CC BY
50
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION.
NATURAL SCIENCE. 2017. No. 3-2
УДК 575.224.226:616.24-006 DOI 10.23683/0321-3005-2017-3-2-74-82
ИЗМЕНЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ КОПИЙНОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛОКУСОВ ВО ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК У ПАЦИЕНТОВ С АДЕНОКАРЦИНОМОЙ ЛЕГКОГО*
© 2017г. Д.С. Кутилин1, Т.Г. Айрапетова1, П.А. Анистратов1, С.П. Пыльцин1, И.А. Лейман1, А.В. Чубарян1, И.Н. Туркин1, Д.И. Водолажский1, Н.В. Николаева1, И.Б. Лысенко1
1Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, Ростов-на-Дону, Россия
RELATIVE COPY NUMBER VARIATION OF GENETIC LOCI IN THE CELL-FREE DNA IN PATIENTS WITH LUNG ADENOCARCINOMA
D.S. Kutilin1, T.G. Airapetova 1, P.A. Anistratov1, S.P. Pyltsin1, I.A. Leiman1, A.V. Chubaryan1, I.N. Turkin1, D.I. Vodolazhsky1, N. V. Nikolaeva1, I.B. Lysenko1
1Rostov Research Institute of Oncology, Rostov-on-Don, Russia
Кутилин Денис Сергеевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатория молекулярной онкологии, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: k.denees@yandex.ru
Айрапетова Тамара Георгиевна - кандидат медицинских наук, врач-онколог, отделение торакальной хирургии, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: k.denees@yandex.ru
Анистратов Павел Александрович - кандидат медицинских наук, врач-онколог, отделение торакальной хирургии, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: k.denees@yandex.ru
Пыльцин Сергей Петрович - кандидат медицинских наук, врач-онколог, отделение торакальной хирургии, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: k.denees@yandex.ru
Лейман Игорь Александрович - кандидат медицинских наук, врач-онколог, отделение торакальной хирургии, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: k.denees@yandex.ru
Чубарян Анна Васильевна - кандидат медицинских наук, врач-онколог, отделение торакальной хирургии, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: k.denees@yandex.ru
Туркин Игорь Николаевич - доктор медицинских наук, заведующий отделением торакальной хирургии, врач - торакальный хирург, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: k.denees@yandex.ru
Denis S. Kutilin - Candidate of Biological Science, Senior Researcher, Laboratory of Molecular Oncology, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: k.denees@yandex.ru
Tamara G. Ayrapetova - Candidate of Medicine, Oncologist, Department of Thoracic Surgery, Rostov Research Institute of Oncology. 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: k.denees@yandex.ru
Pavel A. Anistratov - Candidate of Medicine, Oncologist, Department of Thoracic Surgery, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: k.denees@yandex.ru
Sergey P. Pyltsin - Candidate of Medicine, Oncologist, Department of Thoracic Surgery, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: k.denees@yandex.ru
Igor A. Leyman - Candidate of Medicine, Oncologist, Department of Thoracic Surgery, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: k.denees@yandex.ru
Anna V. Chubaryan - Candidate of Medicine, Oncologist, Department of Thoracic Surgery, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: k.denees@yandex.ru
Igor N. Turkin - Doctor of Medicine, Head of Department of Thoracic Surgery, Thoracic Surgeron, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: k.denees@yandex.ru
* Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 16-34-00267 мол_а.
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION. NATURAL SCIENCE. 2017. No. 3-2
Водолажский Дмитрий Игоревич - кандидат биологических наук, руководитель лаборатории молекулярной онкологии, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: k.denees@yandex.ru
Николаева Надежда Владимировна - доктор медицинских наук, врач-гематолог, отделение онкогематологии, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: k.denees@yandex.ru.
Лысенко Ирина Борисовна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая отделением онкогематологии, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: k.denees@yandex.ru
Dmitriy I. Vodolazhsky - Candidate of Biological Science, Head of Laboratory of Molecular Oncology, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: k.denees@yandex.ru
Nadezhda V. Nikolaeva - Doctor of Medicine, Hematologist, Department of Oncohematology, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: k.denees@yandex.ru
Irina B. Lysenko - Doctor of Medicine, Professor, Head of Department of Oncohematology, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: k.denees@yandex.ru
Цель - сравнительный анализ изменения относительной копийности генетических локусов, ответственных за регуляцию апоптоза (BAX, BCL2, C-FLAR, p53, MDM2), пролиферацию (MKI67, KRAS, EGFR), окислительное фосфорилирование (HV2) и ответ на гипоксию (HIF1A) во внеклеточной (внДНК) у пациентов с аденокарциномой легкого и здоровых доноров для выявления высокоспецифичных онкомаркеров.
Методы. Методом RT-qPCR исследована относительная копийность 10 генетических локусов во внДНК плазмы крови 40 пациентов с гистологически подтвержденным диагнозом «аденокарцинома легкого» (22 пациента с метастазами в лимфатические узлы и 18 пациентов без метастазов), а также во внДНК плазмы крови 15 здоровых доноров. Статистика: программа Microsoft Excel 2013 и STATISTICA 8.0.
