CC BY
103
ФИЗИОЛОГИЯ, БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА
УДК 577.214;577.218
И. Н. Кабанов, Т. В. Никитина, Л. И. Тищенко
ЭКСПРЕССИЯ МОЛОДЫХ ПОВТОРОВ ALUY В КЛЕТКАХ ЭРИТРОМИЕЛОБЛАСТОИДНОЙ ЛЕЙКЕМИИ ЧЕЛОВЕКА K562 ПРИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗЕ
Alu-повторы — наиболее изученные представители мобильных генетических элементов класса SINE (Short Interspersed Elements — короткие диспергированные элементы) в геноме человека и некоторых приматов. SINE, в отличие от сателлитной ДНК, не организованы в крупные блоки, а рассеяны по геному. Длина этих элементов составляет 90-400 п. н. Общая черта SINE — присутствие в них двух участков (А- и В-боксов), совпадающих по структуре с усредненной последовательностью вну-тригенного промотора РНК-полимеразы III, характерного для генов тРНК и 7SL РНК [1, 2, 3, 4]. Разные SINE считываются РНК-полимеразой III, а затем их РНК может служить матрицей для обратной транскриптазы, которая закодирована в последовательностях длинных диспергированных повторов LINE [5]. Образовавшаяся с помощью обратной транскриптазы кДНК может интегрироваться в новый локус генома благодаря наличию эндонуклеазного домена у ревертазы, кодируемой LINE [3, 5].
Alu-последовательности ведут свое происхождение от гена 7SL РНК, их длина ~300 п. н, и представлены они в геноме человека примерно 1,18 млн копий, что составляет около 13% от суммарного количества ДНК [6, 7]. Alu-повторы распространяются по геному, как и все SINE, с помощью механизма ретротранспозиции [5]. Различают три семейства Alu: самое древнее и наименее транспозиционно-активное семейство AluJ, более молодое AluS и самое молодое и транспозиционно-активное AluY [8]. Ретротранспозиция Alu может приводить к опухолевой трансформации клеток и некоторым генетическим заболеваниям: гемофилии В, нейрофиброматозу, синдрому Аперта и пр. [9]. С другой стороны, известно, что Alu-повторы способны выполнять функции энхансеров, инсуляторов, участков альтернативного сплайсинга и иные функции, дающие клетке преимущества, что, возможно, и объясняет их распространение по геному человека [6]. Предполагаем, что Alu-последовательности и их РНК-продукты могут играть роль не только в активации пролиферации, опухолевой трансформации, стрессе и ряде других процессов, но и в программируемой клеточной гибели — апоптозе. Однако роль Alu-последовательностей и их РНК-транскриптов при апоптозе клеток детально не исследовалась. В наших предыдущих исследованиях было показано, что при апоптозе существенно увеличивается уровень экспрессии генов молодых повторов AluY в клетках гистиоцитарной лимфомы человека U937,
© И. Н. Кабанов, Т. В. Никитина, Л. И. Тищенко, 2011
ДНК которых глобально гиперметилирована [10]. Цель настоящей работы — оценка взаимосвязи между различным уровнем экспрессии генов молодых повторов AluY и физиологическим статусом клетки (стадии пролиферации и апоптоза) в клетках эритромиелобластоидной лейкемии человека К562, ДНК которых глобально гипоме-тилирована.
Материалы и методы исследования
Клетки эритромиелобластоидной лейкемии человека К562 приобретали в Отделе клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки К562 при плотности 1 млн кл./мл в среде RPMI-1640 с 10%-ной сывороткой эмбрионов крупного рогатого скота (FBS) и гентамицином (40 мкг/мл) культивировали при 37 °С [11], предварительно разделив на две порции: в одну (эксперимент) для индукции апоп-тоза добавляли ингибитор ДНК-топоизомеразы I камптотецин (CAM) до конечной концентрации 4 мкг/мл [12], а вторую (контроль) культивировали в тех же условиях, но без CAM. Аликвоты суспензии клеток для анализа отбирали через 3, 6, 24 и 48 ч после добавления CAM. Апоптоз клеток К562, индуцированный САМ, детектировали по увеличению количества фрагментированной геномной ДНК в цитоплазматической фракции клеток [13].
Анализ содержания специфичных РНК в тотальной РНК клеток К562 проводили методами ОТ-ПЦР «в реальном времени». Тотальную РНК выделяли из клеток К562, используя набор AquaPure RNA (Bio-Rad, США). Полученную тотальную РНК анализировали с помощью электрофореза в 1,2%-ном агарозном геле в присутствии формальдегида. Синтез кДНК на матрице тотальной РНК осуществляли с помощью набора RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Литва) и статистического набора гексамерных праймеров. Полученную кДНК применяли в качестве матрицы при проведении ПЦР «в реальном времени», используя специфичные праймеры к РНК-продуктам повторов, принадлежащих к (а) AluYa5 и другим различным субсемействам молодого семейства AluY (AluYa4, AluYa8, AluYb8, AluYb9, AluY, AluYc1, AluYg6): 5'-GGT CAG GAG ATC GAG ACC AT-3' (прямой), 5'-ACG GAG TCT CGC TCT GTC G-3'(обратный), а также к (б) AluYb8: 5'-GTC AGG AGA TCG AGA CCA TCC TGG CTA ACA A-3' (прямой), 5'-TCT GTC GCC CAG GCC GGA-3' (обратный). Последовательности повторов AluY для подбора праймеров брали из базы данных Repbase (URL: http://www.girinst.org/repbase/index.html). Подбор праймеров осуществляли с помощью программы Primer3 (URL: http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm). Проба для ПЦР объемом 25 мкл содержала: реакционную смесь EVA Green (10 мкл) (включающую х2,5 ПЦР буфер Б (KCl, ТрисНО (pH 8,8), 6,25 мM MgCl2), Taq ДНК-полимеразу, дезок-сирибонуклеозидтрифосфаты, глицерин, Tween-20, интеркалирующий краситель), по 150 нМ прямого и обратного праймеров для Alu-последовательностей, 200 нг кДНК-матрицы. ПЦР «в реальном времени» проводили на установке CFX96 real-time PCR detection system (Bio-Rad, США). Программа амплификации: 95 °С — 5 мин; 45 циклов: 63 °С — 1 мин, 95 °С — 15 с. Измерение флуоресценции проводили при 84 °С. Кривые плавления продуктов ПЦР снимали в интервале температуры 65-98 °С. Полученные данные анализировали с помощью программ CFX Manager (Bio-Rad, США) и Microsoft Excel 2003. Соотношение (r) уровней содержания исследуемой РНК в контроле (клетки без обработки камптотецином) и в эксперименте (клетки, обработанные камптотеци-ном) вычисляли по формуле: r = EACt, где E — эффективность амплификации, ACt — раз-
ница значений порогового цикла Ct в контроле и в эксперименте. В пробах с РНК без обработки обратной транскриптазой в результате ПЦР продукты не обнаруживались.
