CC BY
97
УДК 576.32/.36:577.113
Аналоги Alu- и 7SL РНК подавляют жизнеспособность клеток MCF-7, модулируя транскрипцию генов ответа на стресс эндоплазматического ретикулума
Д. Н. Барякин1*, Д. В. Семенов1, А. В. Савельева1,2, О. А. Коваль1, И. В. Рабинов1,
Е. В. Кулигина1, В. А. Рихтер1
1Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090,
Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8
2Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2 *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 14.08.2013
РЕФЕРАТ Геном человека на 11% состоит из Alu-ретротранспозонов, транскрипция которых РНК-полимеразой III (Pol III) приводит к накоплению от нескольких сотен до тысяч копий Alu-РНК в цитоплазме. Экспрессия Pol III Alu-РНК существенно возрастает при различных стрессах, а повышение уровня Alu-РНК сопровождается подавлением пролиферации, снижением жизнеспособности и индукцией апоптотических процессов в клетках человека. Однако вопрос о биологических функциях Pol III Alu-транскриптов, а также механизм их действия в настоящее время остается открытым. В представленной работе синтезированы аналоги Alu-РНК и ее эволюционного предшественника 7SL РНК. Трансфекция клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 аналогами Alu-РНК и 7SL РНК сопровождается снижением жизнеспособности и индукцией проапоптотических изменений в этих клетках. Анализ совместного действия этих аналогов и актиномицина D или тамоксифена показал, что снижение жизнеспособности клеток MCF-7, трансфицированных Alu-РНК и 7SL РНК, обусловлено модуляцией транскрипции. В результате полнотранскриптомного анализа экспрессии генов установлено, что под действием аналогов и Alu-, и 7SL РНК в клетках MCF-7 усиливается экспрессия генов регулятора транскрипции NUPR1 (p8), а также фактора транскрипции DDIT3 (CHOP). Сделан вывод, что индукция проапоптотических изменений клеток человека под действием аналогов Alu-РНК и 7SL РНК связана с активацией транскрипции генов факторов клеточного стресса, в том числе факторов ответа на стресс эндоплазматического ретикулума. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА Alu-повторы, Alu-РНК, 7SL РНК, клетки аденокарциномы молочной железы человека MCF-7.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ФИТЦ - флуоресцеин-5-изотиоцианат; ЭР - эндоплазматический ретикулум; МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолийбромид; JC-1 - 5,5',6,6'-тетрахлор-1,1',3,3'-тетраэтилбензимидазолкарбоцианин йодид; SRP (signal recognition particle) - сигналраспознающая частица.
ВВЕДЕНИЕ
Геном человека на 45% состоит из мобильных элементов, наиболее многочисленные среди которых А1и-повторы ~1.1 х 106 копий, что составляет 10.6% ядерной ДНК [1, 2]. Во множестве А1и-повторов приматов выделяют несколько подсемейств, объединенных в три основные группы - А1^, AluS и AluY [3]. Копийность представителей эволюционно древних AluJ-повторов, появление которых в геноме оце-
нивается примерно в 80 млн лет, и промежуточных подсемейств - AluS (~40 млн лет), в геноме человека не увеличивается. Повторы подсемейства А1иУ (> 20 млн лет) транспозиционно активны и в настоящее время [4].
Известно, что образование новых копий А1и- и родственных им SINE-повторов в геноме млекопитающих происходит по механизму ретротранспозиции, который включает стадию образования РНК-копий
Б
Рис. 1. Схематическое представление вторичной структуры А1и-РНК (А) и 7SL РНК (Б) в соответствии с данными [12]
SINE-ДНК. Эволюционно значимые изменения генома происходят благодаря «успешным» актам ретротранспозиции повторов в половых клетках [5, 6].
Вместе с тем известно, что как в половых, так и в соматических клетках человека присутствуют РНК-копии геномных Alu-повторов (Alu-РНК)
[7]. Alu-РНК синтезируются РНК-полимеразой III (Pol III) [8] и представляют собой набор РНК-копий «древних», транспозиционно неактивных Alu-повторов подсемейств J и S и транспозиционно активных AluY [7, 9, 10]. Alu-РНК, как и их эволюционный предшественник 7SL РНК, синтезируются в ядре, а затем транспортируются в цитоплазму. Часть Alu-транскриптов при этом подвергается 3'-эндонуклеазному процессингу с образованием укороченных форм - scAlu-РНК, представленных «левыми» мономерами Alu (рис. 1А). Наряду с укороченными Alu-транскриптами в клетках обнаруживают и непроцессированные формы, представленные Alu-РНК, включающей и «левый», и «правый» мономеры, и 3'-концевую поли^-последовательность (рис. 1А) [10, 11]. Количество полноразмерных
Pol III Alu-транскриптов составляет ~ 102-103 молекул на клетку. Регуляция экспрессии Alu-РНК в клетках человека отличается от регуляции других Pol III-транскриптов. Так, ингибитор трансляции ци-клогексимид и тепловой шок увеличивают экспрессию Alu-РНК в большей степени, чем других Pol III-транскриптов, таких, как 7SL, 7SK, 5S и U6 РНК
[8]. Постоянное присутствие полноразмерных Alu-транскриптов в цитоплазме, а также увеличение экспрессии этих РНК при стрессе, с одной стороны, указывает на Alu-РНК как на строго контролируемый эндогенный фактор мутагенеза, а с другой, позволяет предположить, что Alu-РНК являются регуляторами жизненно важных клеточных процессов [12].
Ранее K. Sakamoto и соавт. [13] показали, что трансфекция клеток HeLa ДНК-конструкциями, содержащими транскрипционно активные Alu-повторы, а также конструкциями, кодирующими 7SL РНК, вызывает подавление репликации ДНК, ингибирует трансляцию и оказывает антипролифератив-ное действие. Установлено, что трансфекция клеток HEK 293 почки эмбриона человека ДНК, кодирующей Alu-повторы, приводит к специфической активации экспрессии репортерных генов, предположительно, за счет прямого ингибирования Alu-РНК дцРНК-активируемой протеинкиназы PKR [14]. Позже показали [15], что активация экспрессии репортерного гена в присутствии Alu-РНК обусловлена уменьшением лаг-периода трансляции новосинтезированных мРНК и не связана с ингибированием PKR. Однако новый молекулярный механизм влияния Alu-РНК на инициацию трансляции новосинтезированных мРНК при этом не был предложен.