Результаты. Обнаружено достоверное изменение копийности 4 генетических локусов во внДНК плазмы крови у пациентов с аденокарциномой легкого по сравнению с внДНК условно здоровых доноров: снижение количества копий HV2 (гипервариабельный участок с 33-го по 160-й нуклеотид D-петли мтДНК), снижение копийности гена p53, увеличение копийности гена MDM2 и HIF1A. Обнаружено также, что число копий гена р53 и участка HV2 мтДНК во внДНК у больных с метастазами достоверно ниже числа копий этих генетических локусов во внДНК у больных раком легкого без метастазов.
Выводы. Копийность HV2 мтДНК, генов р53, MDM2 и HIF1A во внДНК пациентов отличается от копийности во внДНК здоровых доноров и имеет потенциал к использованию для малоинвазивной предиктивной диагностики аденокарциномы легкого.
Копийность гена р53 и участка HV2 мтДНК во внДНК у больных с метастазами отличается от копийности у больных раком легкого без метастазов и имеет потенциал к использованию для малоинвазивного прогнозирования развития адено-карциномы легкого и исхода этого заболевания.
Ключевые слова: копийность генов, аденокарцинома легкого, внеклеточная ДНК, онкомаркеры.
Aim - a comparative analysis of relative CNV of the genetic loci responsible for the regulation of apoptosis (BAX, BCL2, C-FLAR, P53, MDM2), proliferation (MKI67, KRAS, EGFR), oxidative phosphorylation (HV2) and hypoxia response (HIF1A) in cellfree DNA in patients with lung adenocarcinoma and healthy donors for the detection of highly specific tumor markers.
Methods. The RT-qPCR method was used to study the relative CNV of 10 genetic loci in the cell-free DNA of blood plasma in 40 patients with a histologically confirmed diagnosis of lung adenocarcinoma (22 patients with lymph node metastases and 18 patients without metastases), and in the cell-free DNA of the blood plasma of 15 healthy donors. Statistics: Microsoft Excel 2013 and STATISTICA 8.0.
Results. There was a significant change in the copy number of 4 genetic loci in the cell-free DNA of blood plasma in patients with lung adenocarcinoma in comparison with the cell-free DNA of healthy donors: a decrease in copy number of HV2 (a hypervariable region with 33 to 160 nucleotides of the mtDNA D-loop), a decrease in copy number of the p53 gene, an increase in copy number of the genes MDM2 and HIF1A. It was also found that CNV of the p53 gene and HV2 in cell-free DNA in patients with metastases is significantly lower than the CNV of these genetic loci in cell-free DNA in patients with lung cancer without metastases.
Conclusions. The copy number of HV2 mtDNA, p53, MDM2 and HIF1A genes in cell-free DNA of patients differs from copy number in cell-free DNA of healthy donors, and has the potential to be usedfor low invasive predictive diagnosis of lung adenocarcinoma.
The copy number ofp53 gene and HV2 section of mtDNA in cell-free DNA of lung cancer patients with metastases differs from that ofpatients without metastases. CNV of these genes has the potential to be used for low invasive predictions of the development lung adenocarcinoma and the outcome of this disease.
Keywords: copy number variations of genes, lung adenocarcinoma, cell-free DNA, oncomarkers.
Введение
В мире ежегодно регистрируется более 1,8 млн новых случаев заболевания раком легкого и более 1,5 млн смертей от данной патологии [1]. Столь высокий показатель смертности отчасти связан с
тем, что в настоящее время проблема ранней диагностики рака легкого остается нерешенной, а изученные молекулярные маркеры не показывают достоверной специфичности. Прогностическое значение многих из них спорно и главным образом отражает различия в методологии исследований,
ISSN 0321-3005 ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. СЕВЕРО-КАВКАЗСКИЙ РЕГИОН._ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ. 2017. № 3-2
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION. NATURAL SCIENCE. 2017. No. 3-2
группах пациентов и интерпретациях. Прогностической ценностью обладают сигнатуры экспрессии определённых генов (например, DUSP6, MMD, STAT1, ERBB3 и LCK), хотя эти данные чрезвычайно гетерогенны [2].
Трансформация клеток в раковые и опухолевая прогрессия связаны с накоплением изменений в геноме, что обеспечивает приобретение трансформированными клетками неограниченного потенциала к пролиферации, резистентности к сигналам апоптоза, способности поддерживать ангиогенез, способности к инвазии и метастазированию. Молекулярные изменения, ответственные за приобретение вышеуказанных свойств, могут использоваться в качестве онкомаркеров [3, 4]. К подобным молекулярным онкомаркерам можно отнести специфические изменения числа копий генов (CNV) [5].
