CC BY
61
УДК 571.27
В.В. Войткова, В.И. Дубровина, С.А. Витязева, Т.П. Старовойтова, К.М. Корытов, С.В. Балахонов
ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЕНКИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ АРГЕНТОГАЛАКТОМАНАННА И АРГЕНТО-ПОЛИ-1-ВИНИЛ-1,2,4-ТРИАЗОЛА
Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока (Иркутск)
В статье представлены результаты исследования влияния металлосодержащих нанокомпозитов на содержание В- и Т-лимфоцитов селезенки белых мышей. Фенотипический анализ суспензии клеток селезенки проводили методом проточной цитометрии на приборе BD FACSCanto™ II. Показано стимулирующее влияние препаратов на формирование иммунного ответа, что подтверждается увеличением содержания В-лимфоцитов и Т-хелперов и свидетельствует о кооперационных взаимодействиях между клетками иммунной системы. Экспериментально показано, что препараты 2-Н-ПВТ-Ag, ГМ-Ag могут быть рекомендованы для дальнейшего исследования с целью повышения защитных свойств организма. Ключевые слова: селезенка, субпопуляционный состав, нанокомпозит, аргентогалактомананн, аргенто-поли-1-винил-1,2,4-триазол
CHANGE OF THE COMPOSITION OF SPLENIC LYMPHOCYTES AT THE EFFECT OF ARGENTOGALACTOMANANN AND ARGENTO-POLY-1-VINYL-1,2,4-TRIAZOLE
ON THE EXPERIMENTAL ANIMALS
V.V. Voytkova, V.I. Dubrovina, S.A. Vityazeva, T.P. Starovoytova, K.M. Korytov,
S.V. Balakhonov
Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East, Irkutsk
The article presents the results of the research of effect of metal-containing nanocomposites on the content of splenic Band T-lymphocytes of white mice. Phenotypic analysis of the spleen cells suspension was conducted by flow cytometry on BD FACSCanto ™ II. Stimulating effect of these medications on the immune response formation is showed and is proved by the increase of content of B-lymphocytes and T-helper cells and it indicates cooperative interactions between the cells of immune system. It was experimentally showed that the medications 2-N-HTP-Ag, GM-Ag can be recommended for the further research in order to increase protective properties of an organism.
Key words: spleen, subpopulation structure, nanocomposite, argentogalactomanann, argento-poly-1-vinyl-1,2,4-triazole
Число работ, посвященных изучению свойств им-муномодуляторов, растет с каждым годом. Интерес к веществам данной группы обусловлен, прежде всего, тем, что они способны влиять на отдельные звенья иммунного ответа. Такие свойства иммуномодулято-ров играют важное значение при создании вакцин с целью повышения их иммуногенности. Однако не все известные иммуномодуляторы могут быть применены в связи с их токсичностью.
В настоящее время актуальной является разработка новых биологически активных форм синтетических препаратов медицинского назначения в форме наночастиц. Особый интерес представляют такие металлосодержащие полимерные композиты, как аргентогалактомананн (ГМ-Ag) и аргенто-поли-1-винил-1,2,4-триазол (2-Н-ПВТ-Ag), проявляющие иммуномодулирующие и бактерицидные свойства [1, 3, 6].
Известно, что основной функцией иммунной системы является формирование адекватного и эффективного иммунного ответа. При этом важная роль отводится иммунокомпетентным органам, в частности, селезенке. Тем не менее, в литературе отсутствует цитологическая характеристика состояния селезенки экспериментальных животных, инокулированных металлосодержащими полимерными композитами.
Цель исследования: характеристика изменения популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов селезенки у экспериментальных животных под воздействием аргентогалактомананна и аргенто-поли-1-винил-1,2,4-триазола.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали 50 сертифицированных (НПО «Вектор», Новосибирск) беспородных белых мышей, стандартных по условиям содержания и весу (массой 15-20 г).
