CC BY
18
Влияние антигенных препаратов Bacillus anthracis 34F2 Sterne в сочетании с нанокомпозитами на иммунный ответ экспериментальных животных
В.И. Дубровина (dubrovina-valya@mail.ru), Е.Ю. Марков, Ж.А. Коновалова, О.В. Юрьева, В.Б. Николаев, С.В. Лукьянова, К.Ю. Ястремская
ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Резюме
В работе представлены материалы исследования антигенных препаратов штамма Bacillus anthracis 34F2 Sterne и сочетанное применение препарата S1 с наноструктурированными аргенто-1-винил-1,2,4-триазолом, аргентогалактоманнаном, кобальта-рабиногалактаном. Показана их способность повышать неспецифические факторы иммунитета с участием кислородзависимых и нитроксидзависимых бактерицидных систем фагоцитов. Получены новые данные о возможности применения экстрактов антигенов сибиреязвенного микроба для повышения резистентности организма экспериментальных животных в отношении B. anthracis.
Ключевые слова: сибирская язва, антигены, нанокомпозиты, иммунитет
Influence of Bacillus anthracis 34F2 Sterne Antigen Preparations in Combination with Nanocomposites on the immune Response of Experimental Animals
V.I. Dubrovina (dubrovina-valya@mail.ru), E.Yu. Markov, Zh.A. Konovalova, O.V. Yuryeva, V.B. Nikolaev, S.V. Lukyanova, K.Yu. Yastremskaya
Irkutsk Antiplague Research Institute of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance Abstract
Effect of Bacillus anthracis 34F2 Sterne antigen preparations and combined application S1 preparation with nanostructured argento-1-vinyl-1,2,4-triasole, argento-galactomannan and cobalt-arabinogalactan are described. Its ability with combination of oxygen- and nitroxide-dependent bactericidal systems of phagocytes to raise nonspecific factors of the immunity is demonstrated. New data indicating the possibility of B. anthracis antigen extract applications as the preparations that raise resistance of the experimental animals against B. anthracis infection are obtained. Key words: anthrax, antigen, nanocomposite, immunity
Введение
Известно, что традиционные вакцинные препараты против сибирской язвы имеют ряд недостатков и не всегда способны обеспечить надежный иммунитет к этой инфекции. В настоящее время угроза биотерроризма обострила необходимость создания нового класса вакцин, способных формировать быструю (в течение нескольких минут или часов) защиту от патогена путем активации врожденного иммунитета [1]. Поэтому поиск эффективных средств повышения защитного потенциала иммунных реакций в ответ на внедрение сибиреязвенного микроба является актуальным направлением исследований в вакцинологии.
Существует мнение, что уничтожение и удаление патогенов может происходить и без участия адаптивной иммунной системы - посредством реакций врожденного иммунитета [2, 3]. В качестве основного пускового механизма активации
сигнальных путей врожденного иммунитета рассматривается взаимодействие образраспознаю-щей сети рецепторов макроорганизма, и прежде всего - То11-подобных рецепторов (TLR), с консервативными патоген-ассоциированными молекулярными структурами микроорганизмов. Роль TLR в формировании неспецифической резистентности к сибиреязвенному микробу в последнее время изучается достаточно интенсивно [4 - 6]. Одной из таких патоген-ассоциированных структур сибиреязвенного микроба являются белки S-слоя (ЕА), которые стимулируют увеличение экспрессии типов 2 и 6 TLR в иммунокомпетентных органах - селезенке и тимусе [6]. Белки S-слоя предлагаются в качестве компонента сибиреязвенной химической вакцины, повышающего ее иммуногенность [7 - 9].
Другим перспективным методом формирования быстрого и эффективного иммунного ответа стало применение иммуноактиваторов, направленных
непосредственно на иммунокомпетентные клетки и модулирующих формирование адаптивного иммунитета. К иммуноактиваторам относят природные и синтетические агонисты TLR, цитокины, хемокины, костимулирующие молекулы. Модификаторы функций TLR могут использоваться как адъюванты в конструировании эффективных средств антиинфекционной защиты [1, 10].
