CC BY
45
РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ РАБОТ
УДК 577.214;577.218
Т. В. Никитина, Л. Гао, К. Е. Карпачева, Л. И. Тищенко
ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ тРНК И АШ-ПОВТОРОВ МОЛОДЫХ СУБСЕМЕЙСТВ Ya5 И Yb8, ТРАНСКРИБИРУЕМЫХ РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ III, В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА U937 ПРИ АПОПТОЗЕ, ИНДУЦИРОВАННОМ КАМПТОТЕЦИНОМ
Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра биохимии биолого-почвенного факультета
Гены малых нетранслируемых РНК, транскрибируемые РНК-полимеразой III (гены класса III), составляют значительную часть генома млекопитающих. Долгое время считалось, что гены класса III, к которым принадлежат гены 5S рРНК, тРНК, U6 мяРНК, 7SL РНК и некоторые другие, транскрибируются подобно генам «домашнего хозяйства», т. е. конститутивно и с постоянной скоростью, и нет необходимости в сложной регуляции этого процесса. Позже были получены многочисленные данные, свидетельствующие, что в клетке существуют сложные механизмы регуляции транскрипции генов 5S рРНК и тРНК в соответствии со стадией клеточного цикла, скоростью роста и пролиферации клетки. Существуют также сложные механизмы координации синтеза различных рРНК и тРНК [4, 18]. Однако при исследовании экспрессии генов класса III в качестве объекта в основном использовали гены, кодирующие 5S рРНК и тРНК, участвующие в процессе трансляции, не рассматривая другие гены, также транскрибируемые РНК-полимеразой III, например, гены коротких диспергированных повторов SINE, гены РНК-компонентов РНКаз P и MRP, 7SL РНК, 7SK РНК, BC1 и BC200 РНК, Y РНК, Vault РНК, некоторых малых ядрышковых РНК и микроРНК [15]. В результате, согласно предложенным рядом авторов моделям, регуляция экспрессии всех генов, транскрибируемых РНК-полимеразой III, в ответ на изменение скорости роста и/или деления клетки происходит скоординированно [18, 29]. Однако в последние годы выяснилось, что регуляция транскрипции генов 5S рРНК и тРНК и генов, отличных от них, может существенно различаться. Эти данные, по-видимому, могут свидетельствовать о существовании в клетке ген-специфичных и тканеспецифичных механизмов регуляции экспрессии генов класса III [15, 29]. Также появились данные, свидетельствующие о том, что продукты мобильных диспергированных повторов и ряда других генов, транскрибируемых РНК-полимеразой III (малые нетранслируемые РНК) могут выполнять в клетке разнообразные функции [22].
Среди генов, транскрибируемых РНК-полимеразой III, особый интерес представляют Л/м-последовательности (представители класса SINE-повторов у человека), функция
© Т. В. Никитина, Л. Гао, К. Е. Карпачева, Л. И. Тищенко, 2009
которых изучена недостаточно. Так, известно, что Alu-повторы составляют значительную часть генома человека (около 10 % всего генома), и их количество достигает 1,1 млн [19]. Alu-повторы распространяются по геному с помощью механизма ретротранспозиции. Было показано, что ретротранспозиция Alu может приводить к опухолевой трансформации клеток и некоторым генетическим заболеваниям: гемофилии В, нейрофиброматозу, синдрому Аперта и др. [24]. С другой стороны, известно, что Alu-повторы могут выполнять функции энхансеров, инсуляторов, участков альтернативного сплайсинга и другие функции, дающие клетке преимущества, что и объясняет их распространение по геному человека. В настоящее время есть основание полагать, что Alu-последовательности и их РНК-продукты могут играть роль не только в активации пролиферации, опухолевой трансформации, стрессе и ряде других процессов, но и в программируемой клеточной гибели — апоптозе [6]. Однако роль Alu-последовательностей и их РНК-транскриптов при апоптозе клеток до сих пор не выяснена.
Поэтому цель настоящей работы — оценка взаимосвязи между различным уровнем экспрессии различных генов класса III — инициаторной тРНК1Ме‘, тРНКНв и представителей молодых субсемейств Alu (AluYa5 и AluYb8) и физиологическим статусом клетки (стадии: покоя G0, пролиферации и апоптоза).
Материалы и методы исследования. Клетки гистиоцитарной лимфомы человека U937 [32], находящиеся в фазе G0 клеточного цикла после 48 ч бессывороточного голодания [12], приобретали в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки U937 при плотности 1 млн клеток/мл культивировали в среде RPMI-1640 с 10 %-ной сывороткой эмбрионов крупного рогатого скота (FBS) и гентамицином (40 мкг/мл) при 37 °С в течение 2 ч [12], затем делили на две порции: в одну (эксперимент) для индукции апоптоза добавляли камптотецин до конечной концентрации 4 мкг/мл [9], а вторую (контроль) продолжали культивировать в тех же условиях. Аликвоты суспензии клеток для анализа отбирали после 48 ч бессывороточного голодания, после 2 ч культивирования с сывороткой FBS, а также через 2, 4, 6 и 24 ч после добавления камптотецина. Апоптоз клеток U937, индуцированный камптотецином, детектировали по увеличению количества фрагментированной геномной ДНК в цитоплазматической фракции клеток [23].
