CC BY
295
ОБЗОРЫ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ... 107
УДК 575.117.2:616-006.04
А.М. Дейчман, С.В.Зиновьев, А.Ю. Барышников ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ И МАЛЫЕ РНК В ОНКОЛОГИИ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация:
Дейчман Александр Маркусович, с.н.с. группы биофизики неионизирующих излучений РОНЦ.
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе 24; тел. +7(499)611-82-10 e-mail: biotherapy [email protected]
Статья поступила: 25.09.2009 г., принята к печати: 23.09.2009 г.
Резюме
В статье представлена роль малых РНК, контролирующих большинство жизненно важных функций клетки и организма, и возможная связь их, в частности, с онкогенезом и другими (включая гипотетические) внутриклеточными механизмами геномной экспрессии.
Ключевые слова: малые РНК, интерференция РНК (РНКи), двунитевая РНК (днРНК), редактирование РНК, онкогенез.
A.M. Deichman, S.V.Zinoviev, A.Yu.Baryshnikov.
THE GENE EXPRESSION AND SMALL RNAS IN ONCOLOGY N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
Abstract
In the paper role of small RNAs supervising the majority vital functions of cell and organism and possible connection of them in particular with oncogenesis and others (including hypothetical) intracellular mechanisms of genome expression is submitted.
Key words: Small RNAs, interference RNAs (RNAi), double strand RNAs (dsRNAs), RNA editing, tumorogenesis.
Введение
Экспрессия отдельных генов и целых геномов эукариот, включая процессинг, различные виды транскрипции, сплайсингов, перестановок, редактирования РНК, рекомбинаций, трансляцию, интерференцию РНК, регулируется некоторыми белками (продуктами регуляторных, структурных, гомеозис-ных генов, транскрипционными факторами), подвижными элементами, РНК и низкомолекулярными эффекторами. Среди процессирующих РНК - рРНК, тРНК, мРНК, некоторые виды регуляторных РНК и малые РНК.
К настоящему времени известно, что малые РНК не кодируют белок, часто исчисляются сотнями на геном и участвуют в регуляции экспрессии различных эукариотических генов (соматических, иммунных, герминативных, стволовых клеток).
Под контролем оказываются процессы диф-ференцировки (гематопоэз, ангиогенез, адипогенез, миогенез, нейрогенез), морфогенеза (включая эмбриональные стадии, развитие и рост, физиологическую регуляцию), пролиферации, апоптоза, канцерогенеза, мутагенеза, иммуногенеза, старения (продления жизни), эпигенетического сайленсинга [3; 8; 21; 23; 38; 36; 46; 52; 83]; отмечены случаи метаболической регуляции (например, гликолипосфинголипи-дов [32]).
Более широкий класс некодирующих РНК в 20-300/500 нуклеотидов и их РНП обнаружены не только в ядре, ядрышке и цитоплазме [10], но и в ДНК-содержащих клеточных органеллах (митохондриях животных [ibid.]; у растений найдены микро-РНК [16] и консенсусные к транскриптам хлоропла-стов последовательности малых РНК [75]).
Для управления и регуляции в.н. процессами
важно:
1. Небольшие по размерам естественные и искусственные РНК (малые РНК, тРНК, по-добн.) и их комплексы с белками (РНП) способны к чрезмембранному клеточному и митохондриальному транспорту [6; 10; 71];
2. После распада митохондрий часть их содержимого, РНК и РНП, могут оказаться в цитоплазме и ядре. Перечисленные свойства малых РНК (РНП), функционально значимая роль которых в процессе изучения только увеличивается, очевидно, имеют связь с фактором настороженности в отношении рака и других генетических заболеваний [72].
Одновременно прояснилась высокая значимость эпигеномных модификаций хроматина при возникновении опухолей [95]. Мы рассмотрим только очень ограниченное число случаев из множества подобных.
Малые РНК
Механизм действия малых РНК состоит в способности их почти комплементарно связыватьтся с З'-нетранслируемыми областями (3'-НТО) мРНК-мишеней (которые иногда содержат ДНК- и РНК-транспозирующие MIR/LINE-2-элементы, а также консервативные А/и-повторы) и вызывать интерференцию РНК (РНКи); в частности, при антивирусном ответе) [89]. Осложнение, однако, в том, что кроме клеточных существуют и вирус-кодируемые малые РНК (герпеса, 8У40, др.; ЕВУ, например, содержит 23, а К8ИУ - 12 miRNAs [8]), взаимодействующие с транскриптами и вируса и хозяина.
