CC BY
36
УДК 616.71-007:546.221
A.A. Николаев, Л.А. Гончарова, Д.Л. Луцкий
ИЗМЕНЕНИЯ ПРОТЕОГЛИКАНОВ И ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ СЕРОСОДЕРЖАЩИМ ГАЗОМ
ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Росздрава (Астрахань)
Изучали строение и состав протеогликанов хрящевой ткани плодов, развивающихся в условиях хронической интоксикации. Выявлено, что хроническая интоксикация серосодержащим, газом приводит. к нарушению синтеза и. созревания хрящевой ткани, проявляющееся, в дисбалансе формирования электрофоретического профиля, протеогликанов в ходе эмбриогенеза и. сопровождается его упрощением и увеличением, доли, кислых фракций.
Ключевые слова: углеводно-белковые комплексы, хрящевая ткань, сернистые соединения
CHANGES OF PROTEOGLYCANS AND GLYCOSAMINOGLYCANS IN CARTILAGE TISSUE IN EXPERIMENTAL CHRONIC INTOXICATION BY SULFUR-CONTAINING GAS
A.A. Nikolayev, L.A. Goncharov, D.L. Lutskiy Astrakhan State Medical Academy, Astrakhan
The authors studied, the structure and content of proteoglycans of cartilage tissue of fetuses developing in chronic intoxication. It has been revealed, that chronic intoxication brings to disturbed, synthesis and maturing of cartilage tissue, which is expressed, in disbalance of electrophoretic prophile of proteoglycans during embryogenesis and is accompanied, by its simplification, and. increased part of acid, fraction.
Key words: carbohydrate-albuminous complexes, cartilage tissue, sulphides
Процессы остео- и хондрогенеза находятся в определенной зависимости от углеводного и липидного обмена, в частности от полного и последовательного синтеза углеводно-белковых комплексов — гли-козаминогликанов (ГАГ), протеогликанов (ПГ), коллагена и их взаимодействия между собой. Нарушения в этих процессах ведут к нарушению костеобразования, а следовательно, к формированию врожденных дефектов опорно-двигательного аппарата [1]. Системные врожденные заболевания скелета у детей сопровождаются нарушениями метаболизма углеводсодержащих биополимеров [2].
До недавнего времени функции гликозаминогли-канов сводились к регуляции электрохимического равновесия в живых тканях, а также к универсальной регуляции водного баланса биологических тканей.
В 1990 гг. показано участие протеогликанов и ГАГ в процессах дифференцировки клеток и пролиферативных процессах [3], процессах минерализации и оссификации [1]. Появившиеся в последние десятилетия исследования продемонстрировали способность протеогликанов и ГАГ связывать факторы роста, что является еще одним достоверным механизмом регуляции клеточной дифференцировки и пролиферации [4, 5].
В настоящее время интерес исследователей, занимающихся изучением протеогликанов, переместился на выяснение особенностей строения и состава про-теогликанов и ГАГ конкретных тканей. Особенностью этого класса биологических молекул является их строгая органная специфичность и отсутствие видовой специфичности. Между протеогликаноами хрящевой ткани человека и крысы больше сходства, чем между про-теогликанами хрящевой ткани и кожи человека.
В связи с тем, что роль протеогликанов в регуляции клеточного деления и дифференцировки, а также органная специфичность этого эффекта в настоящее время считаются доказанными, представляет особый интерес изучить строение и состав протеогликанов хрящевой ткани плодов, развивающихся в условиях хронической интоксикации. Такая постановка вопроса позволит установить причинно — следственную связь в увеличении числа врожденных пороков развития опорно-двигательного аппарата в населенных пунктах Астраханской области.
МЕТОДИКА
Выделение протеогликанов мы проводили по методу В.И. Рыковой и соавт. Ткань гомогенизировали, получали фенольный экстракт, водную фазу подкисляли, отделяли осадок, промывали его спиртом и сушили. Анализ протеоглиганов хрящевой ткани проводили методом электрофореза на ацетат-целлюлезных пластинах рН — 5,0. Окраска 0,1% альциановым голубым в 1% СН3СООН.
Для исследования брались плоды крыс из 4-х экспериментальных групп:
1 группа — контроль;
2 группа — затравка во время беременности;
3 группа — затравка до беременности;
4 группа — затравка самцов, подвергавшихся спариванию.
Сроки взятия плодов — 8. 15 и 22 дни беременности. Во всех группах доза природного газа составляла 10 мг/м3.
Затравка проводилась по 4 часа в день на протяжении 30 суток в специальной камере.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Всего удалось обнаружить 5 фракций протеог-ликанов хрящевой ткани плодов крысы.