В настоящее время активно изучается действие природных полисахаридов и их наноструктуриро-ванных металлокомпозитов на адаптационно-приспособительные механизмы систем, участвующих в реализации защиты макроорганизма от патогена. Показано, что одной из моделей для изучения иммуномодулирующих свойств нанокомпозитов может быть система мононуклеарных фагоцитов, функциональная активность которых играет важную роль в резистентности организма [11 - 13]. Таким образом, разработка иммуногенного комплекса на основе поверхностных антигенов сибиреязвенного микроба с использованием наноком-позитов, способных вызывать иммуномодулирую-щий эффект, позволит получить новые данные для конструирования вакцинных препаратов.
Цель работы - изучить действие антигенных препаратов из штамма Bacillus anthracis 34F2 Sternе и их сочетаний с нанокомпозитами на функциональное состояние фагоцитов лабораторных животных в условиях in vitro.
Материалы и методы
Антигенные препараты получали путем выращивания микробной массы вакцинного штамма B. anthracis 34F2 Sternе (рХО1+рХО2) на агаре Хоттингера (рН 7,2), ее обеззараживания бензил-пенициллина натриевой солью (S1) или мерти-олятом натрия (S2), центрифугирования, фильтрации, лиофильного высушивания по методу И.А. Барковой [14] в нашей модификации. В экспериментальных исследованиях тестируемыми субстанционными образцами служили металло-полимерные нанокомпозиты [15, 16] на основе 1-винил-1,2,4-триазола (2-H-Ag-nBT), арабинога-лактана (Со-АГ), галактоманнана (Ag-ГМ), любезно предоставленные сотрудниками Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского Сибирского отделения РАН.
Диск-электрофорез антигенных препаратов проводили в 12%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия [17]. Анализ полипептидного спектра полученных электрофоре-грамм осуществляли с использованием системы гель-документирования Gel-Doc XR+ и компьютерной программы Image Lab 2.01 (Bio-Rad, США).
Анализ антигенного состава препаратов сибиреязвенного микроба проводили в реакции имму-нодиффузии в 1%-ном агаровом геле с использованием сыворотки против белка С сибиреязвенного микроба (Иркутский научно-исследовательский противочумный институт) [18] и коммерческих
сибиреязвенных лошадиных иммуноглобулинов (48-й ЦНИИ Минобороны России, г. Киров).
Оценку влияния антигенных препаратов на функциональное состояние фагоцитов лабораторных животных проводили in vitro на модели перитоне-альных макрофагов (ПМ) и полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ) 120-ти беспородных белых мышей (18 - 20 г) и 28-ми морских свинок (250 -300 г). Животных получали из питомника Иркутского научно-исследовательского противочумного института и после карантинизации использовали в опытах. В процессе содержания животных поддерживался рекомендуемый режим питания, выведение из эксперимента проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение № 4 к Приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755).
Фагоциты (106/0,2 мл), полученные общепринятым методом, праймировали препаратами S1 и S2 (100 мкг/мл - по содержанию белка) в сочетании с нанокомпозитами (10 мкг/0,2 мл) в течение 30 минут при 37 °С с последующим определением суммарной активности: ферментов дыхательной цепи (НСТ-тест) [19], супероксиддисмутазы (СОД)
[20], миелопероксидазы (МПО) [19], глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и НАДФН-оксидазы
[21], а также продукции NO2 и уровня содержания неферментных катионных белков (НКБ) в нашей модификации [19]. Контролем служили клетки ин-тактных животных.
Анализ полученных результатов осуществляли стандартными статистическими методами с использованием пакета программ (Stat Soft, США) Statistica 6 и Microsoft Excel 2003 и выражали как индекс стимуляции (ИС) в процентах в виде среднего арифметического из выборки (М), при стандартном отклонении (s). Для сравнения средних арифметических использовали U-критерий Манна-Уитни. Результаты считали достоверными, если вероятность ошибки не превышала 0,05 (P < 0,05) [22]. Эксперименты проводили в трех повторах.