Результаты исследования и их обсуждение
Для исследования содержания Alu-РНК при различных физиологических состояниях клетки использовали в качестве модели культуру клеток эритромиелобластоид-ной лейкемии человека КЗб2, находящихся в состоянии пролиферации или апоптоза. Индукцию апоптоза проводили при помощи обработки клеток КЗб2 CAM в концентрации 4 мкг/мл [12]. Апоптоз был детектирован по появлению в цитоплазматической и ядерной фракциях клеток КЗб2 лестничной фрагментации ДНК после 24-часовой обработки (рис. 1). На рис. 1 видно, что по мере увеличения времени инкубации с САМ (до 48 ч) увеличивалось количество фрагментов ДНК в цитоплазматической фракции клеток. В ядерной же фракции клеток, обработанных САМ, сначала происходило увеличение числа ДНК-фрагментов, а затем (после 48-часовой обработки) снижение. Это может свидетельствовать о том, что после 48-часовой обработки САМ основная часть клеток КЗб2 находится в поздней стадии апоптоза, для которой характерен выход большей части фрагментов ДНК за пределы ядра.
Тотальную РНК выделяли из клеток КЗб2, применяя набор AquaPure RNA (Bio-Rad, США). Анализ выделенной РНК проводили с помощью электрофореза в 1,2%-ном агарозе на MOPS-буфере с формальдегидом. Как видно из рис. 2, после разделения в агарозном геле тотальной РНК, окрашенной бромистым этидием, наблюдаются две четкие полосы, соответствующие 28S (~ 4800 нуклеотидов) и 18S (~ 1900 нуклеотидов) рРНК. Это означает, что тотальная РНК не была деградирована при выделении, и ее можно использовать в качестве матрицы в реакции обратной транскрипции (получения кДНК для дальнейшего использования в ПЦР) [14].
На следующем этапе работы нами было изучено изменение содержания продуктов экспрессии Alu-повторов, принадлежащих к молодому семейству AluY, в клетках КЗб2 при переходе к апоптозу. Это необходимо для проверки гипотезы о том, что короткие диспергированные повторы SINE, к которым относятся Alu-последовательности человека, и их РНК-продукты могут играть определенную роль в реакции клетки на сильные цитотоксические повреждения и, возможно, обеспечивать реализацию апоп-тозного пути. В качестве объекта исследования были выбраны представители субсемейства AluY (AluYa4, AluYaЗ, AluYa8, AluYb8, AluYb9, AluY, AluYc1, AluYgб), так как для них в наибольшей степени характерен инсерционный полиморфизм, т. е. они являются наиболее транспозиционно-активными Alu-последовательностями в геноме человека [З].
Методом количественной ОТ-ПЦР в реальном времени получены данные об экспрессии AluYb8 и других молодых субсемейств AluY в клетках КЗб2, находящихся в состоянии пролиферации и апоптоза. Уровень экспрессии генов молодых субсемейств Alu оценивали по содержанию соответствующих РНК в тотальной РНК клеток. Было показано, что при апоптозе, индуцированном CAM, в клетках КЗб2 уровень экспрессии AluYb8 после 24-часовой обработки возрастает в 9,89 ± 3,33 раза, а после 48-часовой — в 23,77 ± 2,38 раза по сравнению с пролиферирующими клетками. Аналогичные результаты были получены для других молодых субсемейств AluY: суммарное гадержание AluYaЗ-, Ya4-, Ya8-, Yb9-, Yc1-, Ygб- и Yb8-РНK при апоптозе, вызванном CAM, после
4З
№ дорожки 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
вепе Яиіег 1кЪ Цитоплазматическая фракция вепс Яиіег 50Ьр Ядерная фракция
САМ - - - - - + + + + + + + +
Время, ч - 3 6 24 48 3 6 24 48 - 3 6 24 48 3 6 24 48
Рис. 1. Электрофореграмма разделения фрагментов ДНК цитоплазматической (дор. 2-9) и ядерной (дор. 11-18) фракций клеток К562 в норме (дор. 2-5 и 11-14) и после обработки
САМ (дор. 6-9 и 15-18)
Ниже приведены денситограммы дорожек 6-9 и 15-18, полученные с применением программы ImageJ
1.39и (№Н, США).
24-часовой обработки увеличивается в 11,9 ± 0,65 раз, а после 48-часовой — в 19,77 ± 0,8 раз по сравнению с пролиферирующими клетками (рис. 3, а, б).