Анализ содержания специфичных РНК в тотальной РНК клеток U937 проводили методами ОТ-ПЦР «в конечной точке» и «в реальном времени». Тотальную РНК выделяли из клеток U937 с использованием набора AquaPure RNA (Bio-Rad, США). Синтез кДНК на матрице тотальной РНК осуществляли с помощью набора RevertAid™ Н Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва) и статистического набора гексамерных праймеров. Полученную кДНК использовали в качестве матрицы при проведении ПЦР « в конечной точке» или «в реальном времени» с использованием специфичных праймеров к инициаторной тРНЮМЙ1: 5'-AGC AGA GTG GCG CAG C-3' (прямой) и 5'-TAG CAG AGG ATG GTT TAG ATC CA-3' (обратный); тРНКН- 5'-GCC GTG ATC GTA TAG TGG TT-3 ' (прямой) и 5 '-ATT CGA ACC GAG GTT GCT-3 ' (обратный) [28], к РНК-продуктам повторов AluYa5: 5'-GGT CAG GAG ATC GAG ACC AT-3' (прямой), 5'-ACG GAG TCT CGC TCT GTC G-3 ' (обратный) и AluYb8: 5 '-GTC AGG AGA TCG AGA CCA TCC TGG CTAACA A-3 ' (прямой), 5 '-TCT GTC GCC CAG GCC GGA-3 ' ( обратный). Последовательности повторов AluYa5 и AluYb8 для подбора праймеров брали из базы данных Repbase (http://www. girinst. org/repbase/index. html). Подбор праймеров осуществляли с помощью программы Primer3 (http://frodo. wi. mit. edu/primer3/input. htm). Проба для ПЦР объемом 25 мкл содержала: 15 мМ трис-HCl, pH8,8, по 250 нМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифос-фата, 2,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, 0,05 %-ный глицерин, 0,01 % Tween 20, интеркалирующий
краситель SYBR Green I (Синтол), 1,25 E Taq-полимеразы (Синтол), по 300 нМ прямого и обратного праймеров для последовательностей тРНК или по 150 нМ прямого и обратного праймеров для Alu-последовательностей, 80 нг кДНК-матрицы для последовательностей тРНК или 200 нг кДНК-матрицы для Alu-последовательностей. ПЦР «в конечной точке» проводили на приборе «Терцик» (ДНК-Технология). Программа амплификации: 95 °С — 5 мин; 32 цикла: 60 °С — 1 мин, 95 °С — 15 с; 60 °С — 5 мин. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 2 %-ном агарозном геле на буфере SB (10 мМ NaOH, до pH8,5 подводят кристаллической борной кислотой). ПЦР « в реальном времени» проводили на установке MiniOpticon real-time PCR detection system (Bio-Rad, США). Программа амплификации: 95 °С — 5 мин; 45 циклов: 62 °С (для тРНК и мРНК RPLP0) или 63 °С (для Alu) — 1 мин, 95 °С — 15 с. Измерение флуоресценции проводили при 75 °С (для тРНК и мРНК RPLP0) или 84 °С (для Alu). Кривые плавления продуктов ПЦР снимали в интервалах температур 55-90 °С (для тРНК и мРНК RPLP0) или 65-98 °С (для Alu). Полученные данные анализировали с помощью программ Opticon Monitor 3, версия 3.1.32 (Bio-Rad, США) и Microsoft Excel 2003. Соотношение (r) уровней содержания исследуемой РНК (target) в контроле (клетки без обработки камптотецином) и в эксперименте (клетки,
ГГ \ Л. ТЛГ ta8et — ЛГreference О
обработанные камптотецином) вычисляли по формуле: r = 2ЛС ЛС , где 2 — это эффективность амплификации, ACt — разница значений порогового цикла Ct в контроле и в эксперименте, target — исследуемая последовательность, reference — внутренний контроль. В качестве внутреннего контроля (reference) для нормирования использовали содержание мРНК белка RPLP0 (acidic ribosomal, large, P0) [2, 28].