Одних только клеточных и вирусных miRNAs известно более 5 тысяч у 58 видов [8]. РНКи инициирует либо деградацию (с участием комплекса RISC, RNA-Induced Silencing Complex) по уязвимым для нуклеаз фрагментам непрерывных спиралей днРНК (двунитевых РНК мРНК, др.), либо частично обратимое ингибирование прерывисто спирализо-ванных днРНК при трансляции мРНК-мишеней. Зрелые малые РНК (~15-28 нуклеотидов) образуются в цитоплазме из своих, процессирующих в ядре, предшественников различной длины (в десятки и сотни нуклеотидов) [33]. Кроме того, малые РНК участвуют в формировании сайленсиноговой структуры хроматина, регуляции транскрипции отдельных генов, подавлении экспрессии транспозонов и поддержании функциональной структуры протяженных участков гетерохроматина [7].
Различают несколько основных видов малых РНК. Наиболее хорошо изучены микро-РНК (miRNAs) и малые интерферирующие РНК (siRNAs). Кроме того, среди малых РНК изучаются: активные в герминативных клетках piRNAs [82; 84]; малые интерферирующие РНК, ассоциированные с эндогенными ретротранспо-зонами и повторяющимися элементами (при локальной и глобальной гетерохроматинизации - начиная с ранних стадий эмбриогенеза; поддерживают уровень те-ломер), rasiRNAs дрозофилы [96]; часто кодируемые интронами белковых генов и функционально важные при трансляции, транскрипции, сплайсинге (метилировании и деметилировании, псевдоуридилировании нуклеиновых кислот) малые ядерные (snRNAs) и ядрышковые (snoRNAs) РНК [103]; комплементарные ДНК-связывающим NRSE-(Neuron Restrictive Silencer Ele-тей)-мотивам малые модуляторные РНК, smRNAs, с малоизвестными функциями [56]; трансактивирующие малые интерферирующие РНК растений, tasiRNAs [33]; короткие шпилечные РНК, shRNAs, обепечиваю-щие долговременную РНКи (устойчивый генный сай-ленсинг) длинных днРНК-структур при антивирусном ответе у животных [77].
Малые РНК (miRNAs, siRNAs, др.) взаимодействуют с новосинтезируемыми транскриптами ядра и цитоплазмы (регулируя сплайсинг, трансляцию мРНК; метилирование и псевдоуридилирование рРНК, др.) и хроматина (при временно-локальной и эпигенетически наследуемой гетерохроматинизации делящихся соматических герминативных клеток) [8]. Гетерохроматинизация, в частности, сопровождается метилированием и деметилированием ДНК, а также метилированием, ацетилированием, фосфорилиро-ванием и убиквитинированием гистонов (модификация «гистонового кода») [1].
Первыми среди малых РНК были обнаружены и исследованы miRNAs нематоды Caenorhabditis elegans (lin-4), их свойства и гены [63; 100], а несколько позже - miRNAs растения Arabidopsis thaliana [16]. В настоящее время их связывают с многоклеточными организмами [88], хотя они показаны у одноклеточной водоросли Chlamydomonas reinhardtii [111], а РНКи-подобные пути сайленсинга, в связи с противовирусной защитой с участием т.н. psiRNAs, обсуждаются для прокариот [45]. Геномы многих эукариот (в том числе дрозофилы, человека) содержат несколько сотен генов miRNAs. Эти стадио- и тканеспецифичные гены (как и соответствующие им участки мРНК-мишеней) часто высокогомологичны у филогенетически отдаленных видов, но некоторые из них - линиоспецифичны [39]. miRNAs содержатся в экзонах (белок-кодирующих, РНК-генов), интронах (чаще всего пре-мРНК), межгенных спейсерах (включая повторы), имеют длину до 70-120 нуклеотидов (и
более) и формируют шпилечные структуры типа петля-стебель [51]. Для определения их генов используют не только биохимические и генетические, но и компьютерные подходы [88].
Наиболее характерная длина «рабочего участка» зрелых miRNAs - 21-22 нуклеотида. Возможно, это самые многочисленные среди не кодирующих белки генов. Они могут располагаться в виде отдельных копий (чаще) или кластеров, содержащих множество сходных или различных генов miRNAs, транскрибирующихся (нередко с автономных промоторов) в виде более длинного предшественника, процессируемого в несколько стадий до индивидуальных miRNAs [106]. Предполагают, что существует регуляторная miRNA-сеть, контролирующая множество фундаментальных биологических процессов (включая онкогенез и метастази-рование); вероятно, не менее 30% экспрессируемых генов человека регулируются miRNAs [64].
