CC BY
16
Результаты исследования действия антигенного препарата Bacillus anthracis 34F2 Sternе в сочетании с кобальт-арабиногалактаном на активацию и апоптоз клеток крови in vitro
В.И. Дубровина1 (dubrovina-valya@mail.ru), В.В. Войткова1, С.В. Лукьянова1, О.В. Юрьева1, В.Б. Николаев1, Г.П. Александрова2
1ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
2Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского Сибирского отделения РАН
Резюме
В работе представлены материалы исследования антигенного препарата штамма Bacillus anthracis 34F2 Sterne и его сочетан-ного применения с наноструктурированным кобальт-арабиногалактаном. Показана их способность повышать пролифератив-ную и функциональную активность лимфоцитов крови экспериментальных животных. Получены новые данные о возможности применения антигенного препарата сибиреязвенного микроба для повышения резистентности организма экспериментальных животных к B. anthracis.
Ключевые слова: сибирская язва, антигены, нанокомпозиты, иммунитет, апоптоз
Influence of Bacillus anthracis 34F2 Sterne Antigen Preparations in Combination with Cobaltarabinogalactan on the apoptosis blood cells in vitro
V.I. Dubrovina1 (dubrovina-valya@mail.ru), V.V. Voytkova1, S.V. Lukyanova1, O.V. Yuryeva1, V.B. Nikolaev1, G.P. Aleksandrova2
1Irkutsk Antiplague Research Institute Research Institute of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being
Surveillance
2A.E. Favorsky named Irkutsk Institute of Chemistry of the Siberian Branch of Russian Academy of Sciences Abstract
In our work materials of research of an antigenic preparation of a strain of Bacillus anthracis 34F2 Sterne and its combined application with nanostructured cobalt-arabinogalaktan are presented. Their ability to increase proliferative and functional activity of lymphocytes of blood of experimental animals is shown. New data indicating the possibility of B. anthracis antigen extract applications as the preparations that raise resistance of the experimental animals against B. anthracis infection are obtained. Key words: anthrax, antigenеs, nanocomposite, immunity, apoptosis
Введение
Основной принцип совершенствования химических вакцин заключается во введении в препарат дополнительных антигенов, выбор которых осуществляется исходя из особенностей патогенеза и иммуногенеза инфекционных заболеваний. В качестве компонентов, повышающих иммуногенность сибиреязвенных химических вакцин, предлагаются споровые и капсульные антигены, белки S-слоя, деток-сицированные отечный и летальный факторы [1, 2].
По мнению I.J. Glomski с соавт., в состав прототипов сибиреязвенных вакцин наряду с протектив-ным антигеном должны входить компоненты спор или клеток B. anthracis, усиливающие клеточный иммунитет [3]. Перспективным направлением считают разработку иммуноактиваторов, модулирующих формирование адаптивного иммунитета [4].
Известно, что наиболее выраженный иммунный ответ формируется на конъюгат антиге-
на с иммуностимулятором (адъювантом). Поиск и создание иммуномодуляторов, нацеленных на активацию эффекторов врожденного иммунитета, крайне важны [5].
Установлено, что полисахарид растительного происхождения - арабиногалактан (АГ) - является одним из перспективных кандидатов на роль стабилизирующей матрицы для синтеза нанострукту-рированных металлосодержащих композитов.
Ранее нами было показано, что антигенный препарат из вакцинного штамма B. anthracis 34F2 Sterne (S-2) в сочетании с Со-АГ обладает способностью повышать неспецифические факторы иммунитета [6 - 9]. Однако действие препарата S-2 на активацию и апоптоз клеток крови не изучено, в связи с чем исследование особенностей реагирования макроорганизма на этот антигенный препарат с помощью современных методов клеточной биологии представляется актуальным [10, 11].
Цель работы - изучить влияние S-2 B. anthracis в сочетании с Со-АГ на активацию и апоптоз клеток крови в условиях in vitro.
Материалы и методы
В работе были использованы 72 особи беспородных белых мышей обоего пола, сертифицированных (НПО «Вектор», г. Новосибирск), стандартных по условиям содержания и весу (массой 15 - 20 г). Животных выводили из эксперимента в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных Приказом МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755 и Приложением к Приказу МЗ РФ от 19.06.2003 г. № 267 «Об утверждении Правил лабораторной практики».