Анализ кривых плавления продуктов ПЦР, полученных амплификацией с праймерами к последовательности А1иУа5, показал присутствие целого ряда слившихся друг с другом пиков (рис. 4, а). Это объясняется тем, что для амплификации использовались праймеры, подобранные к консервативным участкам последовательности А1иУа5, которые также присутствуют в других последовательностях, принадлежащих к различным субсемействам молодого семейства А1иУ(А1иУа4, А1иУа5, А1иУа8, А1иУЬ8, А1иУЬ9, А1иУ, А1иУс1, A1uYg6). Поэтому продукты ПЦР в реальном времени в данном
2
____
3
5
■_____-
Рис. 2. Электрофореграмма тотальной РНК клеток К562 после разделения в 1,2%-ном
агарозном геле
1 — маркер длин фрагментов РНК — RiboRuler ^егте^а8); 2 — клетки К562 после обработки: 3 ч с 10%-ной FBS; 3 — 3 ч с 10%-ной FBS и САМ (4 мкг/мл); 4 — 6 ч с 10%-ной FBS; 5 — 6 ч с 10%-ной FBS и САМ (4 мкг/мл); 6 — 24 ч с 10%-ной FBS; 7 — 24 ч с 10%-ной FBS и САМ (4 мкг/мл); 8 — 48 ч с 10%-ной FBS; 9 — 48 ч с 10%-ной FBS и САМ (4 мкг/мл). Справа приведена денситограмма геля, полученная с помощью программы ImageJ 1.39и (ШН, США).
случае являются гетерогенными и представлены ДНК-копиями, которые соответствуют фрагментам различных А1и-повторов и имеют разные температуры плавления, но одинаковые размеры. Очевидно, что представленные на рис. 4, а данные относятся не только к А1иУа5-РНК, но и к РНК других перечисленных субсемейств А1и. Для амплификации А1иУЬ8-кДНК использовались праймеры, комплементарные уникальным участкам этой последовательности, которые присутствуют также у А1иУЬ9 (А1иУЬ9 отличается от А1иУЬ8 лишь одной нуклеотидной заменой и распространена в геноме человека в значительно меньшей степени), но отсутствуют у последовательностей, принадлежащих к другим субсемействам А1иУ. В этом случае продукт ПЦР был представлен последовательностями А1иУЬ8 и А1иУЬ9 с близкой температурой плавления, при денатурации которых на кривой плавления присутствовали два пика (рис. 4, б). Таким образом, наши данные свидетельствуют, что в апоптотических клетках К562 существенно повышается содержание А1и-РНК, синтезируемых с А1и-повторов, принадлежащих к целому ряду молодых субсемейств.
Рис. 3. Содержание РНК Л1иУа5 и других молодых субсемейств Л1иУ (а) и Л1иУЬ8-РНК (б) в тотальной РНК клеток К562, находящихся в состоянии пролиферации и апоптозе Заштрихованные столбцы соответствуют пробам без камптотецина, белые — пробам с камптотецином. Время инкубации после добавления камптотецина указано под каждым столбцом, для каждого из них указано стандартное отклонение.
100 80 60 40 20 0
65 70 75 80 85 90 95
Рис. 4. Кривые плавления продуктов амплификации кДНК, полученных методом ПЦР в присутствии специфичных праймеров для последовательности AluYa5 и других представителей AluY (а) и AluYbS (б)
По оси абсцисс — температура (°С), по оси ординат — отрицательная величина скорости изменения флуоресценции EVA Green в пробе.
В настоящее время имеются данные, свидетельствующие о том, что при различных повреждающих воздействиях на клетку в ней повышается содержание SINE-транскриптов, что сопровождается либо восстановлением клетки, либо ее гибелью (апоптозом) [6, 10, 15]. Существует ряд предположений о возможной роли Alu-РНК, а также транскриптов других представителей семейства SINE (B1- и В2-РНК у грызунов) в обеспечении восстановления клетки после стресса [15]. Однако роль SINE-транскриптов при апоптозе клеток до сих пор не выяснена. Имеющиеся в настоящее время сведения позволяют выдвинуть несколько рабочих гипотез о роли SINE и SINE-транскриптов при программируемой клеточной гибели [6].
Одним из возможных механизмов действия SINE-продуктов как агентов, влияющих на апоптоз, может быть их активная ретротранспозиция, приводящая к встраиванию этих последовательностей в новые области генома и, в результате, к нарушению нормальной экспрессии генов [16, 17, 18, 19]. Как говорилось выше, Alu-повторы распространяются по геному с помощью механизма ретротранспозиции, используя ферментативный аппарат последовательностей L1 (представителей LINE у человека) [5]. В этом отношении важно, что активация ретротранспозиции L1-элементов в клетках человека может приводить к р53-опосредованному апоптозу [19]. Позже было обнаружено, что активация ретротранспозиции L1-элементов в клетках карциномы человека MCF-7 индуцирует множественные повреждения ДНК, вероятнее всего, одноцепочечные разрывы, которые клетка не успевает репарировать. Это приводит к активации апоптоза в ответ на повреждение ДНК [16]. Экспрессия L1 может приводить также к аресту клеточного цикла раковых клеток и появлению у опухолевых клеток фенотипа, подобного таковому у стареющих клеток [16, 20, 21, 22]. Авторы этих исследований не изучали ретротранспозицию Alu-повторов в клетках после индукции ретротранспозиции LINE. Однако известно, что при активации ретротранспозиции LINE параллельно активируется и ретротранспозиция некоторых SINE, таких как Alu-повторы у приматов и B1-, В2-элементы у грызунов [6]. Значит, увеличение уровня Alu-РНК также может оказывать проапоптозное влияние по этому механизму. Тем более недавно было обнаружено, что трансфекция синтетических аналогов Alu-РНК в клетки аденокарциномы молочной железы MCF-7 в культуре приводит к снижению жизнеспособности данных опухолевых клеток [23]. Таким образом, активация ретротранспозиции LINE и, в свою очередь, SINE, вероятно, может приводить к апоптозу.