Результаты и обсуждение
Выделенные из микробной массы штамма B. anthracis 34F2 Sternе препараты S1 и S2 после лиофилизации сохраняли хорошую растворимость, что необходимо для проведения экспериментов по изучению их иммунобиологических свойств.
В препаратах S1 и S2 содержание белка составляло 40 и 60%, углеводов - 16 и 10%, нуклеиновых кислот - 8 и 5% соответственно. Они различались по полипептидному спектру. Препарат S1 содержал полипептиды с молекулярной массой от 16 до 65 кДа. Полипептиды с большей молекулярной массой, соответствующей массе протектив-ного антигена и белков S-слоя сибиреязвенного микроба (порядка 84 и 92 - 100 кДа), в нем отсутствовали. Напротив, в препарате S2 в отличие от S1 выявлены полипептиды в данном диапазоне
молекулярной массы. Кроме того, наличие в препарате S2 белка С [18], идентичного белку S-слоя сибиреязвенного микроба, было подтверждено серологически в реакции иммунодиффузии с гомологичной кроличьей антисывороткой.
При изучении влияния на функциональное состояние фагоцитов лабораторных животных установлено, что праймирование иммунокомпетент-ных клеток препаратами S1 и S2 в концентрации 100 мкг/мл вызывало активацию кислородза-висимых (активность Г6ФДГ, НАДФН-оксидазы и МПО) бактерицидных систем фагоцитов (рис. 1).
Сравнительный анализ результатов воздействия препаратов S1 и S2 штамма В. ап^гаа'в 34Р2 Sternе на иммунокомпетентные клетки экспериментальных животных показал, что препарат S2 стимулирует функциональное состояние фагоцитов в большей степени, чем препарат S1. Так, показатели индекса стимуляции Г6ФДГ фагоцитами, праймированными препаратом S2, в 2 раза выше по сравнению с S1 (см. рис. 1А), НАДФН-оксидазы - в 2,8 раза (см. рис. 1Б), МПО - в 1,7 раза (см. рис 1В) (Р < 0,05). Суммарную активность кислородзависимого метаболизма фагоцитов (КЗМ), в частности ферментов дыхательной цепи, оценивали в НСТ-тесте, результаты которого подтверждают данные, полученные в ходе определения активности отдельных ферментов этого процесса. Показано, что оба препарата стимулируют КЗМ, тем не менее значения показателей НСТ-теста у макрофагов, стимулированных препаратом S2 В. ап^гас/'в 34Р2 Sternе, в 1,7 раза выше, чем при стимулировании препаратом S1 (Р < 0,05).
Известно, что НКБ относят к активаторам выброса из лейкоцитов антибактериальных факторов и стимуляторам фагоцитоза. Нами получены
данные, свидетельствующие о способности антигенных препаратов S1 и S2 B. anthracis 34F2 Sterna влиять на кислороднезависимые бактерицидные механизмы фагоцитов. Установлено повышение уровня НКБ в ПЯЛ под действием этих препаратов. Так, значение ИС для препарата S1 составляет 9,0 ± 0,5%, для S2 - 46,0 ± 0,9%, что свидетельствует об интенсивности выброса НКБ в межклеточное пространство у ПЯЛ, праймированных S2 (показатели ИС фагоцитов в случае S2 в 5 раз выше (Р < 0,05), чем в случае S1).
Как известно, в макрофагах наряду с активными формами кислорода действует моноокисид азота, усиливающий их антимикробное действие. Следующим этапом наших исследований стало изучение действия препаратов S1 и S2 B. anthracis 34F2 Sternе на формирование активных форм азота макрофагами морской свинки. Сравнительный анализ полученных результатов показал отсутствие достоверных различий между препаратами S1 и S2 по степени активации NO-синтазы в ПМ экспериментальных животных. Содержание метаболитов оксида азота в первой опытной пробе (фагоциты + препарат S1) - 0,94 ± 0,26 мкМ/106 фагоцитов и во второй пробе (фагоциты + препарат S2) -0,90 ± 0,19 мкМ/106 фагоцитов превышает показатели в контрольной пробе; тем не менее, достоверных различий не выявлено.