В качестве объектов исследования использовали два полимерных нанокомпозита: аргентогалактомананн (ГМ-Ag) [5] и аргенто-поли-1-винил-1,2,4-триазол (2-Н-ПВТ-Ag) [6]. Препараты вводили подкожно в правую заднюю лапу в дозе 2 мг/кг в 0,5 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР, рН 7,2). Контролем служили белые мыши, получившие ЗФР в объеме 0,5 мл. Учет результатов проводили на 3-и, 7-е, 14-е и 21-е сутки. Животных выводили из эксперимента в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными Приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 и Приложением к Приказу Минздрава РФ № 267 от 2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».
Суспензию клеток селезенки получали по общепринятой методике [4]. Оценку клеточного состава проводили в панели CD45-APC/CD3-FITC/ CD4-Alexa-700/CD8-APC-Cy7/CD19-PE-Cy7. Для лизи-рования эритроцитов суспензию клеток селезенки центрифугировали при 200 g в течение 5 мин., осадок ресуспендировали в 2 мл рабочего десятикратного буфера BD FACS Lysing Buffer (BD Biosciences, США), аккуратно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 3-4 мин. По истечении времени образцы центрифугировали при 200 g в течение 5 мин. Клетки селезенки подсчитывали в камере Горяева и доводили до концентрации 2 х 107 кл./ мл ЗФР. В полистироловые пробирки BD Falcon™ 12 х 75 мм раскапывали по 50 мкл (106) клеток. Для предотвращения неспецифического связывания иммуноглобулинов с Fcy II/III (CD32/CD16) рецепторами лимфоцитов, которое приводит к появлению высокого фона, до окрашивания специфическими флуоресцентными антителами суспензию клеток селезенки преинкубировали с 2 мкл Mouse BD Fc Block™ в течение 10 мин на льду. Рабочий раствор моноклональных антител готовили в буфере BD Cell WASH (BD Biosciences, США) [2], вносили в исследуемые образцы по 100 мкл, аккуратно перемешивали и инкубировали (в темноте) в течение 30 мин при 4 °С. Затем образцы отмывали в 1 мл холодного BD Cell WASH (BD Biosciences, США) буфере при 200 g в течение 5 мин. Осадок ресуспендировали в 0,5 мл холодного BD Cell WASH (BD Biosciences, США).
Анализ проводили на проточном цитофлуориме-тре BD FACSCanto™ II в программе BD Diva 6.0. В каждой пробе собирали 100 000 CD45+-клеток, которые идентифицировали на графике SSC/CD45. В результате иммунофенотипического анализа спленоцитов определяли процентное содержание В-лимфоцитов (CD3"CD19+), Т-лимфоцитов (CD3+CD19), Т-хелперов (CD3+CD4+), цитотоксических Т-лимфоцитов (cD3+CD8+), незрелых CD3+CD4+CD8+- и CD3+CD4CD8-клеток.
Статистическую обработку данных проводили при помощи стандартного пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoft, Inc.; 19842001, ИПЧИ 31415926535897) с использованием непараметрических тестов U-критерия Манна - Уитни и Спирмена (rs). Для каждой выборки вычисляли М - среднее арифметическое и s - среднее квадратичное отклонение. Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В ходе экспериментов установлено, что показатели содержания оцениваемых субпопуляций лимфоцитов у интактных мышей между сроками наблюдения не имело статистической значимости. В связи с этим значения содержания субпопуляций лимфоцитов интактных представлены как усредненные показатели.
При оценке динамики содержания зрелых Т-клеток в селезенке экспериментальных животных под действием ГМ-Ag и 2-H-nBT-Ag на 14-е и 21-е сутки зарегистрировано достоверное снижение содержания CD3+-клеток, по сравнению с контролем (табл. 1). Однако в случае инокуляции мышам ГМ-Ag выявлена тенденция к повышению этого показателя на 3-и и 7-е сутки (р = 0,08). Анализ субпопуляций Т-лимфоцитов у мышей, иммунизированных как ГМ-Ag, так и 2-H-nBT-Ag, показал достоверное снижение цитотоксических Т-лимфоцитов во все сроки наблюдения, по сравнению с интактными животными. В ходе исследований нами установлено повышение содержания Т-хелперов в селезенке на 7-е сутки после введения препаратов в среднем в 1,3 раза, по сравнению с контролем (р < 0,05).