Следствием активации ретротранспозиции Alu может быть инсерция данных последовательностей в разные участки генома. Инсерции Alu-повторов могут приводить к различным онкологическим заболеваниям, сопряженным с подавлением апоптоза. Так, вставка Alu в ген CRB1 приводит к ретинобластоме [24], инсерция Alu в гены BRCA2 и BRCA1 выявляется при раке молочной железы [25, 26], а вставка Alu в ген NF1 — при нейрофиброматозе [27]. Однако инсерции Alu способны также оказывать проапоптозное действие. Известен пример, когда вставка Alu в ген привела к усилению проапоптозных свойств белка, кодируемого данным геном [28]. Белок Bcl-rambo B, содержащий в своем составе Alu-кассету, обладает более высокой проапоптозной активностью, чем Bcl-rambo (не содержащий Alu-вставки), и участвует в индукции апоптоза, опосредованного митохондриями, при действии этопозида и таксола [28]. Таким образом, влияние инсерций Alu на апоптоз двояко: они могут вызывать как подавление апоптоза и индукцию канцерогенеза, так и оказывать проапоптозное действие.
Некоторые авторы полагают, что при канцерогенезе Alu/Alu-рекомбинации вносят больший вклад в развитие опухолей, чем инсерции этих элементов [29, 30]. Последствия данных рекомбинаций могут проявляться в подавлении апоптоза [31, 32]. Такие рекомбинации также способны приводить к потере гетерозиготности и другим составляющим генетической нестабильности при раке [29, 30]. Неаллельные гомологические рекомбинации (NAHR) Alu/Alu в зародышевых и соматических клетках могут способствовать развитию различных онкологических заболеваний. NAHR Alu/Alu в зародышевых клетках, происходящие в генах MLH1 и MSH2, приводят к наследственному не-полипозному колоректальному раку [33, 34, 35], а в гене BRCA1 — к раку молочной железы [36]. NAHR Alu/Alu в соматических клетках, происходящие в генах MYB и MLL1, приводят соответственно к T-ALL (острый Т-лимфобластный лейкоз) и AML (острый миелобластный лейкоз) [31, 32], а в гене hCAD — к гепатоме [37]. Важно, что данные рекомбинации нередко задействуют гены, имеющие отношение к апоптозу. Так, при гепатоме повреждается ген hCAD, кодирующий ДНК-азу, активируемую каспазами, и являющуюся ключевым ферментом в процессе нуклеосомной фрагментации хроматина при апоптозе [37]. NAHR Alu/Alu в состоянии привести к мутациям гена P53 и, таким образом, к блокированию апоптоза [38]. Итак, последствием рекомбинации Alu/Alu может быть подавление апоптоза и развитие опухоли.
Alu-последовательности также могут влиять на реализацию апоптотического пути посредством регуляции трансляции. Известно, что как при ответе клетки на стрессорные воздействия, так и при переходе к апоптозу, наблюдается подавление тотального белкового синтеза. С другой стороны, в обоих случаях для реализации сигнальных путей, приводящих к восстановлению клетки или ее гибели, необходим синтез de novo специфичных белков (например, белков теплового шока или каспаз). Выдвинуто предположение, что в специфичной регуляции аппарата трансляции, обеспечивающей подавление тотального синтеза белка и осуществление синтеза специфических белков, способны участвовать SINE-РНК, уровень которых в клетке возрастает при повреждающих воздействиях [6]. В пользу этого предположения говорит тот факт, что все известные SINE произошли от генов РНК, участвующих в трансляции и способных взаимодействовать с рибосомами и другими участниками белкового синтеза: гена либо тРНК, либо 7SL РНК (РНК-компонента SRP (Signal Recognition Particle) — частицы, участвующей в транспорте синтезируемых рибосомой белков к шероховатому эндоплазматическому ретикулуму, шЭПР) [39]. Недавно обнаружено, что Alu-РНК в комплексе с белками SRP9/14 ингибирует инициацию трансляции in vitro мРНК репортерных генов циклина, препролактина, люциферазы и PAI-2, а Alu-РНК в отсутствие SRP-белков активирует инициацию трансляции в этой же системе [39]. Можно предположить, что РНП-частица, содержащая белки SRP9/14 и Alu-РНК, способна связываться с рибосомой и останавливать трансляцию независимо от присутствия в новосинтезированном белке специфичных сигнальных последовательностей локализации в шЭПР. Кроме того, известно, что Alu-РНК содержат достаточно протяженные полиА-последовательности, с которыми может связываться белок PABP. В этом случае Alu-РНК могут подавлять трансляцию, конкурируя с мРНК за связывание PABP [40]. Механизм активации трансляции с участием Alu-РНК, не связанный с SRP-белками, пока не ясен [39].
Еще один механизм регуляции трансляции с участием Alu-РНК и протеинкина-зы PKR, регулируемой двухцепочечными РНК, был предложен для клеток в состоя-
нии стресса [41]. Однако, как уже говорилось, тот же механизм может действовать и в случае индукции апоптоза, тем более что PKR относится к проапототическим белкам [42]. Установлено, что Alu-РНК связывается с протеинкиназой PKR и ингибирует ее киназную активность in vivo в трансфицированных клетках человека 293 и in vitro [41]. Позже было выявлено, что действие Alu-РНК на PKR имеет более сложный характер и зависит от концентрации РНК: при соотношении 0,02-2,0 пмоль димерной Alu-РНК на 2 пмоль PKR киназная активность повышалась, а при соотношении 100 и более пмоль Alu-РНК на 2 пмоль PKR — понижалась [42]. Можно предположить, что в условиях, когда в клетке повышается содержание Alu-РНК, они способны стать важными РНК-регуляторами киназы PKR.