J. Hasler и K. Strub предположили, что участие Pol III Alu-транскриптов в клеточных процессах связано с их структурным сходством с 7SL РНК (рис. 1) [12, 16]. Как и 7SL РНК, Alu-РНК взаимодействует с белками сигналраспознающей частицы (SRP) [17, 18]. Способность Alu-РНК модулировать трансляцию объясняют взаимодействием с белками SRP9/14: показано, что Alu-РНК активирует трансляцию, а Alu-РНК в комплексе с SRP9/14 ингибирует трансляцию суммарной мРНК клеток HeLa in vitro в экстрактах зародышей пшеницы [16].
В экспериментах in vitro показано, что Alu-РНК непосредственно взаимодействует с каталитической субъединицей РНК-полимеразы II (Pol II) человека и подавляет активность комплекса Pol II-TBP-TFIIB-TFIIF на стадии инициации транскрипции [19, 20]. Эти данные позволили предположить, что Alu-РНК является неспецифическим регулятором транскрипции мРНК в клетках человека [19].
Недавно при изучении молекулярных и клеточных механизмов географической атрофии сетчатки -
одной из основных причин снижения остроты зрения и слепоты у людей старше 50 лет - установлено, что гибель клеток пигментного эпителия сетчатки сопровождается снижением экспрессии гена DICER1 и накоплением в них Pol III AluSc-транскрипта [21]. При этом показано, что ключевой фермент посттран-скрипционного процессинга микроРНК - РНКаза Dicer1 гидролизует Alu-РНК in vitro. Снижение экспрессии DICER1 приводит к накоплению AluSc-РНК, которая, в свою очередь, подавляет жизнеспособность и вызывает апоптотическую гибель клеток эпителия сетчатки [21]. Предложен молекулярный механизм цитотоксического действия Alu-РНК в клетках пигментированного эпителия, который включает в себя генерацию активных форм кислорода митохондриями, активацию NLRP3-инфламмасом, а также активацию MyD88-сигнального каскада [22]. Таким образом, именно увеличение уровня экспрессии Alu-РНК рассматривается в качестве основной причины гибели клеток при географической атрофии сетчатки. Однако нерешенным остается вопрос о причинах, по которым Alu-РНК вызывает образование активных форм кислорода [21, 22].
В настоящей работе синтезированы аналоги AluYa5-РНК и 7SL РНК и проведен сравнительный анализ их влияния на жизнеспособность и активацию проапоптотических процессов в клетках аденокарциномы молочной железы человека MCF-7. Проанализировано также действие на клетки MCF-7 аналогов Alu-РНК и 7SL РНК в сочетании с цитостатиками - ингибиторами репликации, транскрипции, трансляции и клеточного транспорта. Установлено, что проапоптотические процессы, индуцируемые в клетках MCF-7 аналогами Alu-РНК и 7SL РНК, модулируются тамоксифеном и актиномицином D. Результаты полнотранскриптомного анализа изменения экспрессии генов в клетках, трансфицированных аналогами Alu-РНК и 7SL РНК, позволяют предложить новый механизм цитотоксического действия этих РНК, основанный на активации генов ответа на стресс ЭР - NUPR1, DDIT3, FOXRED2 и ASNS.
экспериментальная часть
Реагенты
В работе использовали: МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолийбромид (Sigma, США); Trizol, липофектамин 2000 (Invitrogen, США); Taq-полимеразу, Т7-РНК-полимеразу (Fermentas, США); йодид пропидия, индикатор JC-1, стауроспо-рин (Sigma, США); конъюгат аннексина V с ФИТЦ (BD Pharmingen, США); цисплатин («ЛЕНС-Фарм», Россия); циклогексимид, актиномицин D (Appli-
Chem, ФРГ); интерферон а («Микроген», Россия); метотрексат, монензин (Sigma, США); тамоксифен («Верофарм», Россия); рекомбинантный фактор некроза опухолей а человека (ИМБТ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирск), обратную транскриптазу MoMLV, рибонуклеозидтрифосфаты, дезоксирибо-нуклеозидтрифосфаты, Т4-полинуклеотидкиназу («Биосан», Новосибирск). Дезоксирибоолигонуклео-тиды синтезированы в лаборатории медицинской химии ИХБФМ СО РАН.
Синтез аналогов Alu- и 7SL РНК
Для получения ДНК-матриц - продуктов ПЦР, кодирующих аналоги Alu- и 7SL РНК под промотором РНК-полимеразы фага Т7, геномную ДНК клеток MCF-7 амплифицировали со следующими парами праймеров (строчным шрифтом выделен промотор T7-РНК-полимеразы): AluYa5, chr6:104,183,151-104,183,559: 5'-ATTTGATTCGGTTATTTCCAAGA-3', 5'-atgcagctaatacgactcactataggGAGAGTCTCAGCTA-CAGAATTGAA-3'; 7SL, chr14:50,329,268-50,329,585: 5'-AAGAGACGGGGTCTCGCTAT-3', 5'-atgcagctaa-tacgactcactatagggTTCGCAGCGTCTCCGACC-3'.
ДНК-матрицы очищали с помощью электрофореза в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) в нативных условиях. ДНК элюировали из геля в присутствии 100 мМ NaAc и переосаждали 70% этанолом.
Аналоги AluYa5-РНК и 7SL РНК человека синтезировали в буфере, содержащем 40 мМ Трис-HCl (pH 8.0), 6 мМ MgCl2, 10 мМ Д^, 10 мМ NaCl, 2 мМ спермидина, 2 мМ NTP и 30 ед. акт. РНК-полимеразы фага Т7 при 37°С в течение 2 ч. ДНК-матрицы гидролизовали в присутствии 1 ед. акт. ДНКазы I в течение 40 мин при 37°С, а затем ДНКазу инактивировали, выдерживая 15 мин при 65°С.
Очистку аналогов AluYa5-РНК и 7SL РНК проводили на хроматографической системе Миллихром A2 («Эконова», Россия) с переосаждением 70% этанолом в присутствии 100 мМ NaAc. Первичную структуру аналогов подтверждали с помощью обратной транскрипции РНК, амплификации и секвенирования кДНК по методу Сэнгера на автоматическом секве-наторе ABI 3730XL Genetic Analyser ЦКП СО РАН «Геномика».
Анализ жизнеспособности клеток MCF-7, трансфицированных аналогами Alu- и 7SL РНК
Клетки аденокарциномы молочной железы человека культивировали в среде IMDM с добавлением 10 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина и 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при 37°С в атмосфере 5% СО2. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева.