CNV является одним из основных механизмов изменения степени экспрессии потенциальных онкогенов и генов - супрессоров опухолей раковыми клетками. CNV - вид генетического полиморфизма, возникающий в результате несбалансированных хромосомных перестроек, приводящих к делециям и дупликациям фрагментов ДНК размером больше, чем 50 пар оснований [6]. Результатом подобных несбалансированных хромосомных перестроек также могут явиться снижение или повышение числа копий определенного гена и, следовательно, пониженная или повышенная экспрессия продукта гена -белка или некодирующей РНК [7]. Минимум 12 % человеческого генома подвергаются вариациям числа копий. Вклад CNV в изменчивость генома сопоставим со вкладом однонуклеотидных полиморфизмов или даже превышает его [8]. Публикации последних лет показывают, что CNV являются следующим уровнем в полном понимании молекулярного контекста развития опухолевого процесса. Изучена роль CNV в качестве фактора малигнизации тканей желудка: в работе [9] показано, что увеличение ко-пийности гена MDM2 коррелирует с увеличенной экспрессией белка MDM2 и понижением экспрессии белка p53. В 2016 г. нами было проведено исследование относительной копийности 12 генетических локусов, ответственных за регуляцию апоптоза (BAX, BCL2, C-FLAR, p53, MDM2), пролиферацию (SOX2, OCT4, NANOG, PIK3 и MKI67), окислительное фосфорилирование (HV2) и ответ на гипоксию (HIF1A) методом Real-Time qPCR в 60 образцах, содержащих опухолевые (30) и нормальные (30) клетки тканей легкого (препараты получены с помощью лазерной микродиссекции (Palm MicroBeam, Carl Zeiss, Германия)). Было обнаружено снижение копийности проапоптозных генов BAX и р53 и увеличение копийности антиапоптозного гена MDM2 и гена HIF1A, участвующего в регуляции ангиогенеза
и метаболической адаптации к гипоксии [2]. Данные генетические локусы имеют высокий потенциал в качестве молекулярных маркеров для прогнозирования течения и развития рака легкого, однако этот потенциал ограничен высоким уровнем инвазивно-сти при получении биоматериала. Возможное решение этой проблемы находится в переходе на исследование копийности генов во внеклеточной ДНК (внДНК) плазмы крови.
К внДНК в организме следует отнести клеточную и митохондриальную ДНК (мтДНК) из соматических и опухолевых клеток, подвергающихся процессам апоптоза и некроза; из эритробластов, ядра которых энуклеируются в процессе диффе-ренцировки в эритроциты, из лимфоцитов в процессе их апоптотической гибели после стимуляции, эмбрионов в крови матери, бактериальную и вирусную ДНК [10].
При многих видах опухолей определяется повышенный уровень внДНК в периферической крови. При этом прогресс заболевания часто связан с постепенным повышением уровня внДНК. Более того, довольно часто уровень внДНК возрастает при метастазировании опухоли по сравнению со значениями в отсутствие последних [10].
Таким образом, исследование копийности генов во внДНК может обеспечить данными, необходимыми для формирования панели новых высокоспецифичных онкомаркеров, которые можно будет использовать для предиктивной малоинвазивной диагностики, планирования стратегии лечения и прогнозирования развития заболевания.
Цель исследования - сравнительный анализ изменения относительной копийности генетических локусов, ответственных за регуляцию апоптоза (ВАХ, ВСЬ2, С-ЕЬАЯ, р53, МБМ2), пролиферацию (МК167, КЯАБ, ЕОЕК), окислительное фосфорилирование (НУ2) и ответ на гипоксию (Н1Г1А) во внДНК у пациентов с аденокарциномой легкого и здоровых доноров для выявления высокоспецифичных онкомаркеров.
Материалы и методы
Клиническим материалом для исследования послужила плазма крови 40 пациентов с гистологически подтвержденным диагнозом «аденокарцинома легкого» (степень дифференцировки G1), взятая до операции (22 пациента с метастазами в лимфатические узлы, 18 - без метастазов), а также плазма крови 15 условно здоровых доноров (без онкологических заболеваний).
Образцы крови (10 мл крови и 3 мл 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,5, с 0,15 М №С1 и 50 мМ ЭДТА) разделяли на плазму и фракцию клеток цен-
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION.
NATURAL SCIENCE.
2017. No. 3-2
трифугированием в течение 20 мин при 400 g и 15 °С [11]. Из плазмы крови ДНК выделяли фенол-хлороформным методом в нашей модификации. К плазме крови добавляли равный объем лизирующего буфера (2 % SDS и 1 % меркаптоэтанола) и 20 мкл протеиназы К, инкубировали в термостате при 58 °С 1 ч. К полученному лизату добавляли равный объем щелочного фенола и хлороформа (соотношение 1:1), центрифугировали 20 мин (3000 об/мин). После разделения фаз отбирали водную фазу в отдельную стерильную пробирку. К водной фазе добавляли равный объем 96%-го изопропилового спирта и раствор 5 М NaCl до концентрации 100 мМ, пробирку помещали в холодильник (-20 °С) на 60 мин. Далее центрифугировали 15 мин при 12 700 об/мин (-10 °С), декантировали супернатант, а осадок промывали 80%-м этиловым спиртом, центрифугированием удаляли остатки этанола, высушивали осадок в твердотельном термостате и растворяли в 10 мМ ТЕ-буфере.
Определение относительной копийности 10 генетических локусов (BAX, HIF1A, BCL2, CFLAR, p53, MDM2, HV2, KRAS, EGFR и MKI67) проводили методом Real-Time qPCR (RT-qPCR). Принцип метода заключается в одновременной амплификации гена-мишени и референсного гена в опытной и контрольной пробах. Вывод об изменении дозы гена делается на основании анализа соотношения сигналов, продуцируемых ам-пликонами изучаемой и референсной последовательностей [5].