В этом процессе участвуют днРНК-специфи-ческие РНКаза-Ш-подобные ферменты Drosha (ядерная рибонуклеаза; инициирует процессинг интронных пре-miRNAs после сплайсинга основного транскрипта) и Dicer, функционирующий в цитоплазме и расщепляющий и деградирующий, соответственно, шпилечные пре-miRNAs (до зрелых miRNAs) и образуемые позже гибридные miRNAs-мРНК структуры. Малые РНК, вместе с несколькими белками (включая в.н. РНКазы, белки AGO-семейства, трансметилазы и ацетилазы, др.) и с участием т.н. RISC- и RITS-подобных комплексов (второй - индуцирует транскрипционный сайленсинг), способны, соответственно, вызывать РНКи и деградацию и последующий генный сайленсинг на РНК- (до и во время трансляции) и ДНК- (при транскрипции гетерохроматина) уровнях.
Каждая miRNA потенциально спаривается со множеством мишененй, а каждая мишень - контролируется рядом miRNAs [88] (что напоминает gRNAs-опосредуемое редактирование пре-мРНК в кинетопластах трипаносом). Анализ in vitro показал, что miRNAs-регуляция (как и редактирование РНК)
- ключевой посттранскрипционный модулятор экспрессии генов. Сходные miRNAs, конкурирующие за одну мишень - потенциальные трансрегуляторы РНК-РНК и РНК-белковых взаимодействий.
У животных miRNAs наиболее хорошо изучены для нематоды Caenorhabditis Elegans; описано более 112 генов. Здесь обнаружены и тысячи эндогенных siRNAs (генов нет; связаны, в частности, со сперматогенез-опосредуемыми транскриптами и транспозонами [80]). Обе малых РНК многоклеточных могут генерироваться РНК-полимеразами, про-явлющими активность (не гомологию) RdRP-II (как для большинства других РНК) и RdRP-III типов [62]. Зрелые малые РНК схожи по составу (влючая концевые 5'-фосфаты и З'-ОН), длине (обычно 21-22 нуклеотида) и функции, и могут конкурировать за одну мишень [107]. Однако РНК-деградацию, и при полной комплементарности мишени, чаще ассоциируют с siRNAs; трансляционную репрессию, при частичной, обычно в 5-6 нуклеотидов, комплементарности - с miRNAs; а предшественники, соответственно, экзо- и эндогенные (в сотни и тысячи нуклеотидов) для siRNAs, и обычно эндогенные (в десятки и сотни нуклеотидов) для miRNAs [29; 107] и биогенез у них различны [33]; впрочем, в некоторых системах эти различия обратимы. РНКи, опосредуемая siRNAs- и miRNAs, имеет разнообразные естественные роли: от регуляции экспрессии генов и гетерохроматина - до защиты генома против транспозонов и вирусов; но siRNAs и часть miRNAs не консервативны между видами.
У растений (Arabidopsis thaliana) обнаружены: siRNAs, соответствующие как генам, так и меж-генным (включая спейсеры, повторы) областям; огромное число потенциальных сайтов генома для различных типов малых РНК [68]. У нематод открыты также т.н. изменчивые автономно экспрессируемые 21У-РНК (dasRNAs); они имеют 5'-У-моно-фосфат, составляют 21 нукдеотид (20 из них изменчивы), и располагаются между или внутри интронов белок-кодирующих генов по более чем 5700 сайтам двух областей IV хромосомы [80].
MiRNAs играют важную роль при экспрессии генов в норме и патологии; у человека - не менее 450-500 таких генов [8]. Связываясь обычно с З'-НТО-областями мРНК (др. мишенями), они могут избирательно и количественно (в частности, при выведении из оборота продуктов низкоэкс-прессируемых генов [88]), блокировать работу одних и активность других генов. Оказалось, что наборы профилей экспрессируемых микро-РНК (и их мишеней) динамически меняются в процессе онтогенеза, дифференцировки клеток и тканей. Эти изменения специфичны, в частности, при кардиогенезе [88], процессе оптимизации размеров длины ден-дритов и числа синапсов нервной клетки (с участием miRNA-134, др. малых РНК) [73], развитии многих патологий (онкогенезе, иммунодефицитах [28], генетических заболеваниях [34], паркинсонизме [98], болезни Альцгеймера [48], офтальмологических нарушениях (ретинобластома [27], др.), связа-ных с инфекциями различной природы [87]). Общее число обнаруживаемых miRNAs растет много быстрее, чем описание их регуляторной роли и связи с конкретными мишенями.