Клетки MCF-7 культивировали в 96-луночном планшете до достижения плотности 60-70% монослоя. Клетки трансфицировали 1 мкг/мл РНК в комплексе c липофектамином по методике производителя (Invitrogen, США) и инкубировали в течение 24 или 72 ч, как указано в подписях к таблицам. В среду добавляли MTT до конечной концентрации 0.7 мг/мл и инкубировали в течение 45 мин при 37°С. Среду удаляли, MTT-формазан растворяли в изопропиловом спирте и определяли оптическую плотность раствора при к = 570 нм с контролем при к = 620 нм на многоканальном спектрофотометре Apollo 8 LB 912 (Berthold technologies).
Анализ проапоптотических изменений клеток MCF-7 с помощью проточной цитофлуориметрии
Клетки MCF-7, трансфицированные аналогами Alu-и 7SL РНК, и контрольные клетки, инкубированные в среде с липофектамином без РНК, трижды промывали PBS, инкубировали в течение 5 мин при 37оС в присутствии 0.1 мг/мл трипсина. Для анализа изменений клеточной мембраны суспензию клеток инкубировали в присутствии 4.5 мкг/мл йодида пропи-дия и конъюгата аннексина V - ФИТЦ по методике производителя (BD Pharmingen, США). Для анализа изменений трансмембранного потенциала митохондрий (SW) суспензию клеток инкубировали в присутствии 2.5 мкг/мл JC-1. Препараты анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии на приборе Beckman Coulter FC 500 по методу, описанному в работе [23]. В качестве положительного контроля проа-поптотических изменений использовали препараты клеток MCF-7, инкубированных 24 ч в присутствии 5 мкг/мл фактора некроза опухолей а или в присутствии 1 мкМ стауроспорина.
Анализ изменений транскриптома клеток MCF-7 на чипах Illumina
Клетки MCF-7 трансфицировали 1 мкг/мл Alu-РНК либо 1 мкг/мл 7SL РНК и инкубировали в течение 24 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2. В качестве контроля использовали клетки, инкубированные в тех же условиях с липофектамином без РНК. Гибридизацию суммарной РНК клеток MCF-7 на чипах HT-12 Illumina проводили на базе ЗАО «Геноаналитика» (Москва). Дифференциальный анализ изменений экспрессии генов проводили с использованием алгоритма Illumina custom с нормированием данных по методу rank invariant. Для интерпретации результатов дифференциального анализа изменений экспрессии генов использовали транскрипты с параметром Detection_Pval < 0.05. При интерпретации данных об увеличении экспрессии генов под действием Alu-РНК из рассмотрения исключали транскрип-
ты, структура гибридизационных зондов (Illumina PROBE_SEQUENCE) для которых содержит прямые последовательности Alu-повторов.
Выборочную верификацию результатов полно-транскриптомного анализа проводили методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием следующих пар праймеров:
PSPH - 5'-ATGATTGGAGATGGTGCCAC-3', 5'-CAGTGATATACCATTTGGCG-3';
DDIT3 - 5'-GACCTGCAAGAGGTCCTGTC-3', 5'-AAGCAGGGTCAAGAGTGGTG-3';
MTHFD - 5'-TGTAGGACGAATGTGTTTGG-3', 5'-AACATTGCAATGGGCATTCC-3';
TDP1 - 5'-CTCATCAGTTACTTGATGGC-3', 5'-TGACTTCCTTGAAAGCGTCC-3';
ZNF682 - 5'-AAGCCAGAACTGATTAGCCG-3', 5'-AAGGTCTTCAGTGTAATGAG-3';
CEBPG - 5'-CGCTCGGAGTGGAGGCCGCC-3', 5'-CAGGGTGATCAATGGTTTCC-3'.
В качестве нормировочного контроля использовали мРНК GAPDH, HPRT [24].
результаты и обсуждение
Влияние аналогов Alu- и 7SL РНК на жизнеспособность клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7
Действие Alu-РНК и ее эволюционного предшественника 7SL РНК на клетки человека анализировали с использованием аналога Alu-РНК - транскрипта геномного повтора человека AluYa5, а также аналога 7SL РНК человека.
Установлено, что трансфекция клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 аналогами Alu- и 7SL РНК вызывала существенные морфологические изменения: конденсацию цитоплазмы и ядер, разрушение мембранных контактов и открепление клеток от пластиковой подложки. К 72 ч инкубации аналоги Alu- и 7SL РНК вызывали морфологические изменения примерно у 20-30% клеток. При этом инкубация в среде с суммарной РНК MCF-7 или с аналогом фрагмента L1-РНК, или с липофекта-мином без РНК вызывала конденсацию и открепление от подложки не более 5% клеток MCF-7.
Чтобы выяснить, обусловлены ли морфологические изменения, наблюдаемые при воздействии аналогов Alu- и 7SL РНК, антипролиферативными и проапоптотическими процессами, клетки инкубировали с этими аналогами и анализировали их жизнеспособность с помощью MTT-теста.
Из данных, представленных в табл. 1, видно, что аналоги Alu-РНК и 7SL РНК вызывают статистически значимое снижение жизнеспособности клеток MCF-7 в условиях трансфекции с липофектамином
Таблица 1. Влияние аналогов А1и-РНК и 7SL РНК на жизнеспособность, асимметрию, проницаемость цитоплазматической мембраны и трансмембранный потенциал митохондрий клеток MCF-7
РНК* Снижение жизнеспособности (MTT-индекс ± SD, %)** Проапоптотические изменения мембраны*** Трансмембранный потенциал митохондрий 5Ф****, % клеток
AnnV-/PI- AnnV+/PI- AnnV+/PI+ без диссипации с диссипацией
Жизнеспособные клетки, % Апоптотические тельца, % Вторичные некротические клетки, %
7SL РНК 19.0 ± 4.8 69.2 19.3 11.5 83.4 16.6
Alu-РНК 15.3 ± 6.5 68.7 13.8 17.5 85.6 14.4
РНК MCF-7 -2.8 ± 8.2 85.2 7.4 7.3 97.9 2.1
Липофектамин 0 ± 2.5 89.9 6.8 3.3 99.7 0.3
*Клетки трансфицировали 1 мкг/мл РНК в комплексе с липофектамином.
**За 100% принимали жизнеспособность клеток, инкубированных в среде с липофектамином без РНК. ***Изменения мембраны клеток анализировали методом проточной цитофлуориметрии с использованием ан-нексина V (AnnV), меченного ФИТЦ, и йодида пропидия (Р1).
****Диссипацию трансмембранного потенциала митохондрий оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии клеток, окрашенных митохондриальным красителем JC-1 [23].
(p < 0.05). Наблюдаемые морфологические изменения в совокупности со снижением жизнеспособности под действием аналогов Alu- и 7SL РНК указывают на то, что трансфекция этими РНК приводит к про-апоптотическим изменениям клеток.