Количественная RT-PCR-амплификация проводилась с использованием термоциклера Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA) в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе: 95 °C - 5 мин, 40 циклов при 95 °C - 10 с; 58 °C -30 с (чтение оптического сигнала FAM) и 72 °C -30 с. Каждые 20 мкл ПЦР-смеси для анализа содержали 2,4 нг геномной ДНК, 0,2 мМ dNTP's, по 600 нМ прямого и обратного праймеров для рефе-ренсного гена (GAPDH) или гена-мишени, 2,5 мМ MgCl2, 1X ПЦР-буфер, 0,1 u/ц! SynTaq ДНК-
полимеразы с ингибирующими активность фермента антителами («Синтол», Россия). В качестве красителя использовали EvaGreen®Dye (Biotium, США). Амплификация каждой из проб осуществлялась в трех повторностях. Первичные данные RT-qPCR получали с использованием программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager 3.1.
Прямые и обратные праймеры были разработаны нами с использованием базы данных NCBI GenBank (таблица). Генетический локус GAPDH использовали в качестве референсного для нормализации полученных показателей количественной RT-qPCR.
Усредненные данные по каждому генетическому локусу нормировались по усредненному показателю референсного гена для получения величины ACt (ACt=Ct (исследуемого гена) - Ct(GAPDH)). Относительную копийность генетического локуса (RQ) рассчитывали по формуле 2-ACt. Далее вычисляли медиану RQöh опухолевых образцов и медиану RQh контрольных (плазма условно здоровых доноров) для каждого генетического локуса и рассчитывали соотношение относительной копийности генов во внДНК больных раком легкого по отношению к ко-пийности генов во внДНК условно здоровых доноров: RQcH/RQi: [5].
Статистический анализ выполняли с использованием прикладных пакетов программ Microsoft Excel 2013 и STATISTICA 8.0. Оценку различий проводили с использованием критерия Манна -Уитни для порогового уровня статистической значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение
Во внДНК у 95 % пациентов с аденокарциномой легкого обнаружено достоверное (p<0,0005) снижение в 26,3 раза количества копий HV2 (гипервариабельный участок с 33-го по 160-й нуклеотид D-петли мтДНК) по сравнению с внДНК условно здоровых доноров (рис. 1).
Рис. 1. Копийность генов во внДНК плазмы крови больных раком легкого (n=40) относительно внДНК плазмы крови условно здоровых доноров (n=15) / Fig. 1. Copy number of extracellular DNA in blood plasma of lung cancer patients (n=40) compared
to extracellular DNA in blood plasma of healthy donors (n=15)
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION.
Снижение копийности локуса НУ2 во внДНК пациентов с аденокарциномой легкого, вероятно, отражает молекулярно-генетические особенности опухолевого процесса в тканях легкого - снижение интенсивности процессов окислительного фосфо-рилирования в опухолевых клетках, что изменяет состояние их биоэнергетики, переводя клетки в режим преимущественного использования гликолиза (эффект Варбурга) [12].
В 2016 г. исследования в [13] на выборке более 5000 опухолевых образцов показали, что в малиг-низированных тканях наблюдается снижение числа копий 207 генов - супрессоров опухоли, связанных с сигнальным путем р53.
Анализ, проведенный с помощью базы данных Cosmic (http://cancer.sanger.ac.uk), показал наличие в ней информации о 54 вариантах CNV гена p53 при онкологических заболеваниях, приводящих к потере участка, включающего и диапазон 17:76689367669076, но не при аденокарциноме легкого.
Также нами обнаружено статистически достоверное (p<0,05) увеличение копийности гена MDM2 и HIFM во внДНК пациентов относительно внДНК условно здоровых доноров на 55 и 50 % соответственно (рис. 2).
Ген MDM2 кодирует белок, который выполняет роль отрицательного регулятора опухолевого супрессора р53. Белок MDM2 функционирует как Е3-убиквитин-лигаза, распознающая N-концевой домен белка р53 и содействующая его убиквитинированию [14]. Использованные в нашем исследовании праймеры (таблица) обеспечивают амплификацию фрагмента гена MDM2, соответствующего диапазону 12:68841940-68842079 (16-й экзон гена MDM2, участок 3780-3920: TCTTTGGGA CCCA TCTA CCCTGA CCA CA TCA TGA TG TTCA TCTGCA GCTGTTGCAA GGTGTTCAGA TTGTA T AAA CA TAAA TGTCA CAAAAA CTTTAAAA GAA GTGCA ATTCTCAAAA GGTTA GGTGGA CTAAA GCATTCT) длиной 141 нуклеотид. По данным Cosmic (http://cancer.sanger.ac.uk), известно порядка 328 вари-
NATURAL SCIENCE. 2017. No. 3-2
В нашем исследовании обнаружено статистически достоверное снижение копийности гена p53 в 1,96 раза (p<0,05) во внДНК у 70 % пациентов (n=28) относительно внДНК условно здоровых доноров.