Объектом исследования служил антигенный препарат, полученный из вакцинного штамма B. anthracis 34F2 Sternе. В качестве адъюванта использовали Со-АГ (содержание металла 1%) [12].
Материалом для исследования служили лейкоциты, выделенные из гепаринизированной крови мышей. Кровь отстаивали с 3%-ным желатином, приготовленным на фосфатно-солевом буфере, в соотношении 1:1 до четкого разделения эритроцитов и плазмы в течение 40 - 60 мин при комнатной температуре. Отбирали плазму и верхний слой эритроцитов, центрифугировали при 200 g в течение 5 мин, осадок ресуспендировали в 5 мл лизирую-щего буфера Lysing Buffer (BD Biosciences, Oxford, Великобритания), инкубировали 5 мин на льду, отмывали при 200 g в течение 2 мин и доводили до концентрации 2 х 107 кл/мл фосфатно-солевым буфером. Клетки в концентрации 106 (50 мкл) инкубировали в течение 30 мин с препаратами: S-2 (20 мкг по белку); Со-АГ (10 мкг); Со-АГ + S-2. В качестве контроля использовали клетки интактных животных. Фенотип лимфоцитов определяли с использованием моноклональных антител компании Becton Dickinson (США) в следующей панели: CD45-APC/CD3-FITC/CD4-Alexa-700/CD8-APC-Cy7/CD25-PE-Cy7/Annexin-PE/7-AAD [13]. Анализ окрашенных образцов проводили на проточном цитофлуориме-тре BD FACSCanto™ II в программе BD Diva 6.0.
Для изучения клеточного звена иммунной системы определяли следующие субпопуляции Т-лимфоцитов: общее содержание активированных Т-лимфоцитов (CD3+CD25+), общее содержание активированных Т-хелперов (CD3+CD4+CD25+), популяции активированных Т-хелперов (CD3+CD4+CD25™ и CD3+CD4+CD25iíb™), активированные цитотокси-ческие Т-лимфоциты (CD3+CD8+CD25+), нативные Т-хелперы (CD3+CD4+CD25-), нативные цитотоксические Т-лимфоциты (CD3+CD8+CD25-). Жизнеспособность клеток оценивали на двухпараметрических графиках АnV/7-AAD и подсчитывали процент живых клеток ^nVT-AAD"), клеток на стадии раннего ^nV+7-AAD-) и позднего ^nV+7-AAD+) апоптоза.
Статистическая обработка данных производилась при помощи стандартного пакета приклад-
ных программ Statistica, версия 6.1 (©StatSoft, Inc 19842001, ИПЧИ 31415926535897). Статистический анализ данных осуществляли с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни, корреляционный - методом ранговой корреляции Спирмена (rs). Данные представлены в виде медианы и интерквантильного (25-й и 75-й процентили) размаха (Me (Q1-Q3)) из n = 7. Различия считали достоверными при уровне значимости Р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Результаты исследования показали, что антигенный препарат S-2 оказывает стимулирующее влияние на экспрессию CD25 Т-лимфоцитами (табл. 1). Так, S-2 и S-2 + Со-АГ способствуют увеличению общей популяции активированных Т-клеток (CD3+CD25+) в среднем в 4,2 и 3,7 раза соответственно по сравнению с контролем (Р < 0,01). Следует отметить, что соотношение активированных и неактивированных Т-клеток (CD3+CD25+/ CD3+CD25-) в контроле составляет 1:3, при воздействии S-2 количество CD3+CD25+ клеток возрастает до 41:1, а при воздействии S-2 + Со-АГ - до 8:1.