Анализ метилирования повторов AluYb8 в геноме клеток U937 осуществляли методом MethyLight [1, 17]. Геномную ДНК из клеток U937 выделяли с использованием набора ZR Genomic DNA II Kit™ (Zymo Research, США), а затем 1 мкг ДНК из каждой пробы обрабатывали бисульфитом натрия и очищали с помощью набора EZ DNA Methylation-Gold™ Kit (Zymo Research, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Условия проведения бисульфитной обработки: 98 °С — 10 мин; 53 °С — 30 мин; 8 циклов: 53 °С — 6 мин, 37 °С — 30 мин. Количественное определение содержания метилированных и неметилированных последовательностей AluYb8 проводили методом ПЦР «в реальном времени» на установке MiniOpticon real-time PCR detection system (Bio-Rad, США) с использованием специфичных праймеров к AluYb8-повтору после бисульфитной обработки (рис. 1) —1) к метилированной последовательности: 5'-GTG GAT TAT GAG GTT AGG AGA TCG-3' (прямой) и 5'-CCG AAC TAC GAA CTA CAA -TAA CGC-3 ' (обратный) и 2) к неметилированной последовательности: 5'-GTG GAT TAT GAG GTT AGG AGA TTG-3 ' (прямой) и 5 '-CAA ACC AAA CTA CAA ACT ACA ATA ACA C-3 ' (обратный). Программа амплификации: 95 °С — 5 мин; 40 циклов: 95 °С — 10 с, 60 °С — 20 с, 72 °С — 10 с. Измерение флуоресценции проводили при 72 °С. Кривые плавления продуктов ПЦР снимали в интервале температур 65-99 °С. Соотношение (r) метилированных и неметилированных последовательностей AluYb8 вычисляли по формуле: r = 2(CtU - CtM), где 2 — это эффективность амплификации, Ct — пороговый цикл для пробы с праймерами к неметилированной последовательности (CtU) или для пробы с праймерами к метилированной последовательности (CtM).
Результаты исследования и их обсуждение. Для исследования изменения содержания нетранслируемых РНК-продуктов транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой III, при различных физиологических состояниях клетки использовали в качестве модели культуру клеток гистиоцитарной лимфомы человека U937, находящихся в состоянии покоя, пролиферации или апоптоза. Перевод клеток U937 в состояние покоя ( фаза G0 клеточного цикла)
a MODIFIED FORWARD STRAND (UNMETHYLATED) :
ggtTGggTGT GgtggtttaT Gtttgtaatt ttagtatttt gggaggtTGa qgTGggtqga ttatgaggtt agqaqatTGa gattattttg gttaataagg tgaaatttTG tttttattaa aaatataaaa aattagtTGg gTGTGgtggT GggTGtttgt agttttagtt attTGggagg ttgaggtagg agaatggTGt gaattTGgga agTGgagttt gtagtgagtT GaqattqTGt tattgtaqtt TGtagttTGg tttgggTGat agagTGagat ttTGtttta
б MODIFIED FORWARD STRAND (METHYLATED) :
ggtCGggCGC GgtggtttaC Gtttgtaatt ttagtatttt gggaggtCGa qqCGqqtqqa ttatgaggtt aqqaqatCGa gattattttg gttaataagg tgaaatttCG tttttattaa aaatataaaa aattagtCGg gCGCGgtggC GggCGtttgt agttttagtt attCGggagg ttgaggtagg agaatggCGt gaattCGgga agCGgagttt gtagtgagtC GagattgCGt tattgtaqtt CGtaqttCGq tttqqgCGat agagCGagat ttCGtttta
Рис. 1. Последовательность повтора AluYb8 после бисульфитной обработки: полностью неметилиро-
ванная (а) и полностью метилированная (б)
Жирным шрифтом выделены сайты CpG и TpG. Подчеркнуты последовательности, соответствующие прямому и обратному праймерам для каждой последовательности.
проводили культивированием клеток U937 в отсутствии сыворотки в течение 48 ч; это также позволило синхронизировать клетки [12]. Через 2 ч после добавления в культуру покоящихся клеток 10 %-ной сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (FBS) большая часть клеток достигала поздней фазы G1 клеточного цикла [12]. Индукцию апоптоза проводили при помощи обработки клеток U937 ингибитором ДНК-топоизомеразы I — кам-птотецином — в концентрации 4 мкг/мл [9]. Апоптоз, вызванный камптотецином, был детектирован по появлению в цитоплазматической фракции клеток U937 высокомолекулярных фрагментов ДНК (от 750 до 10000 п. н.), что является характерным признаком для клеток этой линии [9].
Исследование содержания инициаторной тРНК1Ме‘1 и тРНКНк в тотальной РНК клеток U937, находящихся в состоянии покоя, пролиферации и апоптоза, индуцированного камптотецином, методом ОТ-ПЦР «в конечной точке» показало, что: (1) содержание инициаторной тРНКлМе‘1 повышалось примерно в 1,5 раза в апоптотических клетках (рис. 2, а, дорожки 7 и 9), по сравнению с контрольными клетками, культивируемыми без добавления камптотецина (рис. 2, а, дорожки 6 и 8); (2) содержание тРНКНк было примерно одинаково при всех исследованных состояниях клеток: бессывороточное голодание (рис. 2, б, дорожка 2), пролиферация (рис. 2, б, дорожки 3, 4, 6 и 8) и апоптоз (рис. 2, б, дорожки 5, 7 и 9). Похожие результаты были получены методом количественной ОТ-ПЦР «в реальном времени» (рис. 3, а — для тРНК1Ме‘1 и б — тРНКНк).