Ген человека p53 (TP53), кодирующий транскрипционный фактор, регулирующий клеточный цикл и выполняющий функцию супрессора образования злокачественных опухолей, расположен на 17-й хромосоме (17p13.1). Использованные в нашем исследовании праймеры (таблица) обеспечивают амплификацию фрагмента гена, соответствующего диапазону 17:7668936-7669076 (12-й экзон гена p53, участок 2033-2175) длиной 141 нуклеотид.
антов CNV, приводящих к увеличению копий участка, включающего и диапазон 12:6884194068842079 (рис. 3). Увеличение копийности гена MDM2 подтверждено также в работах [15, 16].
Гипоксией индуцированные факторы (HIFs) относятся к семейству транскрипционных, реагирующих на низкую концентрацию O2, что является характерной чертой солидных опухолей. Аль-фа-субъединица гетеродимера HIF является O2-чувствительной и обеспечивает функционирование HIF1A в качестве главного регулятора различных генов, участвующих в сигнальных путях гипоксии. Было показано, что изменения последовательности нуклеотидов или экспрессии HIF1A (гипоксией индуцированного фактора-1, альфа-субъединицы) связаны с развитием ряда заболеваний, включая и онкологические [17]. Ген HIF1A расположен на 14-й хромосоме.
Использованные в нашем исследовании праймеры (таблица) обеспечивают амплификацию фрагмента гена HIF1A, соответствующего диапазону 14: 61727460 - 61727572 (6-й экзон гена HIF1A, участок: ACTGCACAGGCCA CA TTCACGTATATGA TA CCAAC AGTAACCAA CCTCA GTGTGGGTA TAA GAAA CCA C CTATGA CCTGCTTGGTGCTGATTTGTGAACCCA TT CCTCACCCA) длиной 113 нуклеотидов.
Панель праймеров для определения относительной копийности генов / Panel of primers for gene CNV determination
Наименование гена Последовательность прямого праймера Последовательность обратного праймера
HV2 GGG AGC TCT CCA TGC ATT TGG TA AAA TAA TAG GAT GAG GCA GGAATC
GAPDH GCT GAA CGG GAA GCT CAC T GCA GGT TTT TCT AGA CGG CAG
BAX GCC TCC TCT CCT ACT TTG GG AAA CAC AGT CCA AGG CAG C
BCL2 GAG TGG GAT GCG GGA GAT G GGT GAA GGG CGT CAG GTG
HIF1A ACT GCA CAG GCC ACA TTC A TGG GTG AGG AAT GGG TTC AC
CFLAR GGC TCC CAG AGT GTG TAT GG GGC CCT CTG ACA CCA CAT AG
P53 GGT CGG TGG GTT GGT AGT TT GTG TGG GAT GGG GTG AGA TT
MKI67 TGA GTC AGT GAA GAA AGA GTT GGA T CCC CCT GTA AAC CAT CAG CA
MDM2 TCT TTG GGA CCC ATC TAC CCT AGA ATG CTT TAG TCC ACC TAA CCT T
KRAS GGT TGC GCT GAC CTA GGA AT TCC ATT TCG GGG CAA ACA GT
EGFR CAC CGC TTT TGT TCT CGC AA ATG CCC CAA AGG ACC TGA TG
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION.
бмкнлк MCJMHir IP Оидиин 1J nifi^wifflOffl pj Fhwy ^инИг
NATURAL SCIENCE.
2017. No. 3-2
Рис. 2. Диапазон последовательности нуклеотидов 17-й хромосомы 17:7668936-7669076, ограниченный прямым и обратным праймером к гену p53 (NCBI GenBank) / Fig. 2. Nucleotide sequence range of chromosome 17 17:7668936-7669076 limited
by forward and reverse primers to the p53 gene (NCBI GenBank)
Sho* 10 * «r>tnes
Sind« Cxpntlil» Expr level (Z-Score) О CN TYP* Minor AIM* Copy Number CN Segment Рои. * Avenge PloMy О Study CNV
TCGA-AX- ЙЗЕШ OUT A 2.24 Got л. 2 11 ............. tv.fflV 3.95 US ■ШЩ7
TCGA-03-*3CC06 О* л. 10.05 0*n A 2 23 12:60027050-69506361 tv.taV 3.41 SSflilfii
TCGA-Q6-&626-Oi tcxmtl I.» й*п ж 2 И 12:60027050.-69161420 b.Uc? 5.40 ill 5377306
TCGA-PX-46BH-01 O-f л. 10.98 6Ж1 л. 0 1» 12:60021763..60077531 2.14 Hi 5087262
та-о«' &3U6-01 О«* л. 26.45 GMl л. 0 9 12:60021763 68856768 2.03 632 <532915
TCGA-50-5049-01 Norm»l •0.2« GMI л. 6 1)0 12:6082O911 -.69039319 fflV- 2.77 412 5537719
TCGA-OX-A6BH-01 0*r A 10.90 G*n A 1 2S 12:60019051.60021605 tv.BV 2.14 4Ü 5815747
TCGA4-5-A0NE-O1 • • 0*n A Э 29 12:60011393..69103119 tv.a^ ЗЛ1 633 5076513
TCGA.PK-A1L1-01 №«r a 29.50 6MI л. 0 «2 12:60011169-71053065 4.00 632 5890905
TCGt-GC-¿1ИШ Омг A 20.97 йМ1 ж 1 40 12:68005427..69510327 3.04 1U 4p31?48
sbowng: JO io FX Pnrni 1 . 2 3 4 5 33 Hert Litt
Рис. 3. Информация об известных CNV генаMDM2 (по данным Cosmic (http://cancer.sanger.ac.uk)) / Fig. 3. Known CNV of theMDM2 gene ^cording to Cosmic (http://cancer.sanger.ac.uk))
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION.