Для того чтобы независимым методом оценить индукцию проапоптотических процессов в клетках MCF-7 под действием Alu- и 7SL РНК, мы провели анализ изменений трансмембранного потенциала митохондрий 6W с использованием индикатора JC-1. В митохондриях жизнеспособных клеток индикатор JC-1 образует агрегаты со спектром флуоресценции, смещенным в длинноволновую область (X = 590 нм). Диссипация трансмембранного потенциала митохондрий 6W сопровождается сдвигом максимума спектра флуоресценции индикатора в зеленую область (X = 527 нм). Анализ клеточных препаратов ме-
v max ' 11
тодом проточной цитофлуориметрии в присутствии индикатора JC-1 позволяет оценить относительный вклад популяции клеток с проапоптотическими изменениями мембраны митохондрий [23, 25].
Установлено, что снижение жизнеспособности клеток MCF-7 под действием аналога 7SL РНК сопровождается снижением трансмембранного потенциала 6W примерно у 17% клеток (табл. 1). При этом действие 7SL РНК не отличалось от действия аналога Alu-РНК (p > 0.05). Таким образом, данные об изменении потенциала митохондрий 6W согласуются с результатами анализа жизнеспособности с использованием MTT-теста и с оценкой глубины морфологических изменений клеток.
Трансфекция клеток аналогами А1и- и 7SL РНК приводит к появлению постклеточных структур, экспонирующих на внешней поверхности фосфа-тидилсерин, а также структур, мембрана которых проницаема для йодида пропидия - апоптотических и вторичных некротических телец. Суммарный вклад апоптотических и вторичных некротических телец в общую популяцию клеток, трансфицированных аналогом А1и-РНК или аналогом 7SL РНК, составлял около 31% (табл. 1).
Известно, что появление фосфатидилсерина на внешней поверхности цитоплазматической мембраны, детектируемое по окраске аннексином V, является одним из самых ранних биохимических признаков апоптоза [26]. В то же время снижение активности митохондриальных и цитоплазматических оксидоредуктаз и изменение уровня NADH/NADPH, детектируемое с помощью МТТ-теста [27], характерно для поздних стадий апоптоза. Поэтому различия в цитотоксическом действии А1и- и 7SL РНК, оцененные по снижению индекса МТТ (~ 15-19%) и индукции апоптотических процессов по экспозиции фосфатидилсерина и проницаемости цитоплазматической мембраны (~ 31%), можно объяснить большей чувствительностью подхода с использованием системы аннексин V/PI
В целом эти результаты позволяют заключить, что аналоги и А1и-РНК, и 7SL РНК снижают жизнеспособность и индуцируют проапоптотические изменения в субпопуляции клеток MCF-7, а действие аналогов А1и-РНК несущественно отличалось
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 2. Влияние аналогов А1и-РНК и 7SL РНК на жизнеспособность клеток MCF-7 в присутствии цитостатиков
Эффектор (1С40*) Alu(+)-РНК 7SL(+) РНК
MTT-индекс ± SD, %** Р*** MTT-индекс ± SD, %** p***
Цисплатин (9.5 мкM) 25.7 ± 7.7 0.004 20.0 ± 3.5 0.001
Циклогексимид (0.56 мкM) 17.9 ± 6.7 0.010 14.9 ± 7.5 0.026
Интерферон а (400 МЕ/мл) 17.8 ± 7.6 0.022 26.5 ± 7.9 0.009
Метотрексат (33.3 мкM) 11.5 ± 10.2 0.171 26.5 ± 8.4 0.011
Монензин (2.5 пM) 3.8 ± 6.3 0.352 10.8 ± 5.1 0.021
Тамоксифен (450 мкM) -1.2 ± 12.7 0.897 -12.1 ± 12.6 0.244
Актиномицин Б (5.6 нM) 21.5 ± 21.2 0.232 -57.7 ± 22.6 0.031
*Указаны экспериментально подобранные концентрации эффекторов, при которых жизнеспособность клеток снижалась на 40% после инкубации в течение 72 ч (в присутствии липофектамина).
**Дополнительное снижение МТТ-индекса к 72 ч после трансфекции клеток РНК. За 0% принимали жизнеспособность клеток, инкубированных в среде с липофектамином, с эффектором в указанной концентрации и без РНК. ***Значение р для /-критерия Стьюдента.
от действия 7SL РНК на уровне изменения активности цитоплазматических и митохондриальных дегидрогеназ (МТТ-тест), диссипации трансмембранного потенциала митохондрий и по оценке глубины морфологических изменений.
Влияние А1и-РНК и 7SL РНК на жизнеспособность клеток MCF-7 в сочетании с цитостатиками
Ключевые процессы, подавление или активация которых происходит при трансфекции клеток аналогами А1и-РНК и 7SL РНК, мы охарактеризовали по изменению жизнеспособности MCF-7 в условиях совместного действия аналогов и серии цитостатиков (табл. 2). Совместное действие РНК и ингибиторов клеточных процессов анализировали с использованием такой концентрации цитостатиков в культуральной среде, при которой к 72 ч инкубации жизнеспособность клеток MCF-7 снижалась на 40% (1С40).
Из данных табл. 2 видно, что трансфекция клеток аналогами А1и-РНК и 7SL РНК усиливает цитоток-сическое действие: цисплатина на ~25 и 20%; цикло-гексимида на ~ 18 и 15%; интерферона а на ~18 и 27% соответственно (р < 0.05). Таким образом, для этого набора эффекторов трансфекция аналогами А1и-и 7SL РНК оказывала однонаправленное и сравнимое по величине действие на клетки MCF-7.
В основе цитотоксического действия цисплатина лежит образование нерепарируемых сшивок ДНК, подавление репликации и митоза [28]. Аддитивность цисплатина и А1и-РНК или 7SL РНК (табл. 2) прямо указывает на то, что цитотоксическое действие этого
цитостатика и А1и-РНК или 7SL РНК - независимые процессы, а эффекты этих РНК не связаны непосредственно с репликацией ДНК и активацией процессов репарации в клетках MCF-7.