Недавно стало известно, что при сверхэкспрессии гена PKR дикого типа в клетках мыши NIH3T3 эта протеинкиназа участвует в реализации пути «отложенной» клеточной смерти, последовательно активируя в клетке две «конфликтующие» программы: сначала программу выживания клетки через сигнальный путь NF-kB, а затем — программу апоптоза через фосфорилирование фактора инициации трансляции eIF-2a. При этом первая программа не зависит от киназной активности PKR и, следовательно, не требует присутствия двухцепочечных РНК, а вторая — требует активации PKR двухцепочечными РНК [43].
Можно предположить, что в развитии ответа клетки на повреждающие агенты постепенно накапливающиеся SINE-РНК способны играть роль временных ограничителей, сигналов, активируемых киназой PKR. Сразу после повреждающего воздействия, пока концентрация SINE-РНК в клетке еще очень низка, PKR запускает программу выживания клетки через сигнальный путь NF-kB. Затем, когда концентрация SINE-РНК достигнет уровня, достаточного для активации киназной активности PKR, киназа активирует апоптозный путь, а по достижении высокой концентрации SINE-РНК ферментативная активность PKR подавляется, так как дальнейшее развитие активированных сигнальных путей не требует участия этой протеинкиназы. Известно, что накопление SINE-РНК в клетках носит временный характер [44], и их ингибиторное действие на киназную активность PKR также ограничено во времени.
Накапливающиеся в клетке после повреждающих воздействий SINE-РНК могут влиять не только на синтез тотального белка в клетке, но и специфично какое-то время активировать трансляцию вновь синтезированных мРНК, используя пока не выявленный механизм, независимый от PKR [45]. Очевидно, что этот механизм позволяет клетке временно переключиться на синтез белков, необходимых в новых условиях для ее восстановления (например, белков теплового шока) или запуска апоптоза (например, каспаз). Подобная регуляция, по-видимому, неспецифична к каким-то определенным мРНК, и синтез белка будет зависеть от того, синтез каких именно мРНК будет индуцирован в этих условиях. Данный механизм специфичной активации вновь синтезированных мРНК показан и для клеток мыши, где его активировали B1- и В2-РНК [45]. Это позволяет предположить, что Alu-РНК могут влиять на трансляцию мРНК, оказывая проапоптозное действие.
Известно, что в ответ на тепловой шок в клетках мыши NIH3T3 повышается содержание В2-РНК, которая ингибирует транскрипцию, осуществляемую РНК-полимеразой II in vitro и in vivo [46]. В2-РНК с высокой аффинностью и специфичностью связывается с РНК-полимеразой II, ассоциированной в преинициаторный комплекс на промоторе in vitro, и, таким образом, блокирует синтез мРНК на стадии
инициации. Происходит «закрепление» преинициаторного комплекса в инактивированном состоянии до тех пор, пока не будет удалена В2-РНК [47]. В связи с тем, что В2-РНК, как и Alu-РНК, относятся к SINE, вероятно, сходный механизм надо полагать и для Alu-РНК. Итак, Alu-РНК, очевидно, способны ингибировать транскрипцию генов класса II, что может привести к аресту клеточного цикла. И, наконец, Alu-РНК, по-видимому, способствуют переходу клетки к апоптозу, активируя внутриклеточные системы неспецифического иммунитета, аналогично действию экзогенных вирусных РНК. Так, недавно установлено, что одна из систем врожденного антивирусного ответа — система интерферона в — может быть активирована в клетке не только вирусной РНК, но и собственными клеточными РНК [48]. Полагаем, что роль такого РНК-активатора играет Alu-РНК, содержание которой в клетке повышается при заражении вирусом или стрессорном воздействии. Активация же системы интерферона в может приводить к апоптозу клетки через сигнальный каскад Jak-Stat [6].
В последнее время популярна гипотеза «палки о двух концах» в отношении роли мобильных элементов в регуляции апоптоза и в канцерогенезе [29]. Повреждение ДНК вследствие активации экспрессии и ретротранспозиции мобильных элементов LINE и SINE в нормальных клетках или на ранних стадиях трансформации приводит к апоптозу клеток, препятствуя канцерогенезу. Но если клетка потеряла способность к апоптозу, то активность мобильных элементов может приводить к усилению генетической нестабильности, опухолевой трансформации клетки и эволюции опухоли в сторону более агрессивных форм [29, 49].
Alu-последовательности оказывают неоднозначное влияние на апоптоз и канцерогенез. Однако, если вклад в регуляцию программируемой гибели клетки инсерций и рекомбинаций Alu противоречив, то действие Alu-РНК на трансляцию и транскрипцию, связь Alu с системой неспецифического иммунитета оказывают преимущественно проапоптозное влияние. Таким образом, экспрессия Alu-повторов в большей степени способствует апоптозу, а не препятствует ему, действуя посредством вышеперечисленных механизмов.