Установлено, что избыток активных форм кислорода (АФК) - один из главных клеточных ядов, а СОД играет ключевую роль в антиоксидантной защите организма и является катализатором обратной реакции - дисмутации (обратного превращения) АФК в кислород и перекись водорода. При изучении функциональной активности антиоксидантной системы (АОС), в частности СОД, угнетения работы АОС фагоцитов не выявлено.
Рисунок 1.
влияние препаратов штамма B. anthracis 34F2 Sternе на активность ферментов кислородзависимого метаболизма фагоцитов белых мышей в условиях in vitro
Таблица 1.
влияние препарата S1 в сочетании с нанокомпозитами на функциональное состояние фагоцитов
Препарат ИС (%)
Г6ФДГ НАДФН-оксидаза МПО НКБ
S1 11,0 ± 1,3 9,2 ± 3,0 10,4 ± 2,4 15,6 ± 1,8
S1 + Со-АГ 57,7 ± 3,9 36,9 ± 2,1 47,5 ± 4,2 36,6 ± 3,4
S1 + ПВТ-Ag 27,6 ± 2,1 19,6 ± 1,0 14,1 ± 1,4 25,6 ± 2,7
S1 + ГМ-Ag 45,5 ± 4,6 32,7 ± 3,4 36,6 ± 3,1 30,0 ± 2,2
Значения показателей активности этого фермента ПМ при взаимодействии с препаратами S1 и S2 не отличались от контрольных значений (1,26 ±
0.03 нг С0Д/106 фагоцитов), что может свидетельствовать об отсутствии накопления токсических кислородных радикалов в клетках.
Ранее нами было продемонстрировано, что 2-Н^-ПВТ, Ag-ГМ и Со-АГ обладают способностью стимулировать неспецифические факторы резистентности организма экспериментальных животных [23, 24].
Сравнительный анализ действия препарата S1 штамма B. anthracis 34Р2 Sternе и его сочетания с 2-Н^-ПВТ, Ag-ГМ или Со-АГ на иммунокомпетент-ные клетки экспериментальных животных показал, что иммуногенные комплексы, состоящие из препарата S1 и нанокомпозитов (табл. 1), стимулируют кислородзависимые ферментные системы фагоцитов. Показано, что сочетанное применение препарата S1 и 2-Н^-ПВТ, Ag-ГМ или Со-АГ способствует повышению ИС ферментов окислительного взрыва (Г6ФДГ, НАДФН-оксидаза и МПО) по сравнению с препаратом S1 в среднем: Г6ФДГ -в 4 раза; НАДФН-оксидазы и МПО в - 3,3 раза (Р < 0,05). Также установлено повышение индекса стимуляции НКБ у ПЯЛ (в 1,9 раза, при Р < 0,05), стимулированных антигенным препаратом в сочетании с нанокомпозитами, по сравнению с фагоцитами, праймированными препаратом S1.
Выводы
1. На основании результатов оценки действия антигенных препаратов S1 и S2 штамма B. anthracis 34Р2 Sternе установлено их стимулирующее влияние на функционирование основ-
ных ферментных и неферментных антимикробных систем фагоцитов.
2. Выявлен ряд достоверных отличий между S1- и S2-препаратами по степени влияния на метаболическую активность перитонеальных макрофагов и полиморфно-ядерных лейкоцитов, связанных, на наш взгляд, с наличием поверхностных антигенов S-слоя сибиреязвенного микроба в препарате S2.
3. Показатели активации каталитической способности ферментов дыхательной цепи фагоцитов в этом случае достоверно выше, чем под действием препарата S1. Аналогичная тенденция прослеживается в отношении повышения уровня неферментных катионных белков, что указывает на способность препарата S2 стимулировать бактерицидный потенциал фагоцитов в большей степени, чем S1.
4. Показана также способность наноструктуриро-ванных аргенто-1-винил-1,2,4-триазола, арген-тогалактоманнана, кобальтарабиногалактана в сочетании с антигеном S1 штамма B. anthracis 34Р2 Sternе повышать неспецифические факторы иммунитета посредством активации кислородза-висимых и нитроксидзависимых бактерицидных систем фагоцитов, обеспечивая таким образом устойчивость организма к сибирской язве.