Отчетливо прослеживается тенденция усложнения структуры протеогликанов в ходе эмбриогенеза. В норме на ранних сроках (8 дней) отмечается мощная фракция 2 и едва заметна фракция 4. Далее идет нарастание общего количества протеогликанов и увеличение их качественного состава до 5 фракций в конце беременности. В условиях хронической интоксикации отмечается резкое изменение спектра протеогликанов. На ранних сроках появляется нехарактерная для нормы фракция 1, обладающая максимальным положительным зарядом. Позднее основная масса протеогликанов располагается в области отрицательно заряженных фракций. Затравка самок до беременности ведет также к дисбалансу протеогликанов в хрящевой ткани плодов. Заметнее всего эти изменения на ранней стадии. где выявляется нестандартная широкая фракция с более высоким положительным зарядом, чем у 1 фракции. Общее количество протеогликанов в 3-й экспериментальной группе визуально больше нормы. Затравка самцов, спаривавшихся с самками 4-й группы также сказывается на электрофоретическом профиле протеогликанов, хотя эти изменения и менее резкие, чем в других группах.
Наиболее характерным изменением электрофоретического спектра протеогликанов хрящевой ткани крыс на внутриутробной стадии развития в условиях воздействия природным газом АГКМ является увеличение общего количества протеогликанов, снижение разнообразия фракций и более раннее появление фракции 1 с наибольшим положительным зарядом.
В последние десятилетия было высказано предположение о наличии комплекса «ПГ-РНК».
Проведенные нами исследования не только подтверждают существование данного соединения, но и демонстрируют существенную разницу в длине молекулы РНК костно-хрящевой ткани плодов экспериментальных и контрольных групп (15 и 22 нуклеотида соответственно).
Анализ гликозаминогликанов как углеводных компонентов протеогликанов представляет наибольший интерес. Выделение гликозаминоглика-нов (ГАГ) проводили из хрящевой ткани плодов крыс. Методика выделения основана на щелочной экстракции гликозаминогликанов G,3 — G,5 М гидрооксидом натрия, дальнейшей депротеинизации и ферментации трипсином. После разрушения белкового компонента ГАГ выделены двухкратным переосаждением спиртом.
Полученный белый порошок ГАГ использовали для качественного и количественного анализа. ГАГ растворяли в G,G2 М трис-солянокислом буфере рН 7,5 и наносили на колонку Тойоперл HW-4G. Фракции собирали и денситометрировали при 2G6 мм.
На рис. 1 представлен спектр глюкозаминог-ликанов хрящевой ткани плодов крыс в ходе эмбриогенеза. Прослеживается тенденция усложнения качественного состава ГАГ с увеличением воз-
раста плода и увеличение доли низкомолекулярных компонентов ГАГ (фракции 3-4-5).
С биохимической точки зрения можно утверждать, что биосинтез ГАГ и коллагеновых волокон
— ключевые процессы в стадии образования волокнистых структур. К настоящему времени доказано, что хондробласты синтезируют ГАГ, выделяемые затем в основное вещество. Упоминалось, что основными компонентами ГАГ хрящевой ткани являются хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-суль-фат, керотансульфат и гиалуроновая кислота. Однако хроматографическое разделение ГАГ хрящевой ткани эмбрионов крысы идет не по видовому признаку, а по молекулярной массе. Поэтому в первой трети внутриутробного развития мы видим практически единый асимметричный пик, соответствующий молекулярной массе более 4000,0 кЛ. С увеличением возраста растет не только суммарное количество ГАГ в ткани, но и их качественное разнообразие. По нашим данным увеличивается доля низкомолекулярных фракций. У новорожденных крыс варианты молекулярной массы ГАГ колеблются от нескольких миллионов до 150 тысяч дальтон.
Изменение хроматографического профиля отражает нарастающий процесс деполимеризации ГАГ, являющийся необходимым звеном в процессе деполимеризации хряща.
Важнейший показатель этого процесса — накопление кислых сульфатированных ГАГ мы контролировали с помощью высокоэффективной анионообменной хроматографии.
При сравнении ГАГ, выделенных из хрящей крысиных эмбрионов 8 дней внутриутробного развития и ГАГ, выделенных из хряща новорожденных крыс, наблюдается резкое увеличение фрагментов с высоким отрицательным зарядом.