Установлено, что препараты S-2 и S-2 + Со-АГ приводят к достоверному увеличению концентрации Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности CD25 (см. табл. 1). У Т-хелперов отмечены существенные различия в степени экспрессии CD25 (CD3+CD4+CD25M™ и CD3+CD4+CD25высокий). Так, под действием S-2 наблюдалось увеличение общего содержания активированных Т-лимфоцитов за счет повышения CD3+CD4+CD25высокий. Примирова-ние клеток комплексным препаратом (S-2 + Со-АГ) приводит к повышению как CD3+CD4+CD25низкий, так и CD3+CD4+CD25высокий клеток (рис. 1). Следует отметить, что S-2 стимулирует экспрессию CD25 Т-лимфоцитами (CD3+CD25+) и их субпопуляциями (CD3+CD4+CD25+, CD3+CD4+CD25высокий) в большей степени (Р < 0,01), чем S-2 + Со-АГ. При сравнительном анализе действия Со-АГ статистически достоверных изменений концентрации активированных Т-лимфоцитов не выявлено; тем не менее зарегистрировано снижение уровня активированных CD3+CD8+-лимфоцитов (см. табл. 1).
Анализ жизнеспособности клеток крови, при-мированных препаратами, показал, что S-2 и S-2 + Со-АГ способствуют повышению содержания АnV+7-AAD+ и одновременному снижению Ап^ 7-AAD- и АnV+7-AAD- общей популяции лимфоцитов, Т-лимфоцитов и их субпопуляций (табл. 2). Так, отмечена корреляционная связь между клетками АnV+7-AAD+ и АnV-7-AAD (rs = -0,86, Р < 0,01). У клеток, примированных S-2, в отличие от Со-АГ, выявлена взаимосвязь АnV+7-AAD+ и АnV+7-AAD-(rs = -0,90, Р < 0,01).
Анализ экспрессии CD25 Т-лимфоцитами на разных стадиях апоптоза показал, что антигенные препараты S-2 и S-2 + Со-АГ способствуют снижению АnV+7-AAD+ и АnV-7-AAD- нативных и жизне-
Таблица 1.
Характеристика экспрессии маркера активации CD25 Т-лимфоцитами крови (Ме ^1^3))
Показатель, %
Препарат CD3+ CD25+ CD3+ CD3CD4+ CD3CD4+ CD3CD8+ CD3CD8+
CD25+ CD25- CD25+ CD25-
CD25-
S-2 99,6 2,4 76,3 1,85 18,4 0,4
(п = 7) (94,9 - 99,6)** (0,2 - 5,0)** (71,3 - 79,9)** (0,1 - 4,0)** (17,4 - 21,4)** (0 - 0,6)**
Со-АГ 22,1 77,9 17,7 60,6 4,5 14,3
(п = 7) (21,7 - 25,9) (74,1 - 78,3) (16,5 - 20,6) (56,1 - 61,4) (4,5 - 4,8)* (14,0 - 15,7)
S-2 + 88,5 11,5 69,3 10,6 16,8 1,1
Со-АГ (85,4 - 96,6)** (3,4 - 14,5)** (51,4 - 72,9)** (4,5 - 15,3)** (15,4 - 19,3)** (0,4 - 2,1)**
(п = 7)
Контроль 23,6 76,4 18,2 60,8 5,4 13,9
(п = 7) (22,2 - 32,1) (67,9 - 77,8) (16,1 - 24,1) (53,5 - 61,8) (4,7 - 6,9) (13,2 - 14,7)
Примечание: *Р < 0,05; **Р < 0,01 по сравнению с контролем.
Рисунок 1.
Уровень экспрессии раннего маркера активации (CD25) Т-хелперами (Ме, %)
CD25
Примечание: *Р < 0,01 по сравнению с контролем
Таблица 2.
Характеристика жизнеспособности клеток крови, примированных антигенными препаратами (Ме ^1- Q3))
Препарат Показатель, %
AnV7-AAD+ AnV-7-AAD- AnV+7-AAD-
S-2 97,7 (95,2 - 99,2)* 2,2 (0,4 - 2,7)* 0,5 (0,2 - 1,1)*
Со-АГ 22,0 (20,0 - 25,7) 65,9 (63,7 - 67,3) 9,3 (8,4 - 11,7)
S-2 + Со-АГ 89,8 (87,4 - 96,3)* 5,1 (2,0 - 8,1)* 0,7 (0,6 - 0,8)*
Контроль 23,2 (21,5 - 32,1) 65,1 (58,2 - 66,3) 10,4 (9,4 - 12,4)
Примечание: *Р < 0,01 по сравнению с контролем.