Действие интерферона а основано на рецептор-опосредованной активации транскрипции генов, индуцируемых интерфероном, в том числе и гена протеинкиназы РКГ РКИ, в свою очередь, активируется при взаимодействии с двухцепочечной РНК или с РНК, содержащей протяженные шпильки, и ингибирует синтез белка в клетке путем фосфо-рилирования фактора инициации трансляции е^2 [29]. Поэтому аддитивное действие аналогов А1и-или 7SL РНК и интерферона а, может быть объяснено тем, что эти РНК, обладая развитой вторичной структурой (рис. 1), индуцируют РКИ-зависимое подавление трансляции в клетках, обработанных интерфероном а. С другой стороны, активация РКБ двухцепочечными РНК служит сигналом к индукции каскадов врожденного иммунного ответа клеток и, как следствие, интерфероногенным стимулом [29]. Поэтому РКИ-зависимый механизм действия А1и- и 7SL РНК предусматривает многократное усиление действия интерферона а. В то же время и А1и-, и 7SL РНК вызывают аддитивное снижение MТТ-индекса стимулированных интерфероном клеток, сравнимое со снижением жизнеспособности при сочетании А1и- или 7SL РНК с циклогексими-дом или с действием самих РНК без интерферона а (табл. 1, 2). Кроме того, ранее в ряде работ было показано, что действие А1и-РНК на различные про-
цессы в клетках млекопитающих не связано непосредственно ни с развитой вторичной структурой этих РНК, ни с активацией РКИ [15, 21, 22]. Таким образом, РКИ-зависимый механизм действия структурированных РНК, а также интерфероногенная активность таких РНК только частично объясняет индукцию проапоптотических процессов А1и- и 7SL РНК в клетках MCF-7.
7SL РНК вызывала значимое снижение MТТ-индекса в сочетании с метотрексатом и монензи-ном (р < 0.05), а изменение жизнеспособности клеток при трансфекции А1и-РНК в сочетании с этими цитостатиками не было статистически значимым (табл. 2). При этом снижение MТТ-индекса 7SL РНК в присутствии метотрексата или монензина отличалось от снижения, индуцируемого А1и-РНК в сочетании с этими цитостатиками (р < 0.05). Эти данные показывают, что ингибитор дегидрофолатредук-тазы - метотрексат, и ионофор - монензин, частично подавляют цитотоксическое действие А1и-РНК, но не 7SL РНК.
В препаратах клеток, инкубированных в среде с тамоксифеном, не наблюдалось дополнительного статистически значимого снижения жизнеспособности (р > 0.05) при трансфекции А1и-РНК или 7SL РНК (табл. 2). Поэтому можно заключить, что тамок-сифен частично подавляет цитотоксическое действие и А1и-РНК, и 7SL РНК на клетки MCF-7.
Известно, что тамоксифен ингибирует рецепторы эстрогена, а его действие на клетки MCF-7 обусловлено изменением транскрипции эстрогензависимых генов. Тамоксифен также является эффективным модулятором действия интерферонов. Совместное действие интерферона и тамоксифена синергически снижает жизнеспособность клеток MCF-7 и индуцирует их массовую гибель как в культуре, так и в модели ксенографтов [30, 31]. Поэтому частичное подавление тамоксифеном цитотоксического действия аналогов А1и- и 7SL РНК на клетки MCF-7 подтверждает предположение о том, что влияние этих РНК на жизнеспособность клеток не связано с потенциальными интерфероногенными свойствами этих структурированных РНК.
Актиномицин Б, ДНК-интеркалятор и ингибитор транскрипции и репликации, полностью подавлял цитотоксическое действие аналога 7SL РНК, а А1и-РНК в сочетании с этим цитостатиком не вызывала дополнительного значимого снижения жизнеспособности (табл. 2). Принимая во внимание, что ингибирование репликации цисплатином не снижало действия А1и- и 7SL РНК, можно заключить, что частичная, в случае с А1и-РНК, и полная, в случае с 7SL РНК, отмена их цитотоксического действия актиномицином Б обусловлена влиянием этих РНК
на транскрипцию в клетках человека. Данные о компенсации цитотоксического эффекта А1и- и 7SL РНК модулятором транскрипции тамоксифеном (табл. 2) подтверждают вывод о том, что ключевым элементом механизма действия и А1и-РНК, и ее ближайшего гомолога 7SL РНК на жизнеспособность клеток MCF-7 является модуляция транскрипции ядерной ДНК.
Анализ изменения экспрессии генов в клетках MCF-7 под действием аналогов А1и- и 7SL РНК
Гены, экспрессия которых изменяется под действием аналогов А1и- и 7SL РНК, мы выявляли с помощью полнотранскриптомного анализа РНК клеток MCF-7 на микрочипах Шитта НТ-12. В качестве контроля использовали клетки, инкубированные в среде с ли-пофектамином без РНК.
Установлено, что трансфекция А1и-РНК в клетки MCF-7 приводит к повышению экспрессии 68 транс-криптов в 3 раза и более и к понижению экспрессии 87 транскриптов. Трансфекция клеток 7SL РНК повышала в 3 раза и более уровень 45 генов и понижала уровень 74 генов. В группах транскриптов с повышенной экспрессией выявлено 13 транскриптов, общих для А1и- и 7SL РНК, и 25 общих транскрип-тов обнаружено в группах с пониженной экспрессией. Эти данные показывают, что А1и-РНК и 7SL РНК вызывают изменения различающихся наборов транскриптов и позволяют предположить, что различаются также специфичность влияния, а возможно, и механизмы индукции проапоптотических процессов в клетках человека. Однако детальный анализ изменения экспрессии про- и антиапоптотических факторов позволил выявить ряд ключевых процессов, общих для клеток, трансфицированных как А1и-РНК, так и 7SL РНК.
Из данных, представленных в табл. 3 и 4, видно, что в списке транскриптов, экспрессия которых повышается в наибольшей степени, практически отсутствуют продукты интерферон-индуцируемых генов, таких, как OAS, ISG, №1Т или STAT1 [32]. Кроме того, анализ GO-аннотаций в группе из 68 транскриптов, индуцируемых А1и-РНК, и в группе 45 транскриптов, индуцируемых 7SL РНК, не выявил статистически значимого (р < 10-4) повышения вклада групп генов интерферонового ответа и генов врожденного иммунного ответа (данные не приведены). Эти результаты еще раз подтверждают вывод о том, что индукцию проапоптотических процессов в клетках человека аналогами А1и-РНК и 7SL РНК нельзя объяснить активацией РКИ, взаимодействием с ^И-рецепторами или другим механизмом, связанным с интерфероногенным действием этих РНК.