NATURAL SCIENCE.
2017. No. 3-2
По данным Cosmic (http://cancer.sanger.ac.uk), следование (из 13) посвящено аденокарциноме
известно порядка 13 вариантов CNV, приводящих легких (StudyLung Adenocarcinoma (TCGA, US),
к увеличению копий участка, включающего и Study IdCOSU417Genes, исследовано 506 образ-
диапазон 14:61727460-61727572, причем одно ис- цов) (рис. 4).
Expntilgn (*" HW) о СИ тур» JUirtI сер* MWMtor tthpl »и«. 9 ff cw
TCGA-VO- fiSifcGJ - - Gin л. I в Hl üiüüüff
KSrt-.Ttt Övw ж as.34 ö*n ж 1 47 44) 1±1 щгыа
aiiti aasiii KWH1 0.» л 4 ff H!M!tJffil..4MJili7 <81 Üi илш
-PSA-Jl- 1ZZÜ1 hHjfmil ■Я.г. ж Л в U!5PJ7JJt-,(JJJHiI ЪХ* *.« AiZ
кшь ДАуИ-Щ №тпл| M <5«п ж 1 i 241 Ail «ИРМ
M* № ж 1 I IMIIUMJWI» 1.4* Ali ЯЙШЗ
ж 1,19 ^ 1 7 i * г-i'i»S г-1 ъх* MI Sil iaiiiti
tCGIM. jMtitt Normal Ы4 Сип j. 1 • гм Ш Я поди
ZütEfc "fllV-Oi - Uün ж 1» IMWIDU»ШН7 4.H ill Ü1BÜÜ
IÜÜL-ЫЩЦ (Mf Ж- 7Л <5*п ж 1 ъх^ Ul 111 шиа
Normd 1A Gj,n Ж % 4 iJl ил
JEtozCt •1.17 äfcn ж 9 6 tx* ш.
- * 5»п Ж ) ff 149»1Ши«ЙП]Я i.W ш
Рис. 4. Информация об известных CNV гена HIF1A (по данным Cosmic (http://cancer.sanger.ac.uk)) / Fig. 4. Known CNV of the
HIF1A gene ^cording to Cosmic (http://cancer.sanger.ac.uk))
Интересные результаты получены при сравнении копийности генетических локусов во внДНК пациентов с метастазами и без метастазов. Так, копий-ность генов МБМ2 и Н1Е1А во внДНК у пациентов с метастазами на 80 (р<0,005) и 76 % (р<0,05) соответственно выше копийности во внДНК у здоровых
доноров; при этом отсутствуют достоверные отличия от копийности этих генов во внДНК у пациентов без метастазов. Число копий гена р53 и участка НУ2 мтДНК во внДНК у больных с метастазами в 2 раза (р<0,05) ниже числа копий этих генов у больных раком легкого без метастазов (рис. 5).
Рис. 5. Уровень CNV во внДНК у больных раком легкого с метастазами и без относительно условно здоровых доноров / Fig. 5. CNV in extracellular DNA in patients with lung cancer with and without metastases compared to healthy donors
ISSN 0321-3005 ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. СЕВЕРО-КАВКАЗСКИМ РЕГИОН._ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ. 2017. № 3-2
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION. NATURAL SCIENCE. 2017. No. 3-2
Выводы
1. Копийность HV2 мтДНК, генов р53, MDM2 и HIF1A во внДНК пациентов отличается от копий-ности во внДНК здоровых доноров и имеет потенциал к использованию для малоинвазивной пре-диктивной диагностики аденокарциномы легкого.
2. Копийность гена р53 и участка HV2 мтДНК во внДНК у больных с метастазами отличается от копийности у больных раком легкого без метастазов и имеет потенциал к использованию для мало-инвазивного прогнозирования развития аденокарциномы легкого и исхода этого заболевания.
Литература
1. World Cancer Report 2014. Chapter 1. 1. World Health Organization, 2014.
2. Кутилин Д.С., Енин Я.С., Петрусенко Н.А., Водо-лажский Д.И. Изменение копийности генетических локусов при малигнизации тканей легкого // Современные проблемы науки и образования. 2016. № 6. URL: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=25994 (дата обращения: 03.02.2017).
3. Zhu C.Q., Shih W., Ling C.H., Tsao M.S. Immunohisto-chemical markers of prognosis in non-small cell lung cancer: a review and proposal for a multiphase approach to marker evaluation // J. Clin. Pathol. 2006. Vol. 59 (8). P. 790-800.