Настоящие исследования являются начальным этапом комплексного изучения иммуногенных свойств антигенных препаратов S1 и S2 штамма B. anthracis 34Р2 Sternе. Тем не менее они могут рассматриваться в качестве перспективных кандидатов для конструирования на их основе химических сибиреязвенных вакцин. Ш
Литература
1. Онищенко Г.Г., Пальцев М.А., Зверев В.В., Иванов А.А., Киселев В.И., Нетесов С.В. и др. Биологическая безопасность. Москва: Медицина; 2006.
2. Hallman M., Ramet M., Ezekowitz R.A. Toll-like receptors as sensors of pathogens. Pediatr. res. 2001; 50 (3): 315 - 321.
3. Valiante N., O^Hagan D., Ulmer J. Innate immunity and biodefence vaccines. Cell. Microbiol. 2003; 5 (11): 755 - 760.
4. Triantafilou M., Uddin A., Maher S., Charalambous N., Hamm T.S.C., Alsumati A. et al. Anthrax toxin evades Toll-like receptor recognition whereas its cell wall components trigger activation via TLR 2/6 heterodimers. Cell. Microbiol. 2007; 9 (12): 2880 - 2892.
5. Weiss S., Levy H., Fisher M., Kobiler D., Altboum Z. Involvement of TLR2 in innate immune response to Bacillus anthracis infection. Innate Immun. 2009; 15 (1): 43 - 51.
6. Попова П.Ю. Биологическая характеристика протективного антигена, синтезируемого аспорогенным рекомбинантным штаммом Bacillus anthracis: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Саратов; 2012.
7. Ariel N., Zvi A., Makarova K.S., Chitlaru T., Elhanany E., Velan B. et al. Genome - based bioinformatics selection of chromosomal Bacillus anthracis putative vaccine candidates coupled with proteomic identification of surface - associated antigens. Infect. Immun. 2003; 71 (3): 4563 - 4579.
8. Mignot T., Mesnage S., Couture-Tosi E. Mock M., Fouet A. Developmental switch of S-layer protein synthesis in Bacillus anthracis. Mol. Microbiol. 2002; 43 (6): 1615 - 1627.
9. Uchida M., Harada T., Enkhtuya J., Kusumoto A., Kobayashi Y., Chiba S. et al. Protective effect of Bacillus anthracis surface protein EA1 against anthrax in mice. Biochem Biophys Res Commun. 2012; 421 (2): 323 - 328.
10. Попова П.Ю., Микшис Н.И., Щуковская Т.Н., Попов Ю.А. Взаимодействие возбудителя сибирской язвы с паттернраспознающими рецепторами врожденного и адаптивного иммунитета. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 110: 12 - 17.
11. Зайцева Л.Г., Васильева Г.И. О механизме комбинированного воздействия иммуномодуляторов на фагоцитарные клетки. Журн. микробиол. 1994; 4: 17 - 20.
12. Луканов Н.А., Чахирева Н.Е. Опыт применения отечественного иммуномодулятора полиоксидония в комплексной терапии паразитарных инфекций. Матер. науч. конф. с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций». Санкт-Петербург; 2004: 72 - 74.
13. Дубровина В.И., Медведева С.А., Витязева С.А., Колесникова О.Б., Александрова Г.П., Гуцол Л.О. и др. Структура и иммуномодулирующее действие арабиногалактана лиственницы сибирской и его металлопроизводных. Иркутск: Аспринт; 2007.
14. Баркова И.А. Иммунодиагностическая оценка белков, продуцируемых штаммами Bacillus anthracis с разным профилем плазмид вирулентности: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Волгоград; 2007.
15. Александрова Г.П., Медведева С.А., Грищенко Л.А., Сухов Б.Г., Трофимов Б.А. Способ получения наноразмерных металлических и металлоксидных частиц. Патент № 2260500 РФ; 2005.
16. Поздняков А.С. Полифункциональные (со)полимеры 1-винил-1,2,4-триазола и нанокомпозиты на их основе: Автореф. дис. ... канд. хим. наук. Иркутск; 2011.