Среди генов, экспрессия которых повышается под действием и А1и-РНК, и 7SL РНК (табл. 3, 4),
Таблица 3. Транскрипты клеток MCF-7, уровень которых изменяется под действием аналога А1и-РНК
Транскрипт* Идентификатор Относительное изменение экспрессии** Краткое описание
Повышение экспрессии
NUPR1 NM_001042483 5.3 Nuclear protein, transcriptional regulator
PER3 NM_016831 5.1 Period homolog 3 (Drosophila)
TXNIP NM_006472 4.7 Thioredoxin interacting protein
ASNS NM_133436 4.5 Asparagine synthetase, transcript variant 1
ZNF773 NM_198542 4.3 Zinc finger protein 773
FAM119A NM_001127395 4.1 Family with sequence similarity 119, member
ZNF750 NM_024702 4.1 Zinc finger protein 750
PRRT2 NM_145239 4.0 Proline-rich transmembrane protein 2
KCNE4 NM_080671 3.9 Potassium voltage-gated channel
C6ORF48 NM_001040437 3.9 Chromosome 6 open reading frame 48
AUH NM_001698 3.8 AU RNA binding protein
DDIT3 NM_004083 3.8 DNA-damage-inducible transcript 3
KRT81 NM_002281 3.7 Keratin 81
RNASE4 NM_194430 3.6 Ribonuclease, RNase A family 4
FBXO15 NM_152676 3.6 F-box protein 15
FLJ45244*** NM_207443 3.6 DICER1 antisense RNA 1 non-coding RNA
MTHFD2 NM_001040409 3.5 Methylenetetrahydrofolate dehydrogenase
Понижение экспрессии
FOXRED2 NM_024955 0.15 FAD-dependent oxidoreductase domain containing 2
PPRC1 NM_015062 0.19 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator-related 1
CHP NM_007236 0.21 Calcium binding protein P22
PHLDA2 NM_003311 0.21 Pleckstrin homology-like domain, family A, member 2
TMEM158 NM_015444 0.21 Transmembrane protein 158
ATN1 NM_001007026 0.22 Atrophin 1 (ATN1)
DLK2 NM_206539 0.23 Delta-like 2 homolog (Drosophila)
HPS1 NM_182639 0.23 Hermansky-Pudlak syndrome 1
TMEM214 NM_017727 0.23 Transmembrane protein 214
MED24 NM_014815 0.24 Mediator complex subunit 24
PLEC1 NM_000445 0.24 Plectin 1, intermediate filament binding protein 500 kDa
ZYX NM_003461 0.24 Zyxin
ACD NM_022914 0.25 Adrenocortical dysplasia homolog (mouse)
PCDH7 NM_002589 0.25 Protocadherin 7 (PCDH7)
RDH10 NM_172037 0.25 Retinol dehydrogenase 10 (all-trans)
GPX2 NM_002083 0.26 Glutathione peroxidase 2 (gastrointestinal)
*Приведены транскрипты, аннотированные в базе данных RefSeq (accessions NM, NR). Серым выделены транскрипты, экспрессия которых изменилась под действием и Alu-РНК, и 7SL РНК.
**Изменение количества транскрипта в клетках, обработанных Alu-РНК, относительно контрольных клеток, обработанных липофектамином.
***Последовательность зонда HT-12 Illumina для гена FLJ45244 совпадает с последовательностью DICER-AS1 (NR__015415).
Таблица 4. Транскрипты клеток MCF-7, уровень которых изменяется под действием аналога 7SL РНК
Транскрипт* Идентификатор Относительное изменение экспрессии** Краткое описание
Повышение экспрессии
NUPR1 NM_001042483 4.5 Nuclear protein, transcriptional regulator
TXNIP NM_006472 4.3 Thioredoxin interacting protein
PRRT2 NM_145239 4.3 Proline-rich transmembrane protein 2
PSPH NM_004577 4.2 Phosphoserine phosphatase
ASNS NM_133436 3.8 Asparagine synthetase, transcript variant 1
KY NM_178554 3.8 Kyphoscoliosis peptidase
FABP6 NM_001445 3.7 Fatty acid binding protein 6, ileal
DDIT3 NM_004083 3.6 DNA-damage-inducible transcript 3
CTSK NM_000396 3.6 Cathepsin K
KRT81 NM_002281 3.6 Keratin 81
PFAAP5 NM_014887 3.4 Phosphonoformate immuno-associated protein 5
NT5E NM_002526 3.4 5'-Nucleotidase, ecto (CD73)
ARL3 NM_004311 3.4 ADP-ribosylation factor-like 3
ULBP1 NM_025218 3.4 UL16 binding protein 1
BACE2 NM_138992 3.4 Beta-site APP-cleaving enzyme 2
RNASE4 NM_194431 3.3 Ribonuclease, RNase A family 4
Понижение экспрессии
FOXRED2 NM_024955 0.16 FAD-dependent oxidoreductase domain containing 2
GPX2 NM_002083 0.16 Glutathione peroxidase 2 (gastrointestinal)
TUBB2A NM_001069 0.17 Tubulin, beta 2A
PLEC1 NM_000445 0.19 Plectin 1, intermediate filament binding protein
ZC3HAV1 NM_024625 0.20 Zinc finger CCCH-type, antiviral 1
SLC35C1 NM_018389 0.21 Solute carrier family 35, member C1
NCOR2 NM_001077261 0.21 Nuclear receptor co-repressor 2
PIGW NM_178517 0.22 Phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis, class W
MUC1 NM_001044391 0.22 Mucin 1, cell surface associated
OPA3 NM_025136 0.23 Optic atrophy 3 (autosomal recessive, with chorea and spastic paraplegia)
PDPK1 NM_002613 0.23 3-Phosphoinositide dependent protein kinase-1
SLC29A3 NM_018344 0.23 Solute carrier family 29 (nucleoside transporters), member 3
HCFC1 NM_005334 0.24 Host cell factor C1 (VP16-accessory protein)
FAHD1 NM_001018104 0.24 Fumarylacetoacetate hydrolase domain containing 1 (FAHD1)
PARP12 NM_022750 0.24 poly (ADP-ribose) polymerase family, member 12
LRRC14 NM_014665 0.25 Leucine rich repeat containing 14
*Приведены транскрипты, аннотированные в базе данных RefSeq (accessions NM, NR). Серым выделены транскрипты, экспрессия которых изменилась под действием и Alu-РНК, и 7SL РНК.
**Изменение количества транскрипта в клетках, обработанных Alu-РНК, относительно контрольных клеток, обработанных липофектамином.
выделяется NUPR1. Известно, что экспрессия гена транскрипционного регулятора NUPR1 (кодирует белок p8) усиливается в ответ на различные стрессовые воздействия и вызывает устойчивость клеток к химиотерапевтическим средствам, а снижение экспрессии NUPR1 сопровождается подавлением роста раковых клеток in vitro и in vivo [33, 34]. Однако повышение уровня мРНК NUPR1 сопровождает и апоп-тотические изменения раковых клеток [35].
