поддерживалось содержание природного газа в концентрации 100 ± 15 мг/м3 (по сероводороду). Контроль концентрации сероводорода в камере осуществлялся посредством индикаторных трубок фирмы «Auer» каждые 15 мин. Отработанная газо-воздушная смесь выводилась через систему резервуаров с насыщенным раствором гидроксида натрия. Хроническому воздействию природного газа животных из опытных групп подвергали в течение 63 дней по 4 часа ежедневно с 10 до 14 часов на протяжении 4 месяцев в осенне-зимний период.
В камере на время эксперимента поддерживался определенный микроклимат: температура 22-25°С, влажность 64 % (в начале эксперимента) и 72-74 % (в конце). Для поддержания требуемой влажности использовался обезвоживатель - силикагель. Контрольные группы помещались в ту же камеру в аналогичных условиях, но без добавления серосодержащего газа.
Для выделения протеогликанов использовали методику В.И. Рыковой с соавт. [6]. Из гомогенизированной ткани получали фенольный экстракт, водную фазу его подкисляли, отделяли осадок, промывали его спиртом и сушили. Анализ проводили методом электрофореза на ацетат-целлюлезных пластинах при рН 5,0. Окраска осуществлялась 0,1 % альциановым голубым в 1-процентном растворе СН3СООН.
Результаты исследования. На первом этапе анализа сравнивали содержание общего белка в полученных образцах протеогликанов. Показано, что среднее содержание белка в образцах протеогликанов эпидидимисов и семенников крыс контрольной группы составляет 9,5 ± 0,76 мкг/мг ткани. В процессе воздействия природного газа Астраханского газоконденсатного месторождения отмечена тенденция незначительного, но достоверного снижения среднего содержания белка в образцах протеогликанов эпидидимисов и семенников крыс. На ранних сроках (21-30-й день), концентрация белка практически не отличается от нормы: 9,8 ± 0,85 мкг/мг ткани, но уже на 56 день достоверно ниже нормы 7,9 ± 0,9 мкг/мг (Р < 0,005). Позднее, (110-114 день) концентрация белка еще немного снижается 7,4 ± 0,85 мкг/мг ткани. Таким образом, снижение белка в образцах протеогликанов, выделенных из эпидидимисов и семенников крыс, идет наиболее высокими темпами на втором месяце затравки, что согласуется со сроками синтеза протеогликанов в тканях крыс [10, 13].
Далее методом электрофореза на ацетат-целлюлезных пластинах в норме удалось обнаружить сразу несколько фракций протеогликанов эпидидимисов и семенников крыс (рис. 1).
Рис. 1. Денситограмма электрофореграммы протеогликанов эпидидимисов и семенников крыс (контрольная группа). 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 — номера фракций
В условиях хронической интоксикации отмечается резкое изменение спектра протеогликанов. Уже на ранних сроках (21-30-й день) появляется нехарактерная для нормы фракция 1, обладающая максимальным положительным зарядом (рис. 2).
Позднее (110-114-й день), массив фракций протеогликанов от 3 до 8 фракции сливается в практически единое пятно с едва заметным разделением на 3 крупные зоны. Такое резкое изменение элек-трофоретической картины, вероятно, объясняется увеличением гетерогенности основных фракций протеогликанов.
Рис. 2. Денситограмма электрофореграммы протеогликанов эпидидимисов и семенников крыс (56 день затравки). 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 — номера фракций
Анализ электрофоретической подвижности (табл.) показал, что вопреки ожиданиям увеличения числа отрицательно заряженных фракций не наблюдается.
В норме ближайшая к катоду фракция имеет равный 0,94 ± 0,01, а наиболее отрицательно заряженная фракция протеогликанов эпидидимисов и семенников крыс на 114 день затравки -0,92 ± 0,01. Однако объем катодных фракций даже при визуальной оценке значительно больше. При анализе электрофореграмм методом денситометрии это наблюдение получает количественное подтверждение. Денситометрию проводили после прямого сканирования электрофореграмм на сканере путем конвертации полученного материала в цифровой формат с последующей математической обработкой данных, используя разработанную нами специализированную программу «ПН5108».