Ранее нами были получены данные о повышенном содержании инициаторной тРНК1Ме‘1 в тотальной РНК клеток эпидермоидной карциномы человека А431 при апоп-тозе, индуцированном ЭФР в высокой концентрации (100 нг/мл) [28]. Предполагаем, что повышенное содержание инициаторной тРНК (по сравнению с примерно постоянным содержанием тРНК, участвующих в элонгации, например, тРНКНк) необходимо клеткам, переходящим в состояние апоптоза, для того, чтобы они могли быстро начать синтез белков, участвующих в реализации программы клеточной гибели, которые не синтезируются в пролиферирующих клетках. Это предположение согласуется с показанным недавно фактом, что на скорость биосинтеза белка (трансляции) в наибольшей степени влияет доступность
12З45б789 10
12 З45б7 89 10
250 п. и .
!
250 п. н.,
I п. н. чч 59 п. н.-|
Рис. 2. Электрофореграмма разделения продуктов ПЦР «в конечной точке» в 2 %-ном агарозном геле а — амплификация с использованием нраймеров к тРИК^Ыс^ б — амплификация с использованием нраймеров к тРНКHis. 1 — маркер длин фрагментов DNA Ladder 1 kb (Fermentas); 2 — клетки носле 48 ч бессывороточного голодания; З — клетки после 2 ч с 10 % FBS; 4 — клетки после 4 ч с 10 % FBS; 5 — клетки после 2 ч с камптоте-цином (4 мкг/мл); б — клетки после б ч с 10 % FBS; 7 — клетки после 4 ч с камптотецином (4 мкг/мл); 8 — клетки носле 8 ч с 10 % FBS; 9 — клетки носле б ч с камптотецином (4 мкг/мл); 10 — контроль: нроба без кДНК. Во все пробы брали одинаковое количество кДНК. Внизу приведены денситограммы гелей (получены с помощью программы ScionImage for Windows). На рисунке представлены репрезентативные результаты одного из трех повторных экспериментов.
Время G0 G1 2 ч 4 ч б ч Время G0 G1 2 ч 4 ч б ч
САМ - - - + - + - + CAM - - - + - + - +
Рис. 3. Содержание тРНК1МЙ1 (а) и тРНКН15 (б) в тотальной РНК клеток и937, находящихся в состоянии покоя, пролиферации и в апоптозе Заштрихованные столбцы соответствуют пробам без камптотецина, незаштрихованные — пробам с камптотецином. Стадия клеточного цикла и время инкубации после добавления камптотецина указаны под каждым столбцом; г — соотношение содержания исследуемой РНК в экспериментальной пробе и в контроле (клетках после культивирования с 10% РБ8 в течение 2 ч); для каждого столбца указано стандартное отклонение. Для обозначенных * пар
столбцов уровень значимостир < 0,05.
5З
специфичных тРНК, а не количество мРНК, как считалось ранее [10]. Очевидно, что наличие в апоптотической клетке большого количества инициаторной тРНК (необходимой для начала синтеза любого белка) позволит быстро и эффективно (с участием большого числа рибосом) осуществлять синтез тех белков, которые не синтезировались в клетке до поступления проапоптотического сигнала.
На следующем этапе работы были изучены изменения содержания продуктов экспрессии Alu-повторов, принадлежащих к самым молодым субсемействам — AluYa5 и AluYb8, в клетках U937 при переходе к апоптозу. Это было необходимо для проверки гипотезы о том, что короткие диспергированные повторы SINE, к которым относятся Л/м-повторы человека, и их РНК-продукты могут играть определенную роль в реакции клетки на сильные цитотоксические повреждения и, возможно, обеспечивать реализацию апоптозного пути. В качестве объекта исследования были выбраны субсемейства AluYa5 и AluYb8, так как они являются наиболее многочисленными представителями молодого семейства AluY в геноме человека, сохраняют функциональный внутригенный промотор для РНК-полимеразы III и, как полагают, могут быть транскрипционно активными и распространяться по геному путем ретротранспозиции, используя ферментативный аппарат последовательностей L1 (представителей длинных диспергированных повторов LINE у человека) [31].
Методом количественной ОТ-ПЦР «в реальном времени» было показано, что содержание как Л1иУа5-РНК (рис. 4, а), так и Л1иУЬ8-РНК (рис. 4, б) значительно возрастало (в 4-10 раз) в апоптотических клетках U937, по сравнению с пролиферирующими клетками. Анализ кривых плавления продуктов ПЦР, полученных амплификацией с праймерами
Время G0 G1 2 ч 4 ч 6 ч 24 Время G0 G1 2 ч 4 ч 6 ч 24
САМ - - - + - + - + - + CAM - - - + - + - + - +
Рис. 4. Содержание Л1иУа5-РНК (а) и Л1иУ68-РНК (б) в тотальной РНК клеток и937, находящихся в состоянии покоя, пролиферации и в апоптозе Пояснения см. в подписи к рис. 3.
65 70 75 80 85 90 95
Рис. 5. Кривые плавления продуктов амплификации кДНК, полученных методом ПЦР в присутствии специфичных праймеров для последовательности AluYa5 (а) и AluYb8 (б)
По оси абсцисс указана температура (°С), по оси ординат — отрицательная величина скорости изменения
флуоресценции SYBR Green I в пробе.