Продукт гена DDIT3 - фактор транскрипции CHOP - ключевой медиатор клеточной гибели в ответ на стресс эндоплазматического ретикулума. Повышение экспрессии этого гена или микроинъекции белка CHOP вызывают диссипацию трансмембранного потенциала митохондрий (SW), генерацию активных форм кислорода и апоптотическую гибель клетки (детально рассмотрено в обзоре [36]). Поэтому наблюдаемое повышение экспрессии гена DDIT3 в клетках MCF-7 под действием аналогов Alu- и 7SL РНК (табл. 3, 4) является существенным проапопто-тическим стимулом. Повышение экспрессии DDIT3 (CHOP) и индукция апоптоза в ответ на стресс эндо-плазматического ретикулума могут вызываться непосредственно активацией гена NUPR1 (p8), как показано в случае индуцируемого канабиноидами апоптоза клеток астроцитомы U87MG [35].
Необходимо отметить, что повышение уровня мРНК DDIT3, а также мРНК PSPH и MTHFD2 в клетках MCF-7 под действием Alu-РНК или 7SL РНК (табл. 3, 4) подтверждено при выборочной проверке результатов полнотранскриптомного анализа независимым методом ОТ-ПЦР (данные не иллюстрированы).
Экспрессия гена FOXRED2 понижается под действием и Alu-, и 7SL РНК (табл. 3, 4). Продукт гена FOXRED2, флавопротеин ERFAD, участвует в перемещении белков из эндоплазматического ретикулума в цитоплазму. Снижение экспрессии этого гена связывают с активацией протеотоксического стресса эндо-плазматического ретикулума [37]. Еще один признак активации ответа на стресс эндоплазматического ре-тикулума - повышение экспрессии гена аспарагинсин-тетазы ASNS, транскрипция которого активируется CCAAT/энхансерсвязывающим белком CHOP [38].
Таким образом, снижение экспрессии FOXRED2, наблюдаемое одновременно с повышением уровня NUPR1 (p8), DDIT3 (CHOP) и ASNS, позволяет заключить, что индукция проапоптотических процессов в клетках MCF-7 под действием Alu- и 7SL РНК связана с модуляцией транскрипции ключевых клеточных факторов ответа на стресс эндоплазматиче-ского ретикулума.
Недавно был предложен новый механизм развития географической атрофии сетчатки, основанный
на снижении экспрессии DICERl в клетках эпителия, который приводит к усилению экспрессии Alu-РНК [21]. Субретинальная трансфекция клеток конструкцией, кодирующей 7SL РНК, а также аналогом 7SL РНК не приводила к дегенерации пигментного эпителия сетчатки мыши, в отличие от трансфекции Alu-РНК [21, 22]. Высказано предположение, что цитотоксическое действие Alu-РНК на клетки пигментного эпителия сетчатки связано с неустановленными свойствами Alu-РНК, а механизм действия - с генерацией активных форм кислорода митохондриями [22].
Полученные нами данные показывают, что и Alu-, и 7SL РНК вызывают сравнимые изменения трансмембранного потенциала митохондрий клеток MCF-7 (табл. l). Следовательно, по крайней мере в клетках MCF-7, и Alu-, и 7SL РНК индуцируют близкие по глубине изменения мембраны митохондрий. При анализе влияния Alu- и 7SL РНК в сочетании
Апоптоз
т
Рис. 2. Схема предполагаемого механизма индукции проапоптотических процессов в клетках MCF-7, трансфицированных аналогами Alu- и 7SL РНК. Трансфекция клеток аналогами Alu- и 7SL РНК сопровождается увеличением экспрессии гена регулятора транскрипции NUPR1 (p8), который активирует транскрипцию DDIT3 (CHOP) [35]. Увеличение экспрессии фактора транскрипции DDIT3 вызывает апоптотические изменения внешней мембраны митохондрий по механизму, включающему понижение транскрипции BCL-2 и активацию транскрипции BIM. Апоптоз, индуцируемый CHOP (DDIT3), сопровождается генерацией активных форм кислорода (АФК) [36]. Увеличение экспрессии DDIT3 может происходить в ответ на стресс эндоплазмати-ческого ретикулума, вызванного взаимодействием аналогов Alu- и 7SL РНК с белками SRP, - нарушением транспорта белков через мембрану ЭР. Стресс эндо-плазматического ретикулума сопровождается повышением экспрессии гена аспарагинсинтетазы (ASNS), транскрипция которого активируется CHOP [38]
с актиномицином D и тамоксифеном на жизнеспособность клеток MCF-7 установлено, что цитотокси-ческое действие этих РНК обусловлено модуляцией транскрипции. Данные об изменении экспрессии генов (табл. З, 4) показывают, что трансфекция клеток аналогами Alu-РНК или 7SL РНК сопровождается не только неспецифическим ответом на экзогенную РНК - увеличением уровня мРНК рибонуклеазы RNASE4 и 5'-эктонуклеотидазы NT5E, но и появлением проапоптотических стимулов: NUPR1, DDIT3, FOXRED2. При этом экспрессия гена NUPR1 индуцируется в ответ на широкий спектр стрессовых воздействий, а DDIT3 и FOXRED2 специфически связаны с ответом на стресс эндоплазматическо-го ретикулума. Продукт гена DDIT3 - белок CHOP, является ключевым индуктором апоптоза в ответ на протеотоксический стресс ЭР. Полученные нами данные позволяют предложить механизм проапопто-тического действия Alu- и 7SL РНК, который включает в себя активацию транскрипции NUPR1 (p8) и проапоптотического гена DDIT3, продукт которого CHOP индуцирует апоптоз по митохондриальному пути в субпопуляции клеток MCF-7 (рис. 2).
Поскольку 7SL РНК является компонентом сиг-налраспознающей частицы, а Alu-РНК способна взаимодействовать с белками SRP9/14, можно предположить, что активация аналогами Alu- и 7SL РНК ответа на стресс эндоплазматического ретикулума обусловлена нарушением функционирования именно этого компонента трансляционного аппарата клеток человека.
заключение
Ранее было установлено, что увеличение экспрессии А1и-РНК в клетках человека вызывает подавление репликации ДНК, ингибирует трансляцию и оказывает антипролиферативное действие. Полученные нами данные указывают на то, что ключевой процесс, опосредующий снижение жизнеспособности клеток аденокарциномы человека MCF-7 под действием аналогов как А1и-РНК, так и 7SL РНК, - транскрипция ядерной ДНК. При этом не происходит активации экспрессии интерферон-индуцибельных генов. В то же время трансфекция клеток MCF-7 А1и-РНК или 7SL РНК сопровождается изменением экспрессии ряда генов, в том числе NUPR1, DDIT3, FOXRED2 и ASNS. Известно, что изменение транскрипции этих генов ассоциировано с комплексным ответом клетки на стресс ЭР, который способен индуцировать образование активных форм кислорода и гибель клетки по митохондриальному пути апоптоза. Предположительно активация ответа на стресс ЭР под действием аналогов А1и- и 7SL РНК связана с нарушением функционирования в клетках SRP.