При воздействии 2-H-nB^Ag или ГМ-Ag в селезенке мышей наблюдалось достоверное повышение содержания В-лимфоцитов на 14-е и 21-е сутки наблюдения, по сравнению с контролем (рис. 1). При введении мышам ГМ-Ag выявлено снижение значений на 3-и сутки в среднем в 1,5 раза,
Таблица 1
Показатели содержания субпопуляций Т-лимфоцитов в селезенке мышей, иммунизированных
ГМ-Ag и 2-Н-ПВТ-Ag (M ± s)
Показатель (%) Контроль Препарат Сроки наблюдения, сутки
3-и сутки 7-е сутки 14-е сутки 21-е сутки
CD3+CD19- 65,6 ± 5,5 ГМ-Ag 68,41 ± 0,8 72,8 ± 2,0 41,9 ± 5,5** 52,5 ± 5,0**
2-Н-ПВТ-Ад 63,8 ± 2,8 64,8 ± 1,8 44,4 ± 5,9** 47,9 ± 1,1**
CD3+CD8+ 22,3 ± 1,5 ГМ-Ад 9,2 ± 0,6** 12,7 ± 3,1** 8,7 ± 0,3** 7,6 ± 0,6**
2-Н-ПВТ-Ад 15,1 ± 3,3** 16,4 ± 3,0** 9,1 ± 2,4** 7,2 ± 1,3**
CD3+CD4+ 36,3 ± 3,0 ГМ-Ад 36,5 ± 1,9 48,8 ± 8,0* 35,7 ± 6,8 35,8 ± 3,8
2-Н-ПВТ-Ад 40,8 ± 9,2 41,2 ± 5,2* 31,7 ± 2,4 32,3 ± 0,5
CD3+CD4+CD8+ 0,8 ± 0,2 ГМ-Ад 0,4 ± 0,1* 0,4 ± 0,1* 1,1 ± 0,2** 1,3 ± 0,3**
2-Н-ПВТ-Ад 0,3 ± 0,1* 0,6 ± 0,2 0,8 ± 0,2 1,6 ± 0,3**
CD3+CD4-CD8- 5,4 ± 1,2 ГМ-Ад 10,0 ± 0,3* 3,2 ± 0,6 3,8 ± 1,0* 7,8 ± 0,7*
2-Н-ПВТ-Ад 5,5 ± 1,6 3,3 ± 0,5 2,8 ± 1,0* 7,5 ± 0,8*
Примечание: различия, по сравнению с контролем, статистически значимы при * - р < 0,05; ** - р < 0,03.
60 ГМ-Ag 2-Н-ПВТ-Ад Контроль
40
20
3-и сутки 7-е сутки 14-е сутки
Сроки наблюдения, сут.
21-е сутки
Рис. 1. Оценка процентного содержания В-лимфоцитов в селезенке у мышей после инъекции ГМ-Ад и 2-Н-ПВТ-Ад (М ± s) различия с контролем значимы при * - р < 0,05, ** - р < 0,03.
0
по сравнению с контрольной группой. Следует отметить, что 2-Н-ПВТ^ оказывает наибольшее влияние на данный показатель, по сравнению с ГМ-Ag, на 14-е сутки (р = 0,023), тем не менее, к 21-м суткам значения процентного содержания В-лимфоцитов в селезенке мышей после инъекции нанокомпозитами достоверно не отличались.