к последовательности AluYa5, показал присутствие целого ряда слившихся друг с другом пиков (рис. 5, а). Это объясняется тем, что для амплификации использовались праймеры, подобранные к консервативным участкам последовательности AluYa5, которые также присутствуют в других последовательностях, принадлежащих к различным субсемействам молодого семейства AluY (например, AluYb8, AluYb9, AluY, AluYcl, AluYg6, AluYa4, AluYa8). Поэтому продукты ПЦР в реальном времени в этом случае являются гетерогенными и представлены ДНК-копиями, соответствующими фрагментам различных Alu-повторов и имеющими разные температуры плавления, но одинаковые размеры (что было подтверждено электрофоретическим разделением продуктов ПЦР в агарозном геле). Очевидно, что представленные на рис. 4, а данные относятся не только к AluYa5-PHK, но и к РНК других перечисленных субсемейств. Для амплификации AluYb8-^HK использовались праймеры, комплементарные уникальным участкам этой последовательности, которые присутствуют также у AluYb9 (которая отличается от AluYb8 лишь одной нуклеотидной заменой и распространена в геноме человека в значительно меньшей степени) и отсутствуют у последовательностей, принадлежащих к другим субсемействам AluY. Поэтому в этом случае продукт ПЦР был представлен однородными последовательностями AluYb8/9 с одинаковой температурой плавления, при денатурации которых на кривой плавления присутствовал один четкий пик (рис. 5, б). Таким образом, наши данные свидетельствуют, что в апопто-тических клетках U937 существенно повышается содержание Alu-РНК, синтезируемых с Alu-повторов, принадлежащих к целому ряду молодых субсемейств.
В настоящее время имеются данные, свидетельствующие, что при различных повреждающих воздействиях на клетку в ней повышается содержание SINE-транскриптов, что сопровождается либо восстановлением клетки, либо ее гибелью (апоптозом) [26]. Существует ряд предположений о возможной роли Alu-РНК, B1- и В2-РНК в обеспечении
восстановления клетки после стресса [29]. Однако роль SINE-транскриптов при апоптозе клеток до сих пор не выяснена. Имеющиеся в настоящее время сведения позволяют выдвинуть несколько рабочих гипотез о роли SINE и SINE-транскриптов при программируемой клеточной гибели [3]. Одним из возможных механизмов действия SINE как проапоптозных агентов может быть их активная ретротранспозиция, приводящая к встраиванию этих последовательностей в новые области генома и, в результате, к нарушению нормальной экспрессии генов, генотоксическому стрессу и, как следствие, к запуску апоптозных путей [7, 8, 13, 20].
Другой возможный механизм действия SINE-продуктов при реализации апоптотиче-ского пути — регуляция трансляции. Известно, что как при ответе клетки на стрессорные воздействия, так и при переходе к апоптозу, наблюдается подавление тотального белкового синтеза. С другой стороны, в обоих случаях для реализации сигнальных путей, приводящих к восстановлению клетки или ее гибели, необходим синтез de novo специфичных белков (например, белков теплового шока или каспаз). Выдвинуто предположение, что в специфичной регуляции аппарата трансляции, обеспечивающей подавление тотального синтеза белка и осуществление синтеза специфических белков, могут участвовать SINE-РНК, уровень которых в клетке возрастает при повреждающих воздействиях. В пользу этого предположения говорит тот факт, что все известные SINE произошли от генов РНК, участвующих в трансляции и способных взаимодействовать с рибосомами и другими участниками белкового синтеза: гена либо тРНК, либо 7SL РНК (РНК-компонента SRP-частицы (signal recognition particle), участвующей в транспорте синтезируемых рибосомой белков к шероховатому эндоплазматическому ретикулуму, шЭПР). Недавно показано, что Alu-РНК в комплексе с белками SRP9/14 ингибирует инициацию трансляции in vitro мРНК репортерных генов циклина, препролактина, люциферазы и PAI-2, а Alu-РНК в отсутствие SRP-белков активирует инициацию трансляции в этой же системе [21]. Можно предположить, что РНП-частица, содержащая белки SRP9/14 и Alu-РНК, способна связываться с рибосомой и останавливать трансляцию независимо от присутствия в новосинтезированном белке специфичных сигнальных последовательностей локализации в шЭПР. Кроме того, известно, что Alu-РНК содержат достаточно протяженные полиА-последовательности, с которыми может связываться белок PABP. В этом случае Alu-РНК могут подавлять трансляцию, конкурируя с мРНК за связывание PABP [14]. Механизм активации трансляции Alu-РНК, не связанной с SRP-белками, пока не ясен [21].
Еще один механизм регуляции трансляции с участием Alu-РНК и протеинкиназы PKR, регулируемой двухцепочечными РНК, был предложен для клеток в состоянии стресса [11]. Однако, как уже говорилось, тот же механизм может действовать и в случае индукции апоптоза, тем более что PKR относится к проапототическим белкам [34]. Показано, что Alu-РНК связывается с протеинкиназой PKR и ингибирует ее киназную активность in vivo в трансфицированных клетках человека 293 и in vitro [11]. Позже было выявлено, что действие Alu-РНК на PKR имеет более сложный характер и зависит от концентрации РНК: при соотношении 0,02-2,0 пмоль димерной Alu-РНК на 2 пмоль PKR киназная активность повышалась, а при соотношении 100 и более пмоль Alu-РНК на 2 пмоль PKR — понижалась [34]. Можно предположить, что в условиях, когда в клетке повышается содержание Alu-РНК, они могут стать важными РНК-регуляторами киназы PKR.