17. Герхардт Ф., ред. Методы общей бактериологии. Москва; 1984.
18. Безносов М.В. Выделение и изучение специфических антигенов Bacillus anthracis с целью конструирования диагностических и профилактических препаратов: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов; 1997.
19. Дубровина В.И., Коновалова Ж.А., Колесникова О.Б., Татарников С.А., Витязева С.А., Войткова В.В. и др. Определение функционального состояния фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма. Методические рекомендации. Иркутск; 2008.
20. Матюшин Б.Н., Логинов А.С., Ткачев В.Д. Определение супероксиддисмутазной активности в материале пункционной биопсии печени при ее хроническом поражении. Лаб. дело. 1991; 7: 16 - 19.
21. Голубинский Е.П., Бойкова И.С., Дубровина В.И. Активность бактерицидных систем фагоцитов у интактных и иммунизированных против туляремии морских свинок. Журн. микробиол. 1995; 2: 77 - 79.
22. Закс Л. Статистическое оценивание. Москва: Статистика; 1976.
23. Дубровина В.И., Витязева С.А., Коновалова Ж.А., Старовойтова Т.П., Мухтургин Г.Б., Сухов Б.Г. и др. Сравнительная характеристика действия нано-структурированных аргенто-1-винил-1,2,4-триазола, аргентогалактоманнана и кобальтарабиногалактана на иммунную реакцию экспериментальных животных. Нанотехнологии и охрана здоровья. 2012; 3 (12): 31 - 38.
24. Коновалова Ж.А., Дубровина В.И., Витязева С.А., Лукьянова С.В., Войткова В.В., Александрова Г.П. и др. Влияние наноструктурированных аргенто-1-винил-1,2,4-винилтриазола, кобальтарабиногалактана, аргентогалактоманнана на антимикробные факторы иммунитета. Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора. В 2-х т. Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения. Пермь; Т. 1. 2012: 305 - 308.
References
1. Onishchenko G.G., Pal'tsev M.A., Zverev V.V., Ivanov A.A., Kiselev V.I., Netesov S.V. et al. Biosafety. Moscow: Meditsina; 2006 (in Russian).
2. Hallman M., Ramet M., Ezekowitz R.A. Toll-like receptors as sensors of pathogens. Pediatr. res. 2001; 50 (3): 315 - 321.
3. Valiante N., O'Hagan D., Ulmer J. Innate immunity and biodefence vaccines. Cell. Microbiol. 2003; 5 (11): 755 - 760.
4. Triantafilou M., Uddin A., Maher S., Charalambous N., Hamm T.S.C., Alsumati A. et al. Anthrax toxin evades Toll-like receptor recognition whereas its cell wall components trigger activation via TLR 2/6 heterodimers. Cell. Microbiol. 2007; 9 (12): 2880 - 2892.
5. Weiss S., Levy H., Fisher M., Kobiler D., Altboum Z. Involvement of TLR2 in innate immune response to Bacillus anthracis infection. Innate Immun. 2009; 15 (1): 43 - 51.
6. Popova PYu. Biological characteristic of protective antigen synthesized by asporogenic recombinant Bacillus anthracis strain: Doctorate of med. sci. diss. Saratov; 2012 (in Russian).
7. Ariel N., Zvi A., Makarova K.S., Chitlaru T., Elhanany E., Velan B. et al. Genome-based bioinformatics selection of chromosomal Bacillus anthracis putative vaccine candidates coupled with proteomic identification of surface-associated antigens. Infect. Immun. 2003; 71 (3): 4563 - 4579.
8. Mignot T., Mesnage S., Couture-Tosi E., Mock M., Fouet A. Developmental switch of S-layer protein synthesis in Bacillus anthracis. Mol. Microbiol. 2002; 43 (6): 1615 - 1627.
9. Uchida M., Harada T., Enkhtuya J., Kusumoto A., Kobayashi Y., Chiba S. et al. Protective effect of Bacillus anthracis surface protein EA1 against anthrax in mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2012; 421 (2): 323 - 328.