Компьютерный анализ предсказывает сотни мРНК-мишеней для отдельных miRNAs [88] и регуляцию индивидуальных мРНК множеством miRNAs. Таким образом, miRNAs могут служить целям элиминации транскриптов генов-мишеней, либо тонкой настройки их экспрессии на транскрипционном и трансляционном уровнях. Теоретическое рассмотрение и экспериментальные результаты подтверждают существование разнообразных ролей miRNAs.
Более полный перечень аспектов, связанных с фундаментальной ролью малых РНК у эукариот в процессах роста и развития и при некоторых патологиях (включая эпигеномику рака), отражены в обзоре [8].
Малые РНК в Онкологии
Процессы роста, развития, прогрессии и мета-стазирования опухолей сопровождаются множеством эпигенетических изменений, перерастающих в более редкие стойко-наследемые генетические изменения [8]. Редкие мутации, однако, могут иметь большой вес (для конкретных индивида, нозологии), т.к. в отношении отдельных генов (например, APC, K-ras, p53) возможен т.н. эффект «воронки», связанный с почти необратимыми развитием и последствиями онкозаболеваний. Опухолеспецифическая [58] в отношении профиля экспрессии различных генов (белков, РНК, малых РНК) гетерогенность клеток-предшественни-ков обусловливается сопряженными вариациями перестраиваемых эпигеномных структур. Эпигеном модулируется метилированием, посттрансляционны-ми модификациями и заменами гистонов (на неканонические), ремоделингом нуклеосомной структуры генов и хроматина (включая геномный импринтинг, т.е. дисфункцию экспрессии аллелей родительских генов и Х-хромосом). Все это, и с участием РНКи, регулируемой малыми РНК, ведет к появлению де-
фектных гетерохроматиновых (включая гипометили-рованные центромерные [40]) структур [8].
Формированию ген-специфических мутаций может предшествовать известное накопление сотен тысяч соматических клональных мутаций в простых повторах или микросателлитах некодирующей (редко - кодирующей) области - по крайней мере в опухолях с микросателлитным мутаторным фенотипом (ММФ) [52; 79]; они составляют значительную часть раков толстой и прямой кишки, а также раков легких, желудка, эндометрия, др. Нестабильные моно- и гетеронуклеотидные микросателлитные повторы (поли-А6-10, подобн.) содержатся во много раз чаще в контролирующих экспрессию генов регуляторных некодирующих (интроны, межгенно), чем в кодирующих (экзоны) областях генома микросателлит-нестабильных, MSI+, опухолей.
Хотя природа появления и механизмы локализации MS-стабильных и нестабильных областей до конца неясны, формирование MS-нестабильности коррелировало с частотой мутаций множества ранее не мутирующих в MS^-опухолях генов [52; 79] и, вероятно, канализировало пути их прогрессии; причем частота мутаций MSI-повторов в этих опухолях увеличивалась более чем на два порядка [52; 79]. Не все гены проанализированы на наличие повторов, но степень мутабильности их в кодирующих и некодирующих областях различна, а точность методов определения частоты мутаций - относительна [52; 79]. Важно, что некодирующие области по MSI-мута-бильным повторам часто биаллельны, а кодирующие
- моноаллельны [79].
Глобальное снижение метилирования в опухолях характерно для повторов [49], мобильных элементов (МЭ; их транскрипция увеличивается), промоторов, CpG-сайтов опухолесупрессорных miRNA-генов и коррелирует с гипертранскрипцией ретротранс-позонов в клетках прогрессирующих раков [86]. В норме колебания «метилома» связаны с родительско-и стадиоспецифическими , а также тканеспецифическими «волнами метилирования» и сильным метилированием центромерных сателлитных участков гетерохроматина, регулируемых малыми РНК.
При недометилировании сателлитов формируемая нестабильность хромосом сопровождается усилением рекомбинации [54], а нарушение метилирования МЭ может запускать их экспрессию [23]. Эти факторы благоприятствует развитию опухолевого фенотипа. Терапия малыми РНК может быть высокоспецифичной, но должна быть контролируемой, т.к. мишенями могут оказаться не только отдельные, но и множество мРНК/РНК молекул, и новосинтезируе-мые РНК различных (включая некодирующие меж-генные повторы) областей хромосом [8].
Большую часть генома человека составляют повторы и МЭ. Ретротранспозон LI (LINE-элемент) содержит, как и эндогенные ретровирусы, ревертазу (RTase), эндонуклеазу и потенциально способен переносить неавтономные (Alu, SVA, др.) ретроэлементы [17]; сайленсинг LI-подобных элементов осуществляется в результате метилирования по CpG-сайтам [57].