Известно, что в пролиферирующих клетках содержание Alu-РНК низкое, в отличие от некоторых других РНК-продуктов генов класса III, прежде всего — тРНК и 5SрРНК [13, 15, 37]. С другой стороны, показано, что в апоптотических клетках содержание тРНК (кроме инициаторной тРНК) снижается, а согласно нашим данным количество Alu-РНК значительно повышается [10, 15]. Невыясненным остается механизм, позволяющий клетке одновременно снижать синтез тРНК и повышать синтез Alu-РНК, при том что гены обеих этих групп РНК имеют одинаковые промоторы. Можно предположить, что в случае стресса и апоптоза в клетках одновременно с подавлением транскрипции генов 5SрРНК и тРНК путем инактивации фактора TFIIIB белками pRb и р53 [7, 50] происходит усиление транскрипции SINE путем активации или синтеза de novo фактора TFIIIC [6]. Кроме того, TFIIIC обладает также гистона-цетилтрансферазной активностью, т. е. он может способствовать образованию более «открытой» структуры SINE-хроматина, делая его более доступным для связывания других белков [51]. В регуляции транскрипции SINE, вероятно, также играют роль различные посттрансляционные модификации РНК-полимеразы III и ее базальных транскрипционных факторов [1]. Кроме того, одним из возможных механизмов различной экспрессии генов SINE и других генов класса III при стрессе и апоптозе является изменение метилирования последовательностей генов [52, 53]. Но ранее нами было
показано, что метилирование генов AluY не зависит от физиологического состояния клеток: повышение экспрессии Alu-повторов не сопровождается снижением уровня метилирования их последовательности [10]. Однако следует отметить, что в данной работе исследовалась лишь часть CpG-сайтов Alu-повторов, а именно — CpG-сайты, расположенные в участках, комплементарных используемым для ПЦР праймерам [10]. Кроме того, в работе были исследованы участки Alu-повторов, не включающие в себя промотор [10]. Можно предположить, что влияние на транскрипцию будет оказывать метилирование именно CpG-сайтов, входящих в состав промотора, так как именно с промотором связываются базальные транскрипционные факторы TFIIIB и TFIIIC, которые затем привлекают в транскрипционный комплекс РНК-полимеразу III. Более того, недавно полученные данные свидетельствуют, что на транскрипцию генов класса III с внутригенным промотором (а именно — гена EBER-1 вируса Эпштейна—Барра) существенное влияние оказывает метилирование CpG-сайтов, расположенных не внутри гена, а в 5'-фланкирующей области [54]. Также было выявлено, что метилирования критических CpG-динуклеотидов в промоторе LINE достаточно, чтобы гарантировать репрессию транскрипции [55, 56]. Можно предположить, что и в случае Alu-повторов достаточно высокий уровень метилирования не препятствует экспрессии тех копий AluYb8, которые имеют гипометилированные участки промотора или 5'-фланкирую-щие области.
Ранее Т. В. Никитиной и соавторами [10] сообщалось, что при CAM-индуци-рованном апоптозе на поздних стадиях экспрессия AluYb8 в клетках U937 возрастает в 4-10 раз по сравнению с пролиферирующими клетками [10]. В данном же исследовании показано, что при апоптозе, индуцированном CAM, в клетках K562 уровень экспрессии AluYb8 после 48-часовой обработки возрастает в 23,77 ± 2,38 раза по сравнению с пролиферирующими клетками. Разница в экспрессии AluYb8 на поздних стадиях апоптоза, вызванного САМ, в клетках U937 и K562, вероятно, связана с различным уровнем метилирования Alu в этих клетках: в клетках U937 Alu-последовательности конститутивно гиперметилированы, а в клетках K562 — гипометилированы [57]. Однако известно, что из-за конститутивно высокого содержания Alu-РНК в клетках K-562 происходит лишь небольшое дополнительное повышение содержания этих РНК в ответ на различные повреждающие воздействия [57]. Таким образом, еще предстоит выяснить, какие факторы ответственны за столь значительное увеличение уровня Alu-РНК в клетках К562 при апоптозе.
Итак, в настоящей работе показано, что при переходе клетки к апоптозу в ней значительно повышается содержание Alu-РНК, синтезируемых с Alu-повторов молодых субсемейств. Полагаем, что это изменение необходимо для реализации клеткой апоптотического пути посредством различных механизмов. Однако все приведенные гипотезы требуют проведения дополнительных исследований с целью тщательной проверки. Также представляется важным изучение механизмов регуляции транскрипции генов Alu-повторов, так как имеющиеся данные свидетельствуют, что уровень экспрессии различных генов, транскрибируемых РНК-полимеразой III, различается в апоптотических клетках: он может как повышаться (в случае Alu-повторов), так и снижаться (гены тРНК, участвующие в элонгации трансляции, гены 5SрРНК) [10]. Поэтому представляется необходимым выявить те факторы, которые определяют указанные различия в транскрипции каждой конкретной группы генов класса III. Наиболее перспективным нам кажется изучение уровня метилиро-
вания ДНК и доступности для связывания транскрипционных факторов промотор-ных и 5'-фланкирующих участков Alu-повторов, принадлежащих к молодым субсемействам, а также выявление специфичных белковых факторов, которые могут участвовать в регуляции транскрипции Alu-последовательностей в апоптотической клетке.
Литература
1. Никитина Т. В., Тищенко Л. И. Транскрипционная машина РНК-полимеразы III: строение и регуляция транскрипции // Молекулярная биология. 2005. Т. 39. С. 179-192.
2. Died G., Fiorino G., Castelnuovo M., Teichmann M. The expanding RNA polymerase III tran-scriptome // Trends Genet. 2007. Vol. 23. Р. 614-622.
3. Grover D., Kannan K., Brahmachari S. K., Mukerji M. ALU-ring elements in the primate genomes // Genetica. 2005. Vol. 124. Р. 273-289.
4. Schmid C. W. Does SINE evolution preclude Alu function? // Nucleic Acids Res. 1998. Vol. 26. Р. 4541-4550.
5. Schmid C. W. Alu: a parasite’s parasite? // Nat. Genet. 2003. Vol. 35. Р. 15-16.
6. Никитина Т. В., Тищенко Л. И. Роль экспрессии мобильных элементов класса SINE и ге-
нов, транскрибируемых РНК-полимеразой III, в регуляции внутриклеточных процессов (обзор) // Молекулярная биология. 2008. Т. 42. C. 547-558.