способных CD25+ Т-лимфоцитов и их субпопуляций (Р < 0,01). Вместе с тем установлено повышение содержания клеток CD3+CD25+, CD3+CD8+CD25+ и CD3+CD4+CD25 высокий на стадии позднего апоптоза в 4, 3 и 20 раз соответственно по сравнению с контролем (20,6 (18,4 - 28,9); 4,5 (4,2 - 6,1); 3,2 (2,1 -4,3); Р < 0,01). Результаты исследования показали, что препараты S-2 и S-2 + Со-АГ не влияют на содержание CD3+CD4+CD25 низкий АnV+7-AAD+. Установлено, что Со-АГ не оказывает действие на процесс апоптоза клеток крови экспериментальных животных.
Корреляционный анализ показал наличие общих связей CD3+CD25+, примированных S-2 и S-2 + Со-АГ, с CD3+АnV+7-AAD- (ге = -0,89, Р < 0,01), с CD3+CD4+АnV-7-AAD- (ге = -0,94, Р < 0,01), с CD3+CD4+ АnV+7-AAD- (ге = -0,77, Р < 0,05), а также индивидуальных корреляций при взаимодействии S-2 с CD3+CD8+ АnV-7-AAD- (rs = -0,84, Р < 0,05) и при S2 + Со-АГ - с CD3+CD4+АnV+7-AAD+ (ге = 0,96, Р < 0,01), CD3+CD8+АnV+7-AAD- (rs = -0,78, Р < 0,01), CD3+АnV+7-AAD+ (rs = 0,96, Р < 0,01), CD3+АnV-7-AAD- (ге = 0,96, Р < 0,01). У клеток крови, примированных Со-АГ, отмечены две корреляции: CD3+CD25+ с CD3+АnV+7-AAD+ и с CD3+CD4+АnV+7-AAD+ (rs = 0,96, Р < 0,01).
Известно, что суть иммунной реакции на антиген заключается в пролиферации и дифферен-цировке эффекторных лимфоцитов. Кроме того, не вызывает сомнения тот факт, что при иммунном ответе макроорганизма процессы пролиферации и апоптоза клеток тесно взаимосвязаны. Апоптозу эффекторных клеток, в частности
Т-лимфоцитов, отводится особая роль в механизмах сохранения клеточного баланса и иммуноре-гуляции посредством снижения числа реактивных клеток [14, 15].
Таким образом, изучение нарушения асимметрии мембранных фосфолипидов клеток крови и экспрессии маркеров активации под действием антигенных препаратов S-2 и S-2 + Со-АГ с помощью цитофлуориметрического теста позволяет оценить взаимосвязь между процессами пролиферации и активации апоптоза клеток.
Выводы
1. Показано, что в условиях in vitro экспериментальные препараты S-2 и S-2 + Со-АГ повышают пролиферативную и функциональную активность лимфоцитов, что подтверждается повышением экспрессии CD25+ на иммунокомпетентных клетках крови экспериментальных животных.
2. Со-АГ оказывает влияние на иммунологическую эффективность антигенного препарата S-2, что может указывать на перспективность использования его в качестве адъюванта при конструировании химических вакцин.
Настоящая работа является одним из этапов комплексного исследования иммуногенных свойств антигенного препарата S-2 вакцинного штамма B. anthracis 34F2 Sternе и его сочетания с Со-АГ, которые могут рассматриваться в качестве перспективных компонентов химических сибиреязвенных вакцин. ш
Литература
Микшис Н.И., Попов Ю.А., Кутырев В.В. Современные представления о факторах патогенности и иммуногенности возбудителя сибирской язвы. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2010; 3: 96 - 101.
Микшис Н.И. Прототипы сибиреязвенных вакцин на основе генно-инженерных бациллярных штаммов и синтезируемых ими антигенов : автореф. дис. ... докт. мед. наук. Саратов; 2009: 47.
Glomski I.J., Corre J.R, Mock M., Goolssens P.L. Cutting Edge: IFN-gamma-producing CD4 T-lymphocytes mediate sporeinduced immunity to capsulated B. anthracis. J. Immunol. 2007; 178: 2646 - 2650.