Заметим, что среди CpG-сайтов генома слабо метилированы CpG-островки промоторов генов, а сам 5-метилцитозин - потенциально мутагенное основание, дезаминируемое в тимин [57] (химически, или при участии редактирования РНК/(ДНК), репарации ДНК); однако некоторые из CpG-островков подвержены избыточному аберрантному метилированию, сопровождаемому репрессией генов-супрессоров и развитию рака [38; 57].
108 ОБЗОРЫ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ...
Далее: РНК-связывающий белок, кодируемый L1, взаимодействуя с белками AGO2 (семейства Argonaute) и FMRP (fragile mental retardation, белок эффекторного RISC-комплекса [43]), способствует перемещению Ll-элемента - что указывает на возможную взаиморегуляцию систем РНКи и ретропозиции LINE-элементов человека. Важно, в частности, что Alu-повторы способны перемещаться в область интрон-экзонного пространства генов [8; 30].
Эти и подобные механизмы могут усиливать патологическую пластичность генома опухолевой клетки. Подавление RTase (кодируемой, как и эндонуклеаза, элементами Ll; RTase также кодируется и эндогенными ретровирусами) по механизму РНКи сопровождалось снижением пролиферации и усилением дифференцировки в ряде раковых клеточных линий [92]. При внедрении L1 элемента в протоонкоген или супрессорный ген наблюдали двунитевые разрывы ДНК [99].
В тканях зародышевого пути (мышей, человека) уровень экспрессии L1 повышен, а его метилирование зависело от piRNAs-(26-30-п.о.)-связанной системы сайленсинга, где PIWI-белки - варианты большого семейства белков Argonaute, мутации в которых ведут к деметилированию и дерепрессии Ll-подобных элементов с длинными концевыми повторами. С PIWI-белками же в большей степени, чем с Dicer-1/2 и Ago-белками, связаны пути сайленсинга rasiRNAs [96].
Опосредуемые piRNAs и siRNAs пути сайленсинга реализуются через внутриядерные тельца, содержащие крупные эволюционно-консервативные мультибелковые РсG-комплексы, функции которых в опухолевых клетках часто нарушаются. Эти комплексы отвечают за даль-нодействие (через более чем 10 тысяч пар оснований, в том числе между хромосомами) [85] и регулируют кластер генов HOX, ответственных за план строения тела [8; 81].
Новые принципы антисенс-терапии могут развиваться с учетом знаний о более высокоспецифичных (чем гистонмодифицирующие ингибиторы метилирования ДНК/белков) противоопухолевых эпигеномных агентах, фундаментальных основ эпи-геномного РНК-сайленсинга и роли малых РНК в канцерогенезе [8].
Микро-РНК в Онкологии
Известно, что усиление опухолевого роста и метастазирования могут сопровождаться повышением одних и понижением экспрессии других индивидуальных/наборов miRNAs (табл.). Некоторые из них могут иметь причинную роль в онкогенезе; и даже одни и те же miRNAs (как miR-21/-24) в разных опухолевых клетках могут проявлять как онкогенные, так и супрессирующие свойства. Каждый тип злокачественных опухолей человека хорошо различим своим «miRNA-отпечатком», и некоторые miRNAs могут функционировать как онкогены, опухолевые супрессоры, инициаторы клеточной миграции, инвазии, метастазирования [8]. В патологически измененных тканях часто обнаруживают пониженное количество ключевых miRNAs, вероятно включенных в системы противораковой зашиты. Участвующие в онкогенезе miRNAs (miRs) сформировали представление о т.н. «онкомирах» [8; 37]: анализ экспрессии более 200 miRNAs свыше 1000 образцов лимфом и солидных раков позволил успешно классифицировать опухоли на подтипы по их происхождению и стадии диффе-ренцировки [14]. Функции и роль miRNAs успешно изучают с помощью: анти-miR-олигонуклеотидов, модифицированных (для увеличения времени жизни) по 2'-О-метильным [24] и 2'-О-метоксиэтильным группам [36]; а также LNA-олигонуклеотидов, в которых кислородные атомы рибозы в положениях 2' и 4' соединены метиленовым мостиком [24].
Таблица
miRNAs, экспрессия которых увеличивается (|) или уменьшается Ц) в некоторых наиболее распространенных опухолях по сравнению с нормальными тканями (см. [55], а также [8])._____________________________
Опухоль miRNAs
Рак легких 17-92!, let-71, 124aj, 1261, 1431, 1451, 155Т, 191Î, 205Î, 210Î
Рак молочной железы 21Î, 125b1, 1451, 155!