Недавно показано, что при сверхэкспрессии гена PKR дикого типа в клетках мыши NIH3T3, эта протеинкиназа участвует в реализации пути «отложенной» клеточной смерти, последовательно активируя в клетке две «конфликтующие» программы: сначала программу
выживания клетки через сигнальный путь NF-кВ, а затем — программу апоптоза через фосфорилирование фактора инициации трансляции eIF-2a. При этом первая программа не зависит от киназной активности PKR и, следовательно, не требует присутствия двухцепочечных РНК, а вторая — требует активации PKR двухцепочечными РНК [16]. Можно предположить, что в развитии ответа клетки на повреждающие агенты постепенно накапливающиеся SINE-РНК могут играть роль временных ограничителей сигналов, активируемых киназой PKR. Сразу после повреждающего воздействия, пока концентрация SINE-РНК в клетке еще очень низка, PKR запускает программу выживания клетки через сигнальный путь NF-кВ. Затем, когда концентрация SINE-РНК достигнет уровня, достаточного для активации киназной активности PKR, киназа активирует апоптозный путь, а по достижении высокой концентрации SINE-РНК ферментативная активность PKR подавляется, так как дальнейшее развитие активированных сигнальных путей не требует участия этой протеинкиназы. Так как известно, что накопление SINE-РНК в клетках также носит временный характер [26], их ингибиторное действие на киназную активность PKR также ограничено во времени.
Накапливающиеся в клетке после повреждающих воздействий SINE-РНК могут влиять не только на синтез тотального белка в клетке, но и специфично временно активировать трансляцию вновь синтезированных мРНК, используя пока не выявленный механизм, независимый от PKR [30]. Очевидно, что этот механизм позволяет клетке временно переключиться на синтез белков, необходимых в новых условиях для ее восстановления (например, белков теплового шока) или запуска апоптоза (например, каспаз). Эта регуляция, по-видимому, неспецифична к каким-то определенным мРНК, и синтез того или иного белка будет зависеть от того, синтез каких именно мРНК будет индуцирован в подобных условиях. Данный механизм специфичной активации вновь синтезированных мРНК был показан и для клеток мыши, где его активировали В1- и В2-РНК [30].
И наконец Alu-РНК могут способствовать переходу клетки к апоптозу, активируя внутриклеточные системы неспецифического иммунитета, аналогично действию экзогенных вирусных РНК. Так, недавно показано, что одна из систем врожденного антивирусного ответа — система интерферона в, — может быть активирована в клетке не только вирусной РНК, но и собственными клеточными РНК [27]. Полагаем, что в качестве такого РНК-активатора может выступать Alu-РНК, содержание которой в клетке повышается при заражении вирусом или стрессорном воздействии. Активация же системы интерферона в может приводить к апоптозу клетки через сигнальный каскад Jak-Stat.
Известно, что в пролиферирующих клетках содержание Alu-РНК очень низкое, в отличие от некоторых других РНК-продуктов генов класса III, прежде всего — тРНК и 5S рРНК [18, 19]. С другой стороны, показано, что в апоптотических клетках содержание тРНК (кроме инициаторной тРНК) снижается, а согласно нашим данным, количество Alu-РНК значительно повышается. Невыясненным остается механизм, позволяющий клетке одновременно снижать синтез тРНК и повышать синтез Alu-РНК, при том, что гены обеих этих групп РНК имеют одинаковые промоторы. Одним из возможных механизмов является изменение метилирования последовательностей генов [25, 33]. Для проверки этой гипотезы исследовали метилирование AluYb8-повторов методом MethyLight. Было показано, что доля последовательностей AluYb8, метилированных в областях, комплементарных праймерам, составляла 92±6 %, а неметилированных —7±5 %. Эти показатели не зависят от физиологического состояния клеток (рис. 6). Таким образом, повышение экспрессии Alu-повторов не сопровождается снижением уровня метилирования их последовательности. Следует отметить, что метод MethyLight позволяет исследовать метилирование
лишь части СрО-сайтов Л/м-повтора, а именно — СрО-сайтов, расположенных в участках, комплементарных используемым для ПЦР праймерам (см. рис. 1). Кроме того, в данной работе были исследованы участки Л/м-повторов, не включающие в себя промотор. Можно предположить, что влияние на транскрипцию будет оказывать метилирование именно СрО-сайтов, входящих в состав промотора, так как именно с промотором связываются базальные транскрипционные факторы ТБШБ и ТБШС, которые затем привлекают в транскрипционный комплекс РНК-полимеразу III. Более того, недавно полученные данные свидетельствуют, что на транскрипцию генов класса III с внутригенным промотором (а именно — гена БББЯ-1 вируса Эпштейна-Барра) существенное влияние оказывает метилирование СрО-сайтов, расположенных не внутри гена, а в 5 '-фланкирующей области [5]. Можно предположить, что и в случае Л/м-повторов достаточно высокий уровень метилирования, показанный в настоящей работе, не препятствует экспрессии тех копий Л/мУЪ8, которые имеют гипометилированные 5 '-фланкирующий области.