Семенов Б.Ф., Зверев В.В., Хаитов Р.М. Прогноз развития вакцинопрофилактики в первые десятилетия XXI века. Иммунология. 2009; 6: 324 -335. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Современные иммуномодуляторы: основные принципы их применения. Иммунология. 2000; 5: 4 - 7. Дубровина В.И., Витязева С.А., Коновалова Ж.А., Старовойтова Т.П., Мухтургин Г.Б., Сухов Б.Г. и др. Сравнительная характеристика действия нано-структурированных аргенто-1-винил-1,2,4-триазола, аргентогалактоманнана и кобальтарабиногалактана на иммунную реакцию экспериментальных животных. Нанотехнологии и охрана здоровья. 2012; 3 (12): 31 - 38.
7. Коновалова Ж.А., Дубровина В.И., Витязева С.А., Лукьянова С.В., Войткова В.В., Александрова Г. П. и др. Влияние наноструктурированных аргенто-1-винил-1,2,4-триазола, кобальтарабиногалактана и аргентогалактоманнана на антимикробные факторы иммунитета. Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения: материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора. Г.Г. Онищенко, Н.В. Зайцева, ред. Пермь: Книжный формат, 2012; 1: 305 - 308.
8. Коновалова Ж.А., Витязева С.А., Кравец Е.В., Лукьянова С.В., Ястремская К.Ю., Дубровина В.И. Иммуногенные свойства экспериментальных антигенных препаратов Bacillus anthracis 34F2 Stemе. Актуальные проблемы профилактической медицины, среды обитания и здоровья населения: Матер. Всеросс. научн.-практ. конф. молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора, Уфа, 25 - 27 сентября 2013 г. Уфа, 2013; 2: 304 - 307.
9. Витязева С.А., Старовойтова Т.П., Дубровина В.И Сравнительная характеристика иммунного ответа макроорганизма при пероральном и парентеральном введении металлосодержащего нанобиокомпозита. Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. 2012; 2 (84): 114 - 117.
10. Войткова В.В. Изучение апоптоза клеток макроорганизма методом проточной цитофлуориметрии. Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2010; 6 (1): 220 - 226.
11. Gerke V., Moss S. E. Annexins: from structure to function. Physiol. Rev. 2002; 82: 331 - 371.
12. Александрова Г.П., Медведева С.А., Грищенко Л.А., Сухов Б.Г., Трофимов Б.А. Способ получения наноразмерных металлических и металлоксидных частиц. Патент РФ, № 2260500; 2005.
13. Войткова В.В., Дубровина В.И., Колесникова О.Б., Коновалова Ж.А., Лукьянова С.В., Бельков А.И. Выявление фосфатидилсерина на лимфоцитах крови мышей с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCanto™ II. Метод. рекомендации. Иркутский НИ противочум. ин-т Сибири и ДВ. Иркутск, 2010: 16.
14. Grunov K., Spletstoesser W. Apoptosis versus necrocis of host cells after infection with Francisella tularensis. The 3rd Intern. conf. on tularemia. Ume . 2000: 53.
15. Budd R.C. Activation-induced cell death. Curr. Opin. Immunol. 2001; 13 (3): 356 - 362.
References
1. Mikshis N.I., Popov Yu.A., Kutyrev V.V. Modern conceptions about pathogenicity and immunogenicity factors of the anthrax causative agent. Zhurn. mikrobiol., epidemiol. and immunobiol. 2010; 3: 96 - 101 (in Russian).
2. Mikshis N.I. Prototypes of anthrax vaccines on the basis of genetic-engineering bacillary strains and the synthesized antigens: abstract of a thesis ... Doctor of Med. sciences. Saratov, 2009: 47 (in Russian).
3. Glomski I.J., Corre J.P., Mock M., Goolssens PL. Cutting Edge: IFN-gamma-producing CD4 T-lymphocytes mediate spore-induced immunity to capsulated B. anthracis. J. Immunol. 2007; 178: 2646 - 2650.
4. Semenov B.F., Zverev V.V., Haitov R.M. Forecast of vaccinal prevention development in the first decades of the XXI century. Immunologia. 2009; 6: 324 - 35 (in Russian).