Корреляционный анализ показал, что в группе контроля, а также у мышей, получивших экспериментальные препараты, содержание В-лимфоцитов находилось в обратной взаимосвязи от содержания Т-лимфоцитов (г = -0,75; р = 0,001). После инокулирования мышам 2-Н-ПВТ^ или ГМ-отмечалось появление корреляций CD3+CD4+ и CD3+CD8+ с CD3-CD19+-клетками (г = -0,60; р = 0,001 и г. = -0,73; р = 0,0001 соответственно), а также с Т-лимфоцитами (г5 = 0,70 и г = 0,68; р = 0,0001 соответственно). Кроме того, при введении 2-Н-ПВТ-А§ или ГМ-Л§ у мышей зарегистрированы корреляции CD3+CD4+CD8+-клеток с Т- (г = 0,88; р = 0,0001) и В-лимфоцитами (г = -0,67; р = 0,001).
Таким образом, экспериментальные препараты 2-Н-Ag-ПВТ и ГМ-Ag оказывают влияние на иммунную перестройку организма белых мышей. Подтверждением этому являются как ранее полученные данные о способности этих препаратов повышать резистентность организма (предохранять 30-50 % экспериментальных животных от заболевания чумой, сибирской язвой и летального исхода) [1], так и результаты настоящего исследования. Так, 2-Н-Ag-ПВТ и ГМ-Ag активируют в селезенке пролиферацию CD3-CD19+-клеток, что выражалось в увеличении содержания популяции В-клеток на 14-е и 21-е сутки наблюдения. Это подтверждается повышением их содержания в маргинальной зоне [3]. Следует отметить, что увеличение числа Т-хелперов свидетельствует о кооперационных взаимодействиях между клетками иммунной системы, а также о формировании клеточного иммунитета. Достоверных различий между ГМ-Л§ и 2-Н-ПВТ-Ag по их влиянию на субпопуляционный состав селезенки экспериментальных животных не выявлено. Тем не менее, 2-Н-ПВТ-Ag оказывал
наибольшее влияние на содержание В-лимфоцитов на 14-е сутки. Полученные в ходе экспериментов данные свидетельствуют о реализации иммунного ответа организма белых мышей на воздействие экспериментальных препаратов 2-H-nBT-Ag или ГМ-Ag с участием селезенки.
Экспериментально показано, что препараты 2-H-nBT-Ag, ГМ-Ag, могут быть рекомендованы для дальнейшего исследования с целью повышения защитных свойств организма.
ВЫВОДЫ
Установлено, что 2-H-nBT-Ag, ГМ-Ag способствуют увеличению числа Т-хелперов на 7-е сутки наблюдения, что свидетельствует о кооперационных взаимодействиях между клетками иммунной системы, а также о формировании клеточного иммунитета.
Увеличение количества В-клеток в селезенке экспериментальных животных на 14-21-е сутки подтверждает развитие гуморального иммунитета в ответ на введение полимерных нанокомпозитов.
Изменение содержания незрелых популяций Т-лимфоцитов (CD3+CD4+CD8+, CD3+CD4CD8) указывает на их участие в реакциях иммунного ответа.
ЛИТЕРАТУРА REFERENCES
1. Витязева С.А., Старовойтова Т.П., Дубровина В.И. Сравнительная характеристика иммунного ответа макроорганизма при пероральном и парентеральном введении металлосодержащего нанобио-композита // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 2 (84). -С. 114-117.
Vityazeva S.A., Starovoytova T.P., Dubrovina V.I. Comparative analysis of immune response of macroorganism at oral and parenteral administration of metal-containing nanobiocomposite // Bjul. VSNC SO RAMN. - 2012. -N 2 (84). - P. 114-117. (in Russian)
2. Войткова В.В., Дубровина В.И., Колесникова О.Б. и др. Методические рекомендации по выявлению фосфатидилсерина на лимфоцитах крови мышей с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCantoTM II. - Иркутск, 2010. - 16 с.