Таким образом, в данной работе показано, что при переходе клетки к апоп-тозу в ней повышается содержание некоторых РНК-продуктов транскрипции РНК-полимерзы III — инициаторной тРНК1Ме‘1 и А1и-РНК, синтезируемых с Л/м-повторов
□ Неметилированные И Метилированные
100
Время 00 01 2 ч 4 ч 6 ч 24ч
САМ - - - + - + - + - +
Рис. 6. Содержание метилированных и неметилированных последовательностейЛ/иУЪ8 в геномной ДНК клеток и937, находящихся в состоянии покоя, пролиферации и в апоптозе Стадия клеточного цикла и время инкубации после добавления камптотецина указаны под каждым столбцом.
молодых субсемейств. Можно полагать, что данное изменение необходимо для реализации клеткой апоптотического пути, и что названные РНК-продукты, синтезируемые РНК-полимеразой III, могут играть важную роль в изменении физиологического статуса клетки, используя различные механизмы: активация синтеза de novo проапоптотических белков (тРНКлМе‘), нарушение структуры геномной ДНК при активации ретротранспозиции Alu, регуляция трансляции мРНК путем взаимодействия Alu-РНК с рибосомами и протеинки-назой PKR, активация внутриклеточных систем неспецифического иммунитета под действием Alu-РНК. Однако все приведенные гипотезы требуют проведения дополнительных исследований с целью тщательной проверки. Также представляется важным дальнейшее изучение механизмов регуляции транскрипции генов инициаторной тРНЮМе‘1 и Alu-повторов, так как имеющиеся данные свидетельствуют, что уровень экспрессии различных генов, транскрибируемых РНК-полимеразой III, различается в апоптотических клетках: он может как повышаться (в случае генов инициаторной тРНК1Ме‘1 и Alu-повторов), так и снижаться ( гены тРНК, участвующих в элонгации трансляции, гены 5S рРНК). Поэтому представляется необходимым выявить те факторы, которые определяют указанные различия в транскрипции каждой конкретной группы генов класса III. Наиболее перспективным нам кажется изучение уровня метилирования ДНК и доступности для связывания транскрипционных факторов промоторных и 5 '-фланкирующих участков Alu-повторов, принадлежащих к молодым субсемействам, а также выявление специфичных белковых факторов, которые могут участвовать в регуляции транскрипции Alu-последовательностей в апоптотической клетке.
Литература
1. Москалев Е. А., Епринцев А. Т., Hoheisel J. D. Методы определения картины метилирования геномной ДНК при канцерогенезе: от тодельных нуклеотидов к метилому // Молекулярная биология. 2007. Т. 41. № 5. С. 793-807.
2. Никитина Т. В., Назарова Н. Ю., Тищенко Л. И., Туохимаа П., Седова В. М. Использование
метода RT-PCR в реальном времени для изучения уровня экспрессии малых стабильных РНК в клетках эпидермоидной карциномы человека А431 // Цитология. 2003. Т. 45. №4. С. 392-402.
3. Никитина Т. В., Тищенко Л. И. Роль экспрессии мобильных элементов класса SINE и генов, транскрибируемых РНК-полимеразой III, в регуляции внутриклеточных процессов (обзор) // Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 4. С. 547-558.
4. Никитина Т. В., Тищенко Л. И. Транскрипционная машина РНК-полимеразы III: строение и регуляция транскрипции (обзор) // Молекулярная биология. 2005. Т. 39. № 2. С. 179-192.
5. Banati F., Koroknai A., Salamon D., Takacs M., Minarovits-Kormuta S., Wolf H., Niller H. H., Min-arovits J. CpG-methylation silences the activity of the RNA polymerase III transcribed EBER-1 promoter of Epstein-Barr virus // FEBS Lett. 2008. Vol. 582. P. 705-709.
6. Beere H. M. Death versus survival: functional interaction between the apoptotic and stress-inducible heat shock protein pathways // J. Clin. Invest. 2005. Vol. 115. P. 2633-2639.
7. Belgnaoui S. M., Gosden R. G., Semmes O. J., HaoudiA.. Human LINE-1 etrotransposition induces DNA damage and apoptosis in cancer cells // Cancer Cell Int. 2006. Vol. 6. P. 13.
8. BennettE. A., Coleman L. E., Tsui C., Pittard W. S., Devine S. E. Natural genetic variation caused by transposable elements in humans // Genetics. 2004. Vol. 168. P. 933-951.
9. Bicknell G. R., Snowden R. T., Cohen G. M. Formation of high molecular mass DNA fragments is a marker of apoptosis in the human leukaemic cell line, U937 // J. Cell Science. 1994. Vol. 107. P. 2483-2489.