На полученной денситограмме проводили базисную линию, исходя из самой низкой точки между зубцами кривой. Приблизительно достраивали Гауссовы кривые и определяли площадь, ограниченную отдельными кривыми. Площадь отдельных пиков электрофореграммы рассчитывали, используя рекомендации Тодорова [7] по формуле:
Б = 1,064 х Ь х а,
где Б - площадь, выражаемая в условных единицах; Ь - высота; а - ширина, измеренная на уровне половины высоты.
Далее площади всех пиков суммировали и принимали за 100 %, а объем каждой фракции оценивали как отношение площади конкретной фракции к сумме площадей всех фракций данной электрофореграммы (табл.). Результаты денситометрии свидетельствуют о том, что в норме распределение массы протеогликанов по фракциям достаточно однородно и, например, масса протеогликанов с электрофоре-тической подвижностью выше 0,5 (фракции 5-9) составляет 58,00 % от общей массы фракций.
Таблица
Относительная электрофоретическая подвижность протеогликанов эпидидимисов
и семенников крыс и фракционное распределение протеогликанов эпидидимисов и семенников крыс, %
Номера Относительная электрофоретическая подвижность Фракционное распределение
фракций (Яг) протеогликанов эпидидимисов протеогликанов
и семенников крыс эпидидимисов и семенников крыс, %
Контроль (п = 12) 114 день затравки (п = 11) Контроль (п = 12) 114 день затравки (п = 11)
1 - 0,02 ± 0,01 - 5,75 ± 2,1
2 0,07 ± 0,01 - 13,3 ± 0,01 -
3 0,14 ± 0,02 0,13 ± 0,02 13,2 ± 0,02 5,8 ± 1,2
4 0,35 ± 0,02 0,18 ± 0,02 15,5 ± 0,02 7,9 ± 1,7
5 0,50 ± 0,02 0,22±0,04 6,8 ± 0,02 7,8 ± 2,4
6 0,61 ± 0,10 0,45 ± 0,15 17,6 ± 0,1 22,7 ± 5,6
7 0,69 ± 0,05 0,625 ± 0,02 8,3 ± 2,5 6,75 ± 1,2
8 0,87 ± 0,02 0,69 ± 0,02 14,9 ± 1,8 8,9 ± 0,5
9 0,94 ± 0,01 0,78 ± 0,02 10,4 ± 2,1 19,1 ± 3,0
10 - 0,92 ± 0,02 - 15,3 ± 2,8
Фракционное распределение протеогликанов эпидидимисов и семенников крыс, подвергшихся воздействию природного газа Астраханского газоконденсатного месторождения, показывает, что основная масса протеогликанов (72,75 %) сосредоточена во фракциях с электрофоретической подвижностью выше 0,5. Таким образом, хроническая интоксикация серосодержащим газом приводит к на-
рушению синтеза протеогликанов эпидидимисов и семенников крыс, проявляющегося в дисбалансе формирования электрофоретического профиля протеогликанов и сопровождающегося увеличением доли кислых фракций. Дополнительным доказательством этого служит определение во фракции протеогликанов эпидидимисов и семенников крыс сульфатов турбидиметрическим методом [1].
Содержание сульфатов в норме составляет 3,6 ± 0,3 мкг/мл. Содержание сульфатов в протеог-ликанах эпидидимисов и семенников крыс, подвергшихся воздействию природного газа Астраханского газоконденсатного месторождения, начинает существенно расти только после второго месяца токсического воздействия, и если на 56-й день составляет 4,8 ± 0,2 мкг/мл, что практически не отличается от нормы (Р > 0,1), то к концу эксперимента их содержание уже 19,1 ± 0,85 мкг/мл.