5. Haitov R.M., Pinegin B.V. Current immunomodulators: main principles of its application. Immunologia. 2000; 5: 4 - 7 (in Russian).
6. Dubrovina V.I., Vityazeva S.A., Konovalova Zh.A., Starovoitova T.P, Mukhturgin G.B., Suhov B.G. et al. Comparative characteristic of nanostructured argento-1-vinyl-1,2,4-triazol, argentogalactomannan and cobaltarabinogalactane action to immune reaction of experimental animals. Nanotekhnologii i okhrana zdoroviya. 2012; 3(12): 31 - 38 (in Russian).
7. Konovalova Zh.A., Dubrovina V.I., Vityazeva S.A., Lukyanova S.V., Voitkova V.V., Aleksandrova G.P. et al. Influence of nanostructured argento-1-vinyl-1,2,4-triazol, cobaltarabinogalactane and argentogalactomannan on antimicrobic factors of immunity. Fundamental and Applied Aspects of the Risk Analysis to population health: Materials of the All-Russian Scientific-Practical Conference of Young Scientists and Experts of of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance: in 2 Volumes. Ed: G.G. Onishchenko, N.V. Zaitseva. Perm: Book format, 2012; 1: 305 - 308 (in Russian).
8. Konovalova Zh.A., Vityazeva S.A., Kravets E.V., Lukyanova S.V., Yastremskaya K.Yu., Dubrovina V.I. Immunogenic properties of experimental antigen preparations of Bacillus anthracis 34F2 Sterne. Actual Problems of Preventive Medicine, Inhabitancy and Population Health: Materials of All-Russian Scientific-Practical Conference of Young Scientists and Experts of the Research Institutions of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance, Ufa, September 25 - 27, 2013. Ufa. 2013; 2: 304 - 307 (in Russian).
9. Vityazeva S.A., Starovoitova T.P, Dubrovina V.I. Comparative characteristic of a macroorganism immune response at oral and parenteral injection of metal-containing nanobiocomposite. Bulletin of the East-Siberian Centre of Science of the Siberian Branch of the Russian Academy of Med. Sciences. 2012; 2 (84): 114 - 117 (in Russian).
10. Voitkova V.V. Studying of macroorganism cell apoptosis by flow cytometric method. Bulletin of the East-Siberian Centre of Science of the Siberian Branch of the Russian Academy of Med. Sciences. 2010; 6 (1): 220 - 226 (in Russian).
11. Gerke V., Moss S.E. Annexins: from structure to function. Physiol. Rev. 2002; 82: 331 - 371.
12. Aleksandrova G.P., Medvedeva S.A., Grishchenko L.A., Suhov B.G., Trofimov B.A. A method of preparation of nanodimensional metal and metalloxide particles. Patent of the Russian Federation. № 2260500; 2005 (in Russian).
13. Voitkova V.V., Dubrovina V.I., Kolesnikova O.B., Konovalova Zh.A., Lukyanova S.V., Belkov A.I. Detection of phosphatidyl serine on mice blood lymphocytes by flow cytofluorimeter BD FACSCanto™ II: methodical recommendations. Irkutsk Antiplague Institute of Siberia and Far East. Irkutsk, 2010: 16 (in Russian).
14. Gr nov K., Spletstoesser W. Apoptosis versus necrosis of host cells after infection with Francisella tularensis. The 3rd intern. conf. on tularemia. Ume, 2000: 53.
15. Budd R.C. Activation-induced cell death. Curr. Opin. Immunol. 2001; 13 (3): 356 - 362.
поздравляем
с награждением дипломом национальной премии лучшим врачам России «ПРИзВАнИЕ» в номинации «Специальная премия врачам, оказывающим помощь пострадавшим во время войн,
террористических актов и стихийных бедствий» сотрудников Иркутского противочумного института: зав. отделом эпидемиологии к.м.н. С.А. КоСИлКо, зав. отделом зоонозных инфекций к.м.н. л.М. МИхАйлоВА, ведущих научных сотрудников отдела эпидемиологии к.м.н. А.К. ноСКоВА и к.б.н. М.В. АФАнАСьЕВА