Рак простаты 15a1, 16-11, 21Î, 1431,1451
Рак опухоли кишечника 19aÎ, 21Î, 1431, 1451
Рак поджелудочной железы 21Î, 103Î, 107Î, 155VÎ
Рак яичников 210Î
ХЛЛ 15a1, 16-11, 16-2Î, 23bÎ, 24-1Î, 291, 146Î, 155Î, 195Î, 221Î, 2231
Считается, что регулирующая роль экспрессии, исчезновения и амплификации miRNA-генов в предрасположенности к инициации, росту и прогрессии большинства опухолей значительна, а мутации в парах miRNA и мРНК-мишень синхронизированы [18]. Профиль экспрессии miRNAs может использоваться для классификации, диагностики и клинического прогноза в онкологии. Изменения в экспрессии miRNAs могут затрагивать клеточный цикл, программу выживаемости клетки [18]. Мутации miRNAs в стволовых и соматических клетках (как и выбор полиморфных вариантов мРНК-мишеней) могут способствовать, или даже играть критическую роль при росте, прогрессии и патофизиологии многих (если не всех) злокачественных новообразований [18]. С помощью miRNAs возможна коррекция апоптоза [19].
Кроме индивидуальных miRNAs обнаружены их кластеры, выступающие в роли онкогена, провоцирующего развитие, в частности, рака кроветворной
ткани у подопытных мышей; гены miRNAs с онко-генными и супрессорными свойствами могут располагаться в одном кластере. Кластерный анализ профилей экспрессии miRNAs в опухолях позволяет определить ее происхождение (эпителий, кроветвор-ная ткань, др.) и классифицировать разные опухоли одной ткани с неидентичными механизмами трансформации [8]. Оценку профиля экспрессии miRNAs можно осуществлять с использованием нано- и микрочипов; точность такой классификации, при отработке технологии (что не просто), оказывается выше, чем с использованием профилей мРНК [69]. Некоторые из miRNAs участвуют в дифференцировке кроветворных клеток (мышь, человек), инициации прогрессии раковых клеток [21]. Человеческие miRNA-гены часто располагаются в т.н. «ломких» сайтах, областях с преобладанием делеций и вставок, точечных разрывов, транслокаций, транспозиций, минимально деле-тируемых и амплифицируемых областей гетерохроматина, вовлеченных в онкогенез [91].
Ангиогенез
Роль miRNAs в ангиогенезе, вероятно, значительна. Усиление ангиогенеза в некоторых Myc-активированных аденокарциномах человека сопровождалось изменением характера экспрессии одних miRNAs, а нокдаун генов других miRNAs вел к ослаблению и подавлению роста опухоли [31]. Рост опухоли сопровождался мутациями в K-ras, Myc и TP53 генах, усилением продукции ангиогенного VEGF-фактора и степени Myc-ассоциированной вас-куляризации; при этом антиангиогенные факторы Tsp1 и CTGF подавлялись miR-17-92 и др. кластер-ассоциированными miRNAs. Ангиогенез и васкуля-ризация опухоли усиливались (в частности, в коло-ноцитах) при коэкспрессии двух онкогенов в большей степени, чем одним [31].
Нейтрализация антиангиогенного LATS2 фактора, ингибитора циклинзависимой киназы животных (CDK2; человек и мышь), с помощью miRNAs-372/373 («потенциальные онкогены») стимулировала рост опухоли семенников без повреждения р53 [97].
Потенциальными модуляторами ангиоген-ных свойств (in-vitro/in-vivo) являются miR-221/222, мишени которых, рецепторы c-Kit (др.), - факторы ангиогенеза эндотелиальных венозных HUVEC клеток пуповины, др. Эти miRNAs и c-Kit взаимодействуют в рамках сложного цикла, контролирующего способность эндотелиальных клеток к формированию новых капилляров [78].
Хронический лимфолейкоз
При В-клеточном ХЛЛ отмечают пониженный уровень экспрессии генов miR-15a и miR-16-1 (и др.) в 13q14 участке хромосомы человека [20] - сайте наиболее общих структурных аномалий (включая делеции участка в 30kb), хотя геном экспрессировал сотни зрелых и пре-miRNAs человека [22]. Обе потенциально эффективные при терапии опухолей miRNAs содержали антисенс-участки антиапоптиче-ского белка Bcl2, подавляли его экспрессию и сверхэкспрессию, стимулировали апоптоз, но почти полностью отсутствовали в двух третях «отбившихся» от нормы ХЛЛ-клеток. Идентифицированы частые мутации секвенированных miRNAs в стволовых и соматических клетках у 11 из 75 пациентов (14,7%) с семейной предрасположенностью к ХЛЛ (способ наследования неизвестен), но не у 160 здоровых пациентов. Эти наблюдения вызывают предположение о прямом функционировании miRNAs в лейкозогенезе [88]. В настоящее время не все известно о связи уровней экспрессии генов miRNAs (и их функций) и других генов в нормальных и опухолевых клетках [22].