7. Goodfellow S. J., White R. J. Regulation of RNA Polymerase III Transcription During Mammalian Cell Growth // Cell Cycle. 2007. Vol. 3. Р. 2323-2326.
8. Umylny B., Presting G., Efird J. T., Klimovitsky B. I. Most human Alu and murine B1 repeats are
unique // J. Cell Biochem. 2007. Vol. 102. Р. 110-121.
9. Kazazian H. H. Jr. Mobile elements and disease // Curr. Opin. genet. Dev. 1998. Vol. 8. Р. 343-350.
10. Никитина Т. В., Гао Л., Карпачева К. Е., Тищенко Л. И. Изменение экспрессии генов тРНК и Alu-повторов молодых субсемейств Ya5 и Yb8, транскрибируемых РНК-полимеразой III, в клетках человека U937 при апоптозе, индуцированном камптотецином // Вестн. С.-Петерб. ун-та. 2009. Сер. 3: Биология. Вып. 1. C. 49-60.
11. Dasgupta P., Sun J., Wang S., Fusaro G. Disruption of the Rb-Raf-1 interaction inhibits tumor growth and angiogenesis // Mol. Cell Biol. 2004. Vol. 24. Р. 9527-9541.
12. Bicknell G. R., Snowden R. T., Cohen G. M. Formation of high molecular mass DNA fragments is a marker of apoptosis in the human leukaemic cell line, U937 // J. Cell Sci. 1994. Vol. 107. Р. 24832489.
13. Herrmann M., Lorenz H. -M., Voll R., Grunke M. A rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments // Nucl. Acids Res. 1994. Vol. 22. Р. 5506-5507.
14. Chomczynski P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation // Nucl. Acids Res. 1992. Vol. 20. Р. 3791-3792.
15. Nikitina T. V., Tischenko L. I. Role of Genetic Element SINE Expression in Apoptosis of the Cell / ed. by A. J. Corvin // New Developments in Cell Apoptosis Research. Hauppauge; N.Y.: Nova Science Publishers, Inc., 2007. P. 159-178.
16. Belgnaoui S. M., Gosden R. G., Semmes O. J., Haoudi A. Human LINE-1 etrotransposition induces DNA damage and apoptosis in cancer cells // Cancer Cell Int. 2006. Vol. 6. Р. 13.
17. Bennett E. A., Coleman L. E., Tsui C., Pittard W. S. Natural genetic variation caused by transpos-able elements in humans // Genetics. 2004. Vol. 168. Р. 933-951.
18. Dewannieux M., Heidmann T. L1-mediated retrotransposition of murine B1 and B2 SINEs recapitulated in cultured cells // J. Mol. Biol. 2005. Vol. 349. Р. 241-247.
19. Haoudi A., Semmes O. J., Mason J. M., Cannon R. E. Retrotransposition-competent human LINE-1 induces apoptosis in cancer cells with intact p53 // J. Biomed. Biotechnol. 2004. Vol. 1. Р. 185194.
20. Farkash E. A., Kao G. D., Horman S. R., Prak E. T. Gamma radiation increases endonuclease-dependent L1 retrotransposition in a cultured cell assay // Nucl. Acids Res. 2006. Vol. 34. P. 11961204.
21. Gasior S. L., Wakeman T. P., Xu B., Deininger P. L. The human LINE-1 retrotransposon creates DNA double-strand breaks // J. Mol. Biol. 2006. Vol. 357. P. 1383-1393.
22. Wallace N. A., Belancio V P., Deininger P. L. L1 mobile element expression causes multiple types of toxicity // Gene. 2008. Vol. 419. P. 75-81.
23. Semenov D. V., Stepanov G. A., Baryakin D. N., Koval O. A. Extracellular RNA as Regulators of Cellular Processes // Adv. in Exp. Med. Biol. 2010. in press.
24. Den Hollander A. I., ten Brink J. B., de Kok Y. J., van Soest S. Mutations in a human homologue of Drosophila crumbs cause retinitis pigmentosa (RP12) // Nat. Genet. 1999. Vol. 23. P. 217-221.
25. Machado P. M., Brandao R. D., Cavaco B. M., Eugenio J. Screening for a BRCA2 rearrangement in high-risk breast / ovarian cancer families: evidence for a founder effect and analysis of the associated phenotypes // J. Clin. Oncol. 2007. Vol. 25. P. 2027-2034.
26. Miki Y., Katagiri T., Kasumi F., Yoshimoto T. Mutation analysis in the BRCA2 gene in primary breast cancers // Nat. Genet. 1996. Vol. 13. P. 245-247.
27. Wallace M. R., Andersen L. B., Saulino A. M., Gregory P. E. A de novo Alu insertion results in neurofibromatosis type 1 // Nature. 1991. Vol. 353. P. 864-846.
28. Yi P., Zhang W., Zhai Z., Miao L. Bcl-rambo beta, a special splicing variant with an insertion of an Alu-like cassette, promotes etoposideand Taxol-induced cell death // FEBS Lett. 2003. Vol. 534. P. 61-68.
29. Belancio V. P. Roy-Engel A. M., Deininger P. L. All y’all need to know ‘bout retroelements in cancer // Seminars in Cancer Biology. 2010. Vol. 20. P. 200-210.
30. Konkel M. K., Mark A. Batzer M. A. A mobile threat to genome stability: The impact of non-LTR retrotransposons upon the human genome // Seminars in Cancer Biology. 2010. Vol. 20. P. 211-221.
31. O’Neil J., Tchinda J., Gutierrez A., Moreau L. Alu elements mediate MYB gene tandem duplication in human T-ALL // J. Exp. Med. 2007. Vol. 204. P. 3059-3066.