Заключение. Хроническая интоксикация серосодержащим газом приводит к нарушению синтеза и созревания сперматогенного эпителия, проявляющегося в дисбалансе формирования электро-форетического профиля протеогликанов и сопровождающегося увеличением доли кислых фракций. Эти данные подтверждаются и денситометрическим анализом ПГ эпидидимисов и семенников крыс, по данным которого наблюдается увеличение числа и доли кислых ПГ на фоне резкого изменения всего спектра. Анализ содержания сульфатов в ткани эпидидимисов и семенников крыс и во фракциях ПГ указывает на увеличение их уровня и объясняет увеличение кислых фракций ПГ и ГАГ преобладанием сульфатированных форм.
Все эти нарушения в созревании и синтезе ПГ и ГАГ эпидидимисов и семенников крыс способствуют возникновению дисбаланса в процессе сперматогенеза.
Список литературы
1. Бусев, А. И. Аналитическая химия серы / А. И. Бусев, Л. Н. Симонова. - М. : Наука, 2000. - 342 с.
2. Выборнов, С. В. Биохимические показатели репродуктивного здоровья мужчин, работающих на Астраханском газоперерабатывающем заводе : автореф. дис. ... канд. мед. наук / С. В. Выбор-нов. - М., 2005. - 22 с.
3. Зимина, Н. П. Протеогликаны животных тканей / Н. П. Зимина // Успехи современной биологии. - 2002. - Т. 122, № 4. - С. 571-590.
4. Измеров, Н. Ф. Российская энциклопедия по медицине труда / Н. Ф. Измеров. - М. : Медицина, 2005. - 656 с.
5. Роничевская, Г. М. Роль протеогликанов в регуляции пролиферации клеток / Г. М. Роничев-ская, В. М. Рыкова // Докл. АН СССР. - 2007. - Т. 256, № 2. - С. 481-492.
6. Рыкова, В. И. Выделение протеогликанов из печени крыс / В. И. Рыкова, Г. М. Роничевская, Р. И. Салганик // Известия СО АН СССР. - 1992. - № 2. - С. 144-155.
7. Тодоров, И. Клинические лабораторные исследования в педиатрии / И. Тодоров. - 4-е изд-е (на рус. яз.). - София : Медицина и физкультура, 1963. - 176 с.
8. Шарипова, А. В. Нарушение гликозаминогликанового статуса при некоторых наследственных заболеваниях : автореф. дис. ... д-ра мед. наук / А. В. Шарипова. - М., 2004. - 40 с.
9. Allien, P. M. Testican, a multidomain testicular proteoglycan resembling modulators of cell social behavior / P. M. Allien, J-P. Perin, P. Jolles et al. // Eur. J. Biochem. - 1999. - Vol. 214, № 3. - P. 347-350.
10. Fatma, Ch. F. Sperm quality improvement after date seed oil in vitro supplementation in spontaneous and induced oxidative stress / Ch. F. Fatma, D. Nozha, A. K. Leila // Asian Journal of Andrology. -2009. - № 11. - P. 393-398.
11. Rodriguez-Martinez, H. Evaluation of sperm damage and techniques for sperm clean-up / H. Rodriguez-Martinez, B. Larsson, H. Pertoft // Reprod. Fertil. Dev. - 2007. - Vol. 19. - № 3. - P. 297-308.
12. Sakamoto, H. Relationship between testicular glycosaminoglycan and testicular function : comparison in patients with infertility / H. Sakamoto, Y. Ogawa, H. I. Yoshida // Asian Journal of Andrology. -2006. - Vol. 7. - P. 319-324.
13. Strugnell, R. Characterisation of proteoglycans syntesized by rabbit testis / R. Strugnell, C. Hand-ley, L. Drummond et al. // Am. J. Pathol. - 1986. - Vol. 124. - P. 216-226.
Николаев Александр Аркадьевич, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАЕ, заведующий кафедрой общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, д. 121, тел.: (8512) 39-4140, е-mail: chimnik@mail.ru.
Ветошкин Роман Валерьевич, врач-уролог ГБУЗ АО «Городская клиническая больница № 3 им. С.М. Кирова», г. Астрахань, Россия, 414038, г. Астрахань, ул. Хибинская, д. 2, тел.: (8512) 58-76-64, e-mail: gkb3@mail.ru.