10. Popova PYu., Mikshis N.I., Shchukovskaya T.N., Popov Yu.A. Interaction between Bacillus anthracis and pattern-recognizing receptors of innate and adaptive immunity. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii. 2011; 4 (110): 12 - 17 (in Russian).
11. Zajtseva L.G., Vasiljeva G.I. To the mechanism of the combined influence of immunomodulators on phagocytic cells. Zhurn. Mikrobiol. 1994; 4: 17 - 20 (in Russian).
12. Lukanov N.A., Chahireva N.E. Experience of domestic immunomodulator polyoxidonium application in complex therapy of parasitic infections. Materials of Sci. Conf. with International Participation «Modern Means of Immunodiagnostics, Immuno- and Emergency Prophylaxis of Urgent Infections». Saint-Peterburg;. 2004: 72 - 74 (in Russian).
13. Dubrovina V.I., Medvedeva S.A., Vityazeva S.A., Kolesnikova O.B., Aleksandrova G.P., Gutsol L.O. et al. Structure and immunomodulating action of the Larix sibirica arabinogalactan and its metal-derivatives. Irkutsk: Asprint; 2007 (in Russian).
14. Barkova I.A. Immunodiagnostic evaluation of proteins produced by Bacillus anthracis strains with different virulence plasmid profile: Doctorate of Med. Sci. Volgograd; 2007 (in Russian).
15. Aleksandrova G.P, Medvedeva S.A., Grishchenko L.A., Sukhov B.G., Trofimov B.A. Method of production of nano-sized metal and metal-oxide particles. Patent № 2260500of Russian Federation; 2005 (in Russian).
16. Pozdnyakov A.S. Polyfunctional (co)polymers of 1-vinyl-1,2,4-triazole and nanocomposites on its basis: Doctorate of chem. sci. Irkutsk; 2011 (in Russian).
17. Gerhard F., ed. Methods of Common Bacteriology. Moscow; 1984 (in Russian).
18. Beznosov M.V. Isolation and studying of specific Bacillus anthracis antigens to construct diagnostic and prophylactic preparations: diss. Doctorate of biol. sci. Saratov; 1997 (in Russian).
19. Dubrovina V.I., Konovalova Z.A., Kolesnikova O.B., Tatarnikov S.A., Vityazeva S.A., Vojtkova V.V. et al. Detection of the functional state of phagocytes as an indication of the body nonspecific defense. Methodical Recommendations. Irkutsk; 2008 (in Russian).
20. Matyushin B.N., Loginov A.S., Tkachev V.D. Determination of superoxide dismutase activity in the liver needle biopsy in chronic lesions. Lab. Delo. 1991; 7: 16 - 19 (in Russian).
21. Golubinsky E.P., Boikova I.S., Dubrovina V.I. Activity of bactericidal phagocyte system in intact and immunized guinea pigs against tularemia. Zhurn. Mikrobiol. 1995; 2: 77 - 79 (in Russian).
22. Zaks L. Statistical evaluation. Moscow: Statistics; 1976 (in Russian).
23. Dubrovina V.I., Vityazeva S.A., Konovalova Zh.A., Starovoitova T.P., Muhturgin G.B., Suhov B.G. et al. The comparative characteristics of nanostructured argento-1-vinyl-1,2,4-triazole, argentogalactomannan and cobaltarabinogalactane action on the immune reaction of experimental animal. Nanotechnologies and Health Protection. 2012; 3 (12): 31 - 38 (in Russian).
24. Konovalova Zh.A., Dubrovina V.I., Vityazeva S.A., Lukyanova S.V., Vojtkova V.V., Aleksandrova G.P. et al. Influence of nanostructured argento-1-vinyl-1,2,4-viniltriazole, cobaltarabinogalactane, argentogalactomannana on anti-microbial factors of immunity. Materials of All-Russian Sci. Conf. of Young Scientists and Specialists of Rospotrebnadzor. Fundamental and Applied Aspects of the Analysis of Public Health Risk. Perm. 2012. 1: 305 - 308 (in Russian).