32. Strout M. P., Marcucci G., Bloomfield C. D., Caligiuri M. A. The partial tandem duplication of ALL1 (MLL) is consistently generated by Alu-mediated homologous recombination in acute myeloid leukemia // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 2390-2395.
33. Li L., McVety S., Younan R., Liang P. Distinct patterns of germ-line deletions in MLH1 and MSH2: the implication of Alu repetitive element in the genetic etiology of Lynch syndrome (HNPCC) // Hum. Mutat. 2006. Vol. 27. P. 388.
34. Van der K., Wijnen J., Wagner A., Verkuilen P. Molecular characterization of the spectrum of genomic deletions in the mismatch repair genes MSH2, MLH1, MSH6, and PMS2 responsible for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) // Genes Chromosomes Cancer. 2005. Vol. 44. P. 123-138.
35. Viel A., Petronzelli F., Della P. L., Lucci-Cordisco E. Different molecular mechanisms underlie genomic deletions in the MLH1 gene // Hum. Mutat. 2002. Vol. 20. P. 368-374.
36. Mazoyer S. Genomic rearrangements in the BRCA1 and BRCA2 genes // Hum. Mutat. 2005. Vol. 25. P. 415-422.
37. Hsieh S. Y., Chen W. Y., Yeh T. S., Sheen I. S. High-frequency Alu-mediated genomic recombination/deletion within the caspase-activated DNase gene in human hepatoma // Oncogene. 2005. Vol. 24. P. 6584-6589.
38. Gebow D., Miselis N., Liber H. L. Homologous and nonhomologous recombination resulting in deletion: effects of p53 status, microhomology, and repetitive DNA length and orientation // Mol. Cell. Biol. 2000. Vol. 20. P. 4028-4035.
39. Hasler J., Strub K. Alu RNP and Alu RNA regulate translation initiation in vitro // Nucl. Acids Res. 2006. Vol. 34. P. 2374-2385.
40. Dewannieux M., Heidmann T. Role of poly(A) tail length in Alu retrotransposition // Genomics. 2005. Vol. 86. P. 378-381.
41. Chu W. -M., Ballard R., Carpick B. W., Williams B. R. G. Potential Alu function: regulation of the activity of double-stranded RNA-activated kinase PKR // Mol. Cel. Biol. 1998. Vol. 18. Р. 58-68.
42. Williams B. R. G. PKR: a sentinel kinase for cellular stress // Oncogene. 1999. Vol. 18. Р. 61126120.
43. Donze O., Deng J., Curran J., Sladek R. The protein kinase PKR: a molecular clock that sequentially activates survival and death programs // EMBO J. 2004. Vol. 23. Р. 1-8.
44. Liu W. -M., Chu W. -M., Choudary P. V., Schmid C. W. Cell stress and translational inhibitors transiently increase the abundance of mammalian SINE transcripts // Nucl. Acids Res. 1995. Vol. 23. Р. 1768-1765.
45. Rubin C. M., Kimura R. H., Schmid C. W. Selective stimulation of translational expression by Alu RNA // Nucl. Acids Res. 2002. Vol. 30. Р. 3253-3261.
46. Allen T. A., von Kaenel S., Goodrich J. A., Kugel J. F. The SINE-encoded mouse B2 RNA represses mRNA transcription in response to heat shock // Nature Struct. Mol. Biol. 2004. Vol. 11. Р. 816-821.
47. Espinoza C. A., Allen T. A., Hieb A. R. B2 RNA binds directly to RNA polymerase II to repress transcript synthesis // Nature Struct. Mol. Biol. 2004. Vol. 11. Р. 822-829.
48. Malathi K., DongB., Gale M. Jr., Silverman R. H. Small self-RNA generated by RNase L amplifies antiviral innate immunity // Nature. 2007. Vol. 448. Р. 816-819.
49. Oren M. Decision making by p53: life, death and cancer // Cell Death Differ. 2003. Vol. 10. Р. 431-42.
50. Ernens I., Goodfellow S. J., Innes F., Kenneth N. S. Hypoxic stress suppresses RNA polymerase III recruitment and tRNA gene transcription in cardiomyocytes Derblay // Nucl. Acids Res. 2006. Vol. 34. Р. 286-294.
51. Kundu T. K., Wang Z., Roeder R. G. Human TFIIIC relieves chromatin-mediated repression of RNA polymerase III transcription and contains an intrinsic histone acetyltransferase activity // Mol. Cell. Biol. 1999. Vol. 19. Р. 1605-1615.
52. Kochanek S., Renz D., Doerfler W. DNA methylation in the Alu sequences of diploid and haploid primary human cells // EMBO J. 1993. Vol. 12. Р. 1141-1151.
53. Vorce R. L., Lee B., Howard B. H. Methylation- and mutation-dependent stimulation of Alu transcription in vitro // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. Vol. 203. Р. 845-851.
54. Banati F., Koroknai A., Salamon D., Takacs M. CpG-methylation silences the activity of the RNA polymerase III transcribed EBER-1 promoter of Epstein-Barr virus // FEBS Lett. 2008. Vol. 582. Р. 705709.
55. Hata K., Sakaki Y. Identification of critical CpG sites for repression of L1 transcription by DNA methylation // Gene. 1997. Vol. 189. Р. 227-234.
56. Steinhoff C., Schulz W. A. Transcriptional regulation of the human LINE-1 retrotransposon L1.2B // Mol. Genet. Genomics. 2003. Vol. 270. Р. 394-402.
57. Li T. -H., Kim C., Rubin C. M., Schmid C. W. K562 cells implicate increased chromatin accessibility in Alu transcriptional activation // Nucl. Acids Res. 2000. Vol. 28. Р. 3031-3039.
Статья поступила в редакцию 17 марта 2011 г.