Кроме того, определены мутации в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, IgV(H), стволовых неделящихся и сверхэкспрессирующих белок Вс12 CD5+-клеток; это может быть важно в отношении не только ХЛЛ, но и спектра связанных ма-лигнизаций [19]. Профили экспрессии в.н. miRNAs в нормальных и ХЛЛ-малигнизированных В-клетках уникальны и могут иметь прогностическое значение при сопоставлении с обычно коррелирующими уровнями ^^Н)-мутаций, экспрессии пре-лейкемичес-кого белка Zap-70 и ХЛЛ-прогрессии. Значительные различия в.н. уровней экспрессии идентифицированы разными методами (Northern blot, real-time-PCR, компьютерный расчет) [22].
Лейкозы смешаного происхождения
При ОМЛ-1 транскрипционные факторы связываются с сайтами инициации транскрипции огром-
ного количества генов и с 30% всех обнаруженных miRNA-сайтов. Это говорит о потенциально широкой возможности дисрегуляции экспрессии и мРНК и miRNAs, лежащей в основе лейкозных фенотипов [88]. Ввиду того, что miRNAs могут управлять молекулярными аспектами клеточной специализации, ге-мопоэз представляется эффективной моделью системной проверки механизмов действия и функций miRNAs. Эта область разрабатывает различные аспекты возобновления гемопоэза и молекулярно-клеточной специализации с участием miRNAs; ожидаются открытия, связанные с регуляторными функциями большей части генома, не кодирующей ни белки, ни известные вспомогательные РНК [88].
Острый лимфобластный лейкоз
В случае пре-В-клеточного ОЛЛ (пре-В-ОЛЛ) у пациентки 35 лет, с диагнозом: злокачественная опухоль яичника, состояние после ВДХ с аллоТКМ, вторичный лейкоз) наблюдали вставку в 42 нуклеотида (неизвестного происхождения) внутри реаран-жированного генного локуса IgH-цепи иммуноглобулина (из 1Ц24-области хромосомы). Вставка оказалась частью miRNA-125b-1 гена-гомолога lin-4 (нематоды C.elegans). Процесс шел на ранних (стволовоклеточных) стадиях лейкозогенеза и вел к нарушению экспрессии собственных малых РНК, изменениям в IgH-гене-мишени и аберрантной диффе-ренцировке [91].
Лейкозы
В клеточных линиях лейкоза человека идентифицировано несколько линиоспецифических кластеров miRNAs, обогащенных некоторыми общими (mir-29c, mir-302, mir-98, mir-29a, let-7a-1) и индивидуальными miRNAs (mir-181c, mir-181d, mir-191, mir-136) [106]. Глобальный анализ 326 консенсус-выравненных miRNA-генов человека обнаружил, что 148 из них располагаются в 51 кластере (приблизительно по 3 miRNAs в каждом). Это также напоминает ситуацию с редактированием РНК в кинетопластах трипаносом (простейшее), где на одно миникольцо приходится в среднем 3 gRNAs; но gRNAs контролируют экспрессию генов у одноклеточного, а miRNAs
- у многоклеточных (хотя возможно участие их и других малых РНК для одноклеточных, водоросли и прокариот, - также обсуждаются [45; 111]). MiRNA-гены одного кластера могут экспрессироваться и вместе, и порознь. В 39 кластерах (из 51) экспрессия miRNAs была последовательной. Это обнаружение подтверждает жизненно важную роль кластеризованных и индивидуальных miRNAs в гемопоэзе и онкогенезе, и обеспечивает ключевое понимание функций и механизма действия их в различных биопроцессах. В различных кластерах обнаружено значительное число паралогичных miRNAs, что говорит о возможной синхронной эволюции их и комплементарных участков мРНК- и РНК-мишеней у разных видов [106].
Ходжкинские и другие лимфомы
В клетках большинства HL (а также В-лимфом средостения, и диффузных больших В-клеточных лим-фомах) наблюдают высокую экспрессию и первичного транскрипта, pri-miR-155 (шпилечная РНК с miR-155 внутри), и зрелой miR-155 [78], необходимой для функционирования В- и Т-клеток [26; 83; 94]. Экспрессия miR-155 показана также в первичных пролиферирующих пре-В-клетках селезенки и КМ. Роль miR155 состоит в индукции поликлональной экспансии лимфоцитов, располагающей к вторичным генетическим изменениям при последующей трансформации их [78].