Логинов Павел Вадимович, кандидат биологических наук, профессор РАЕ, доцент кафедры общей и биоорганической химии ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцраз-вития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, д. 121, тел.: (8512) 52-41-43, е-mail: logi-novpv77@mail.ru.
УДК 618.14-002:616-07-08 © Р.В. Павлов, А Р. Пыдра, 2012
Р.В. Павлов1, А.Р. Пыдра2
СОСТОЯНИЕ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПЕРИТОНЕАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ БОЛЬНЫХ НАРУЖНЫМ ГЕНИТАЛЬНЫМ ЭНДОМЕТРИОЗОМ, ОСЛОЖНЕННЫМ СПАЕЧНЫМ ПРОЦЕССОМ МАЛОГО ТАЗА
1ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России 2ГБОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России
С целью изучения роли иммунной системы в процессе формирования спаечного процесса в брюшной полости при наружном эндометриозе проведено иммунологическое исследование перитонеальной жидкости у 63 больных эндометриозом со спаечным процессом малого таза. В качестве группы сравнения выступали 37 больных эндометриозом без спаечного процесса, в качестве контрольной группы - 30 практически здоровых женщин. Установлено, что в процессе спайкообразования при наружном эндометриозе в перитонеальной жидкости прогрессируют иммунные нарушения, характеризующиеся увеличением продукции макрофагами ФНОа, ИЛ6, ИЛ8 и снижением продукции лимфоцитами ИЛ2 и ИФНу.
Ключевые слова: спаечная болезнь, наружный генитальный эндометриоз, иммунитет.
R.V. Pavlov, A.R. Pidra
THE CONDITION OF IMMUNE SYSTEM OF PERITONEAL FLUID IN PATIENTS WITH EXTERNAL GENITAL ENDOMETRIOSIS COMPLICATED BY PELVIC ADHESIONS
To study the role of the immune system in the development of adhesions in the abdominal cavity due to external endometriosis we conducted immunological study of peritoneal fluid in 63 patients with endometriosis accompained by the pelvic adhesive process and in 37 patients with endometriosis without adhesions. It was found out that adhesive process caused by external endometriosis was characterized by immune disorders having the progressing increase in TNF-alpha, IL6 and IL8 production by macrophages and reduced production of IL2 and IFN-gamma by lymphocytes in peritoneal fluid.
Key words: adhesions, external genital endometriosis, immunity.
Введение. Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) является одной из основных причин женского бесплодия, занимая второе место после воспалительных заболеваний придатков матки. Одной из причин бесплодия при НГЭ является спаечно-рубцовый процесс в области малого таза, ведущий в 25,0 % случаев к трубно-перитонеальному бесплодию [1, 2, 6, 7]. Роль иммунной системы в патогенезе НГЭ и спаечной болезни в настоящее время не вызывает сомнения [3, 4, 5], однако данные в отношении динамики иммунологических показателей в процессе формирования спаечного процесса при НГЭ в доступной литературе нами обнаружено не было.
Цель: изучить клеточный состав и особенности цитокинового обмена в перитонеальной жидкости (ПЖ) больных НГЭ, осложненным спаечным процессом малого таза.
Материалы и методы. Иммунологическое исследование ПЖ выполнено у 100 больных НГЭ, диагноз которого был верифицирован на этапе клинико-инструментального обследования, включая лечебно-диагностическую лапароскопию, и окончательно подтвержден гистологически. Все больные НГЭ были сопоставимы по возрасту, жалобам, анамнезу, гинекологической и экстрагенитальной патологии, степени распространения заболевания (II-III степень по классификации Американского общества фертильности r-AFS). В зависимости от наличия сопутствующего спаечного процесса малого таза все больные были разделены на 2 группы:
I основная группа - 63 больных НГЭ со спаечным процессом малого таза;
II группа сравнения - 37 больных НГЭ без спаечного процесса малого таза II-III степени по классификации J. Hulka и Американского общества фертильности (r-AFS);
III контрольная группа - 30 женщин репродуктивного возраста без гинекологической патологии, с двухфазным менструальным циклом, госпитализированных для выполнения хирургической стерилизации.