Фракционный состав ГАГ хрящевой ткани 8-дневных эмбрионов из опытной группы практически не отличался от контрольной группы (рис. 2). Однако у новорожденных крысят, матери которых получали затравку природным газом на протяжении всей беременности, спектр ГАГ хрящевой ткани существенно меняется. Всего насчитывается 17 фракций, причем основное количество ГАГ выходит после 0, 15 М хлорида натрия. Четыре фракции ГАГ хрящевой ткани, составляющие более 65 % их общей массы, располагаются в зоне от 0,2 до 0,3 М хлорида натрия. Видно, что спектр ГАГ хрящевой ткани новорожденных крысят опытной группы содержит фракции с преимущественно отрицательными зарядами, значительно большим, чем в норме. Так в нормальной хрящевой ткани новорожденных отсутствует группа фракций, выходящих с колонки в зоне от 0,2 до 0,3 М хлорида натрия, а отмечается единичная фракция при 0,27 М составляющая не более 15 % от общего количества ГАГ. В нормальной хрящевой ткани отмечаются незначительные фракции в зоне 0,4 и 0,48 хлорида натрия, которые в опытной группе резко возрастают в общей доле ГАГ хрящевой ткани.
Все эти данные свидетельствуют о том, что хроническая интоксикация природным газом АГКМ
334
Экcпepиraeнтaльныe иccлeдoвaния в мєднцннє н ánoaonin
1 2 :'|*(:Т|»«ыдиЯ
■a tb й ss ís п ъь м& № на i¿i ш нп
15 23 3S 4Í М 05 ТЯ Й 95 1« П5 IÎ3 131 ^
Рис. 1. Хроматография гликозаминогликанов хрящевой ткани эмбрионов крыс (контрольная группа). Колонка 75,0 х 1,5 см, Тойоперл НВД-40; а - 9 дней в/у развития, б - 18 дней в/у развития, в - новорожденные.
0
1S Ît JS 45. SS « íí в as IB Hi щ lis цп
1 2 3 4 £6
Рис. 2. Хроматография гликозаминогликанов хрящевой ткани эмбрионов крыс, получавших хроническую интоксикацию природным газом. Колонка 75,0 х 1,5 см, Тойоперл НВД-40; а - 9 дней в/у развития, б - 18 дней в/у развития, в - новорожденные.
способствует ускорению темпов деполимеризации ГАГ хрящевой ткани с увеличением доли отрицательно заряженных фракций (вероятно, растет доля сульфатированных ГАГ), что в свою очередь нарушает процесс остеогенеза, создавая очаги преждевременной оссификации.
Хрящевая ткань плодов крыс, получивших хроническую интоксикацию, отличается от нормальной по количеству и спектру сульфатов. Во-первых, резко увеличивается темп прироста сульфатов в хрящевой ткани. Если в норме прирост составляет около 280 %, то у крыс. подвергнутых хронической интоксикации — 560 %. Во-вторых. доля сульфатов. приходящихся на средне- и низкомолекулярные фракции (111 и далее), составляет 70 % (13,4 мкг/мл из 19,1 мкг).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, хроническая интоксикация серосодержащим газом приводит к нарушению синтеза и созревания хрящевой ткани, проявляющееся в дисбалансе формирования электрофоретического профиля протеогликанов в ходе эмбриогенеза и сопровождается его упрощением и увеличением доли кислых фракций. Эти данные подтверждаются и хроматографическим анализом ГАГ хрящевой ткани, по данным которого наблюдается увеличение числа и доли кислых ГАГ на фоне резкого изменения всего спектра. Анализ
содержания сульфатов в хрящевой ткани и во фракциях ПГ указывает на увеличение их уровня и объясняет увеличение кислых фракций ПГ и ГАГ преобладанием сульфатированных форм.
Все эти нарушения в созревании и синтезе ПГ и ГАГ хрящевой ткани, по нашему мнению, способствуют возникновению дисбаланса в процессе минерализации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Асфандияров Р.И. Гликозаминогликаны на ранних стадиях онтогенеза длинных трубчатых костей человека / Р.И. Асфандияров, А.Е. Лазько // Арх. анат. гистол. и эмбриол. — 1989. — № 1. — С. 85-89.
2. Балаба Т.Я. Обмен коллагена при несовершенном остеогенезе / Т.Я. Балаба, Л.Н. Фурцева, Н.Н. Нефедьева // Вопр. мед. химии. — 1974. — Т. 20, Вып. 5. — С. 471 —475.
3. Зимина Н.П. Протеогликаны животных тканей / Н.П. Зимина // Усп. соврем. биол. — 1992.
— Т. 112, № 4. — С. 571 —590.
4. Зимницкий А.Н. Возрастная динамика показателей метаболизма гликозаминогликанов у белых крыс / А.Н. Зимницкий // Вопр. биол. мед. и фарм. химии. — 2005. — № 1. — С. 24 — 28.
5. Robinson C. Intercellular function of the some proteoglycans / C. Robinson, M. Viti, M. Hock // J. Cell. Biol. — 1994. — Vol. 108, N 3. — P. 946 — 952.