В целом полученные нами результаты, а также опубликованные данные показывают, что А1и-РНК является не только маркером, но и медиатором сигналов клеточного стресса.
Работа поддержана РФФИ (грант № 13-04-01058), междисциплинарным интеграционным проектом Президиума СО РАН № 84 (2012-2014 гг.).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. International Human Genome Sequencing Consortium // Nature. 2001. V. 409. № 6822. P. 860-921.
2. Deininger P.L., Batzer M.A. // Genome Res. 2002. V. 12. № 10. P. 1455-1465.
3. Batzer M.A., Deininger P.L., Hellmann-Blumberg U., Jurka J., Labuda D., Rubin C.M., Schmid C.W., Zietkiewicz E., Zuckerkandl E. // J. Mol. Evol. 1996. V. 42. № 1. P. 3-6.
4. Jurka J., Krnjajic M., Kapitonov V.V., Stenger J.E., Kokhanyy O. // Theor. Popul. Biol. 2002. V. 61. № 4. P. 519-530.
5. Dewannieux M., Esnault C., Heidmann T. // Nat. Genet. 2003. V. 35. № 1. P. 41-48.
6. Batzer M.A., Deininger P.L. // Nat. Rev. Genet. 2002. V. 3. № 5. P. 370-379.
7. Liu W.M., Maraia R.J., Rubin C.M., Schmid C.W. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. № 6. P. 1087-1095.
8. Liu W.M., Chu W.M., Choudary P.V., Schmid C.W. // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. № 10. P. 1758-1765.
9. Shaikh T.H., Roy A.M., Kim J., Batzer M.A., Deininger P.L. // J. Mol. Biol. 1997. V. 271. № 2. P. 222-234.
10. Maraia R.J., Driscoll C.T., Bilyeu T., Hsu K., Darlington G.J. // Mol. Cell Biol. 1993. V. 13. № 7. P. 4233-4241.
11. Sarrowa J., Chang D.Y., Maraia R.J. // Mol. Cell Biol. 1997.
V. 17. № 3. P. 1144-1151.
12. Hasler J., Strub K. // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. № 19.
P. 5491-5497.
13. Sakamoto K., Fordis C.M., Corsico C.D., Howard T.H., Howard B.H. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. № 5. P. 3031-3038.
14. Chu W.M., Ballard R., Carpick B.W., Williams B.R., Schmid C.W. // Mol. Cell Biol. 1998. V. 18. № 1. P. 58-68.
15. Rubin C.M., Kimura R.H., Schmid C.W. // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. № 14. P. 3253-3261.
16. Hasler J., Strub K. // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. № 8.
P. 2374-2385.
17. Bovia F., Wolff N., Ryser S., Strub K. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. № 2. P. 318-326.
18. Chang D.Y., Hsu K., Maraia R.J. // Nucleic Acids Res. 1996.
V. 24. № 21. P. 4165-4170.
19. Mariner P.D., Walters R.D., Espinoza C.A., Drullinger L.F., Wagner S.D., Kugel J.F., Goodrich J.A. // Mol. Cell. 2008. V. 29. № 4. P. 499-509.
20. Yakovchuk P., Goodrich J.A., Kugel J.F. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. № 14. P. 5569-5574.
21. Kaneko H., Dridi S., Tarallo V., Gelfand B.D., Fowler B.J., Cho W.G., Kleinman M.E., Ponicsan S.L., Hauswirth W.W., Chiodo V.A., et al. // Nature. 2011. V. 471. № 7338. P. 325-330.
22. Tarallo V., Hirano Y., Gelfand B.D., Dridi S., Kerur N., Kim Y., Cho W.G., Kaneko H., Fowler B.J., Bogdanovich S., et al. // Cell. 2012. V. 149. № 4. P. 847-859.
23. Galluzzi L., Vitale I., Kepp O., Seror C., Hangen E., Perfettini J.L., Modjtahedi N., Kroemer G. // Methods Enzymol. 2008.
V. 442. P. 355-374.
24. Stepanov G.A., Semenov D.V., Savelyeva A.V., Kuligina E.V., Koval O.A., Rabinov I.V., Richter V.A. // Biomed. Res. Int. 2013. V. 2013. ID 656158.
25. Kroemer G., Galluzzi L., Brenner C. // Physiol. Rev. 2007.
V. 87. № 1. P. 99-163.
26. Demchenko A.P. // Exp. Oncol. 2012. V. 34. № 3. P. 263-268.
27. Berridge M.V., Herst P.M., Tan A.S. // Biotechnol. Annu. Rev. 2005. V. 11. P. 127-152.
28. Siddik Z.H. // Oncogene. 2003. V. 22. № 47. P. 7265-7279.
29. Balachandran S., Barber G.N. // Meth. Mol. Biol. 2007. V. 383. P. 277-301.
30. Lindner D.J., Kolla V., Kalvakolanu D.V., Borden E.C. // Mol. Cell Biochem. 1997. V. 167. № 1-2. P. 169-177.
31. Iacopino F., Robustelli della Cuna G., Sica G. // Int. J. Cancer. 1997. V. 71. № 6. P. 1103-1108.
32. Der S.D., Zhou A., Williams B.R., Silverman R.H. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. № 26. P. 15623-15628.
33. Goruppi S., Iovanna J.L. // J. Biol. Chem. 2010. V. 285. № 3.
P. 1577-1581.
34. Guo X., Wang W., Hu J., Feng K., Pan Y., Zhang L., Feng Y. // Anat. Rec. (Hoboken). 2012. V. 295. № 12. P. 2114-2121.
35. Carracedo A., Lorente M., Egia A., Blazquez C., Garcia S., Giroux V., Malicet C., Villuendas R., Gironella M., Gonzalez-Feria L., et al. // Cancer Cell. 2006. V. 9. № 4. P. 301-312.
36. Tabas I., Ron D. // Nat. Cell Biol. 2011. V. 13. № 3. P. 184-190.
37. Riemer J., Appenzeller-Herzog C., Johansson L., Bodenmiller B., Hartmann-Petersen R., Ellgaard L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. № 35. P. 14831-14836.
38. Siu F., Chen C., Zhong C., Kilberg M.S. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 51. P. 48100-48107.