Voytkova V.V., Dubrovina V.I., Kolesnikova O.B. et al. Guideline on the detection of phosphatidyl serine on lymphocytes of mice with use of flow cytofluorimeter BD FACSCantoTM II. - Irkutsk, 2010. - 16 p. (in Russian)
3. Дубровина В.И., Витязева С.А., Коновалова Ж.А., Старовойтова Т.П. и др. Сравнительная характеристика действия наноструктурированных аргенто-1-винил-1,2,4-триазола, аргентогалакто-маннана и кобальтарабиногалактана на иммунную реакцию организма экспериментальных животных // Нанотехнологии и охрана здоровья. - 2012. -№ 3 (12). - С. 31-37.
Dubrovina V.I., Vityazeva S.A., Konovalova Zh.A., Starovoytova T.P. et al. Comparative analysis of effect of nanostructured argento-1-vinyl-1,2,4-triazole, ar-gentogalactomannan and cobaltarabinogalactan on the immune reaction of on organism of experimental animals // Nanotehnologii i ohrana zdorov'ja. - 2012. - N 3 (12). -P. 31-37. (in Russian)
4. Кондратьева И.А., Ярилин А.А., Егорова С.Г. и др. Практикум по иммунологии: Учебное пособие для студ. высш. учеб. заведений; 2-е изд-е / Под ред. И.А. Кондратьевой, А.А. Ярилина. - М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 272 с.
Kondratjeva I.A., Yarilin A.A., Egorova S.G. et al. Practical course of immunology: Student training manual; 2nd ed. / Ed. by I.A. Kondratjeva, A.A. Yarilina. - Moscow: Akademija, 2004. - 272 p. (in Russian)
5. Лесничая М.В., Александрова Г.П., Феоктистова Л.П., Сапожников А.Н. и др. Серебросодержащие нанокомпозиты на основе галактомананна и карра-гинана: синтез, строение, антимикробные свойства // Известия Академии наук. Серия химическая. -2010. - № 12. - С. 2323-2328.
Lesnichaya M.V., Aleksandrova G.P., Feoktistova L.P., Sapozhnikov A.N. et al. Silver-containing nanocomposite associated with galactomannan and carrageenan: synthesis, structure, antimicrobial properties // Izvestija Akademii nauk. Serija himicheskaja. - 2010. - N 12. -P. 2323-2328. (in Russian)
6. Поздняков А.С. Полифункциональные (со) полимеры 1-винил-1,2,4-триазола и нанокомпозиты на их основе: автореф. дис. ... канд. хим. наук. -Иркутск, 2011. - 22 с.
Pozdnyakov A.S. Polyfunctional (co)polymers of 1-vi-nyl-1,2,4-triazole and nanocomposites associated with them: abstract of dissertation of Candidate of Chemical Sciences. - Irkutsk, 2011. - 22 p. (in Russian)
Сведения об авторах
Войткова Валентина Владимировна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35; e-mail: vvoitkova@mail.ru)
Дубровина Валентина Ивановна - доктор биологических наук, заведующая лабораторией патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока
Корытов Константин Михайлович - младший научный сотрудник лаборатории патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока
Витязева Светлана Александровна - кандидат медицинских наук, научный сотрудник отдела микробиологии чумы Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока
Старовойтова Татьяна Пантелеевна - научный сотрудник лаборатории патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока
Балахонов Сергей Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, директор Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока
Information about the authors
Voytkova Valentina Vladimirovna - Candidate of Biological Sciences, Research Officer of the Laboratory of Pathophysiology of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East (Trilissera str., 78, Irkutsk, 664047; tel.: +7 (3952) 22-01-35; e-mail: vvoitkova@mail.ru)
Dubrovina Valentina Ivanovna - Doctor of Medical Sciences, Head of the Laboratory of Pathophysiology of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
KorytovKonstantin Mikhaylovich - Junior Research Officer of the Laboratory of pathophysiology of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
Vityazeva Svetlana Aleksandrovna - Candidate of Medical Sciences, Research Officer of the Laboratory of Plague Microbiology of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
Starovoytova Tatiana Panteleevna - Research Officer of the Laboratory of Pathophysiology of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
BalakhonovSergey Vladimirovich - Doctor of Medical Sciences, Professor, Director of Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East