10. Brockmann R., Beyer A., Heinisch J. J., Wilhelm T. Posttranscriptional expression regulation: what determines translation rates? // PLoS Comput Biol. 2007 Vol. 3. P. e57.
11. Chu W.-M., BallarrdR., CarpickB. W., WilliamsB. R. G., SchmidC. W. PotentialAlu function: regulation of the activity of double-stranded RNA-activated kinase PKR // Mol. Cel. Biol. 1998. Vol. 18. P. 58-68.
12. Dasgupta P., Sun J., Wang S., Fusaro G., Betts V., Padmanabhan J., Sebti S. M., Chellappan S. P. Disruption of the Rb-Raf-1 interaction inhibits tumor growth and angiogenesis // Mol. Cell. Biol. 2004. Vol. 24. P. 9527-9541.
13. DewannieuxM., Heidmann T. Ll-mediated retrotransposition of murine B1 and B2 SINEs recapitulated in cultured cells // J. Mol. Biol. 2005. Vol. 349. P. 241-247.
14. Dewannieux M., Heidmann T. Role of poly(A) tail length in Alu retrotransposition // Genomics. 2005. Vol. 86. P. 378-381.
15. Dieci G., Fiorino G., Castelnuovo M., Teichmann M., Pagano A. The expanding RNA polymerase
III transcriptome // Trends Genet. 2007. Vol. 23. P. 614-622.
16. Donze O., Deng J., Curran J., Sladek R., Picard D., Sonenberg N. The protein kinase PKR: a molecular clock that sequentially activates survival and death programs // EMBO J. 2004. Vol. 23. P. 1-8.
17. Eads C. A., Danenberg K. D., Kawakami K., Saltz L. B., Blake C., Shibata D., Danenberg P. V., Laird P. W. MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation // Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28. P. E32.
18. Goodfellow S. J., White R. J. Regulation of RNA Polymerase III Transcription During Mammalian Cell Growth // Cell Cycle. 2007. Vol. 3. P. 2323-2326.
19. Grover D., Kannan K., Brahmachari S. K., Mukerji M. ALU-ring elements in the primate genomes // Genetica. 2005. Vol. 124. P 273-289.
20. Haoudi A., Semmes O. J., Mason J. M., Cannon R. E. Retrotransposition-competent human LINE-1 induces apoptosis in cancer cells with intact p53 // J. Biomed. Biotech. 2004. Vol. 4. P. 185-194.
21. Hasler J., Strub K. Alu RNP and Alu RNA regulate translation initiation in vitro // Nucleic Acids Res. 2006. Vol. 34. P. 2374-2385.
22. Hasler J., Samuelsson T., Strub K. Useful ‘junk’: Alu RNAs in the human transcriptome // Cell. Mol. Life Sci. 2007. Vol. 64. P. 1793-1800.
23. Herrmann M., Lorenz H.-M., Voll R., Grunke M., Woith W., Kalde J. R. A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments // Nucleic Acids Research. 1994. Vol. 22. P. 5506-5507.
24. Kazazian H. H. Jr. Mobile elements and disease // Curr. Opin. Genet. Dev. 1998. Vol. 8. P. 343-350.
25. Kochanek S., Renz D., Doerfler W. DNA methylation in the Alu sequences of diploid and haploid primary human cells // EMBO J. 1993. Vol. 12. P. 1141-1151.
26. Liu W.-M., Chu W.-M., Choudary P. V., Schmid C. W. Cell stress and translational inhibitors transiently increase the abundance of mammalian SINE transcripts // Nucleic Acids Res. 1995. Vol. 23. P. 1768-1765.
27. Malathi K., Dong B., Gale M. Jr., Silverman R. H. Small self-RNA generated by RNase L amplifies antiviral innate immunity // Nature. 2007. Vol. 448. P. 816-819.
28. Nikitina T. V., Nazarova N. Y., Aksenov N. D., Tishchenko L. I., Tuohimaa P., Sedova V. M. Small stable RNA level depends on the physiological state of the cell // Цитология. 2004. Т. 46. N 5. С. 437-441.
29. Nikitina T. V., TischenkoL. I. Role of Genetic Element SINE Expression inApoptosis ofthe Cell // New Developments in Cell Apoptosis Research / Ed. By A. J. Corvin. New York, 2007. P. 159-178.
30. Rubin C. M., Kimura R. H., Schmid C. W. Selective stimulation of translational expression by Alu RNA // Nucleic Acids Res. 2002. Vol. 30. P. 3253-3261.
31. Schmid C. W. Alu: a parasite’s parasite? // Nat. Genet. 2003. Vol. 35. P. 15-16.
32. Sundström C., Nilsson K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937) // Int. J. Cancer. 1976. Vol. 17. P 565-577.
33. Vorce R. L., Lee B., Howard B. H. Methylation- and mutation-dependent stimulation of Alu transcription in vitro // Biochem Biophys Res Commun. 1994. Vol. 203. P 845-851.
34. Williams B. R. G. PKR; a sentinel kinase for cellular stress // Oncogene. 1999. Vol. 18. P. 6112-6120.