4. Владимирова Л.Ю., Кит О.И., Шолохова Е.А. Роль гистологического и молекулярного анализа в выборе метода лечения немелкоклеточного рака легкого поздних стадий // Фарматека. 2012. № 8 (241). С. 9-22.
5. Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Гудуе-ва Е.Н. Изменение копийности генетических локусов при раке желудка // Молекулярная биология. 2015. Т. 49, № 4. С. 658-666.
6. Zarrei M., MacDonald J. R., Merico D., Scherer S.W. A copy number variation map of the human genome // Nature Reviews Genetics. 2015. Vol. 16 (3). P. 172-183.
7. Chen Z., Xu W.R., Qian H., Zhu W, Bu X.F., Wang S., Yan YM., Mao F., Gu H.B., Cao H.L., Xu X.J. Oct4, a novel marker for human gastric cancer // J. Surg. Oncol. 2009. Vol. 99 (7). P. 414-419.
8. Redon R., Ishikawa S., Fitch K.R., Feuk L., Perry G.H., Andrews T.D., Fiegler H., Shapero M.H., Carson A.R., Chen W., Cho E.K., Dallaire S., Freeman J.L., González J.R., Gratacós M., Huang J., Kalaitzopoulos D., Komura D., MacDonald J.R., Marshall C.R., Mei R., Montgomery L., Nishimura K., Okamura K., Shen F., Somerville M.J., Tchinda J., Valsesia A., Woodwark C., Yang F., Zhang J., Zerjal T., Zhang J., Armengol L., Conrad D.F., Estivill X., Tyler-Smith C., Carter NP., Abumtani H., Lee C., Jones K.W., Scherer S. W., Hurles M.E. Global variation in copy number in the human genome // Nature. 2006. Vol. 444 (7118). P. 444-454.
9. Günther T., Schneider-Stock R., Hackel C., Kasper H.U., Pross M., Hackelsberger A., Lippert H., Roessner A. Mdm2 gene amplification in gastric cancer correlation with expression of Mdm2 protein and p53 alterations // A. Mod. Pathol. 2000. Vol. 13 (6). P. 621-626.
10. Козлов В.А. Свободная внеклеточная ДНК в норме и при патологии // Мед. иммунология. 2013. Т. 15, № 5. С. 399-412.
11. Тамкович С.Н., Брызгунова О.Е. Циркулирующие НК в крови больных раком желудка и толстой кишки // Клин. исследования. 2005. Т. 51, вып. 3. С. 321-328.
12. Scatena R. Mitochondria and cancer: a growing role in apoptosis, cancer cell metabolism and dedifferentiation // Adv. Exp. Med. Biol. 2012. Vol. 942. P. 287-308.
13. Zhao M., Zhao Z. Concordance of copy number loss and down-regulation of tumor suppressor genes: a pan-cancer study // BMC Genomics. 2016. Vol. 17, № 7. Р. 532. DOI 10.1186/s12864-016-2904-y.
14. Fan C., Wang X. Mdm2 Splice isoforms regulate the p53/Mdm2/Mdm4 regulatory circuit via RING domain-mediated ubiquitination of p53 and Mdm4 // Cell. Cycle. 2017. Vol. 16 (7). Р. 660-664. DOI 10.1080/15384101.2017.1288327.
15. Husain H., Nykin D., Bui N., Quan D., Gomez G., Woodward B., Venkatapathy S., Duttagupta R., Fung E., Lipp-man S.M., Kurzrock R. Cell-Free DNA from Ascites and Pleural Effusions: Molecular Insights into Genomic Aberrations and Disease Biology // Mol. Cancer. Ther. 2017. Vol. 5. Р. 948955. DOI 10.1158/1535-7163.MCT-16-0436.
16. Pfarr N., Penzel R., Klauschen F., Heim D., Brandt R., Kazdal D., Jesinghaus M., Herpel E., Schirmacher P., Warth A., Weichert W., Endris V., Stenzinger A. Copy number changes of clinically actionable genes in melanoma, non-small cell lung cancer and colorectal cancer-A survey across 822 routine diagnostic cases // Genes Chromosomes Cancer. 2016. Vol. 55 (11). Р. 821-833. DOI 10.1002/gcc.22378.
17. Gladek I., Ferdin J., Horvat S., Calin G.A., Kunej T. HIF1A gene polymorphisms and human diseases: Graphical review of 97 association studies // Genes Chromosomes Cancer. 2017. Vol. 56 (6). Р. 439-452. DOI 10.1002/gcc.22449.
References
1. World Cancer Report 2014. Chapter 1.1. World Health Organization, 2014.
2. Kutilin D.S., Enin Ya.S., Petrusenko N.A., Vodolazhskii D.I. Izmenenie kopiinosti geneticheskikh lokusov pri malignizatsii tkanei legkogo [Changes in the copy-rate of genetic loci in the malignancy of lung tissue]. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. 2016, No. 6. Available at: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=25994 (accessed 03.02.2017).
3. Zhu C.Q., Shih W., Ling C.H., Tsao M.S. Immunohisto-chemical markers of prognosis in non-small cell lung cancer: a review and proposal for a multiphase approach to marker evaluation. J. Clin. Pathol. 2006, vol. 59 (8), pp. 790-800.
4. Vladimirova L.Yu., Kit O.I., Sholokhova E.A. Rol' gistologicheskogo i molekulyarnogo analiza v vybore metoda lecheniya nemelkokletochnogo raka legkogo pozdnikh stadii [The role of histological and molecular analysis in the choice of a method for the treatment of non-small-cell lung cancer of late stages]. Farmateka. 2012, No. 8 (241), pp. 9-22.
5. Kit O.I., Vodolazhskii D.I., Kutilin D.S., Gudueva E.N. Izmenenie kopiinosti geneticheskikh lokusov pri rake zheludka [Change in the copy of genetic loci in stomach cancer]. Mole-kulyarnaya biologiya. 2015, vol. 49, No. 4, pp. 658-666.
6. Zarrei M., MacDonald J. R., Merico D., Scherer S.W. A copy number variation map of the human genome. Nature Reviews Genetics. 2015, vol. 16 (3), pp. 172-183.
7. Chen Z., Xu W.R., Qian H., Zhu W., Bu X.F., Wang S., Yan Y.M., Mao F., Gu H.B., Cao H.L., Xu X.J. Oct4, a novel marker for human gastric cancer. J. Surg. Oncol. 2009, vol. 99 (7), pp. 414-419.
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION.
8. Redon R., Ishikawa S., Fitch K.R., Feuk L., Perry G.H., Andrews T.D., Fiegler H., Shapero M.H., Carson A.R., Chen W., Cho E.K., Dallaire S., Freeman J.L., González J.R., Gratacös M., Huang J., Kalaitzopoulos D., Komura D., MacDonald J.R., Marshall C.R., Mei R., Montgomery L., Nishimura K., Okamura K., Shen F., Somerville M.J., Tchinda J., Valsesia A., Woodwark C., Yang F., Zhang J., Zerjal T., Zhang J., Armengol L., Conrad D.F., Estivill X., Tyler-Smith C., Carter N.P., Aburatani H., Lee C., Jones K.W., Scherer S.W., Hurles M.E. Global variation in copy number in the human genome. Nature. 2006, vol. 444 (7118), pp. 444-454.
9. Günther T., Schneider-Stock R., Häckel C., Kasper H.U., Pross M., Hackelsberger A., Lippert H., Roessner A. Mdm2 gene amplification in gastric cancer correlation with expression of Mdm2 protein and p53 alterations. A. Mod. Pathol. 2000, vol. 13 (6), pp. 621-626.
10. Kozlov V.A. Svobodnaya vnekletochnaya DNK v norme i pri patologii [Free extracellular DNA is normal and pathological]. Med. immunologiya. 2013, vol. 15, No. 5, pp. 399-412.
11. Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E. Tsirkuliruyushchie NK v krovi bol'nykh rakom zheludka i tolstoi kishki [Circulating NK in the blood of patients with stomach and colon cancer]. Klin. issledovaniya. 2005, vol. 51, iss. 3, pp. 321-328.
12. Scatena R. Mitochondria and cancer: a growing role in apoptosis, cancer cell metabolism and dedifferentiation. Adv. Exp. Med. Biol. 2012, vol. 942, pp. 287-308.
NATURAL SCIENCE. 2017. No. 3-2
13. Zhao M., Zhao Z. Concordance of copy number loss and down-regulation of tumor suppressor genes: a pan-cancer study. BMC Genomics. 2016, vol. 17, No. 7, p. 532. DOI 10.1186/s12864-016-2904-y.
14. Fan C., Wang X. Mdm2 Splice isoforms regulate the p53/Mdm2/Mdm4 regulatory circuit via RING domain-mediated ubiquitination of p53 and Mdm4. Cell. Cycle. 2017, vol. 16 (7), pp. 660-664. DOI 10.1080/15384101.2017.1288327.
15. Husain H., Nykin D., Bui N., Quan D., Gomez G., Woodward B., Venkatapathy S., Duttagupta R., Fung E., Lippman S.M., Kurzrock R. Cell-Free DNA from Ascites and Pleural Effusions: Molecular Insights into Genomic Aberrations and Disease Biology. Mol. Cancer. Ther. 2017, vol. 16 (5), pp. 948-955. DOI 10.1158/1535-7163. MCT-16-0436.
16. Pfarr N., Penzel R., Klauschen F., Heim D., Brandt R., Kazdal D., Jesinghaus M., Herpel E., Schirmacher P., Warth A., Weichert W., Endris V., Stenzinger A. Copy number changes of clinically actionable genes in melanoma, non-small cell lung cancer and colorectal cancer-A survey across 822 routine diagnostic cases. Genes Chromosomes Cancer. 2016, vol. 55 (11), pp. 821-833. DOI 10.1002/gcc.22378.
17. Gladek I., Ferdin J., Horvat S., Calin G.A., Kunej T. HIF1A gene polymorphisms and human diseases: Graphical review of 97 association studies. Genes Chromosomes Cancer. 2017, vol. 56 (6), pp. 439-452. DOI 10.1002/ gcc.22449.
Поступила в редакцию /Received_5 июня 2017 г. / June 5, 2017