Экспрессия miR-155 возрастает также при лимфоме Беркита [59; 74], B-клеточном ОЛЛ [35; 41; 60], при раке легкого [104], РМЖ и раке поджелудочной железы [42]; среди мишеней miR-155 имеются цитокины, хемокины и транскрипционные факторы [35; 41; 42; 59; 60; 74; 83; 104].
Гепатоцеллюлярный рак
В клетках ГЦР, но не в нормальных или временно подверженных голоданию (по фолиевой кислоте, метионину, холину) клетках печени крыс-самцов линии Фишер, обнаружено опухоль-специ-фическое снижение экспрессии только miR-122, но не let-7a, miR-21, miR-23, miR-130, miR-190, miR-17-92 [61]. Экстраполяция этого изучения на человека также показала, что экспрессия miR-122 была достоверно снижена (Р=0,013; в 10 из 20 случаях), а сама miR-122 может оказаться приемлемым биомаркером процесса ракового перерождения печени [ibid.].
Колоректальный рак
Методом real-time-PCR идентифицировано 13 зрелых miRNAs (из 156 исследованных), которые дифференциально экспрессировались в неопухолевых клетках прямой кишки. В то же время в АРР-клетках экспрессия этих 13 miRNAs (особенно miR-31, miR-
96, miR-133b, miR-135b, miR-145, miR-183) была значительно снижена [13]. Сделано 2 вывода: существуют стадиоспецифические (в частности, в отношении miR-31) и потенциально альтернативные уровни регуляции КРР-клеток с участием miRNAs; профиль экспрессии miRNAs имеет прогностическое значение в отношении биологического и клинического поведения данного типа опухоли [ibid.].
Рак молочной железы
Показано, что mir-17-5p может увеличивать опухолесупрессорную активность, связанную с ингибированием трансляции онкогена AIB1 (amplified in breast cancer-1). Эта активность, однако, падала при снижении экспрессии самой mir-17-5p; одновременно понижалась экспрессия генов эстро-гензависимых и независимых рецепторов [50].
Усиление метастатического потенциала в легких и костном мозге при первичном РМЖ сопровождалось потерей экспрессии специфических наборов miRNAs (в частности, miR-126 и miR-335). Наоборот, поддержание экспрессии miR-126 в ма-лигнизированных клетках приводило к уменьшению опухолевого роста и пролиферации, а в случае miR-335 - к ингибированию метастатической инвазии. miR-335 регулирует экспрессию генов, связанных с риском отдаленных метастазов (транскрипционного фактора SOX4, компонента внеклеточного матрикса tenascin С, др.) [90].
Кроме того, при этом раке (у человека, мыши) инвазия и метастазирование инициировались сверхэкспрессией специфической miR-10b, индуцируемой плейотропным транскрипционным фактором Twist (вероятно, связывающимся с промотором miR-10b, MIRN10B). Одновременно miR-10b ингибировала трансляцию мРНК-продукта гомеобокса D10 и чрезмерную экспрессию прометаста-тического гена RHOC. Уровень экспрессии miR-10b в клетках рака молочной железы хорошо коррелирует с клинически выявляемой прогрессией [66].
Рак легкого человека
При этой опухоли слабо или вовсе не экспрессировалась miRNA let-7. Наоборот, ингибирование роста опухоли вызывалось сверхэкспрессией
let-7 (гомологом C.elegans) - потенциальным опухолевым супрессором, подавляющим образование онкобелков Ras и HMGA2 [8]. В имитирующих курение условиях и при ответе на стресс, при апоп-тозе, пролиферации, ангиогенезе, экспрессии генов, кроме let-7, контролирующей в норме экспрессию ассоциированных с раком легкого протоонкогенов, также к ранним событиям относят понижение (в разной степени) экспрессии ряда других miRNA-семейств: miR-10, miR-26, miR-30, miR-34, miR-99, miR-122, miR-123, miR-124, miR-l25, miR-140, miR-145, miR-146, miR-191, miR-192, miR-219, miR-222, и miR-223. При раке легких расположенные в т.н. «ломких» сайтах miRNA-гены часто делетировали. Одновременно экспрессия miR-294 (ингибитор транскрипции репрессорных генов) и некоторых не-miRNA-генов повышалась [53].
Малые интерферирующие РНК в онкологии
Другой тип исследований связан с малыми интерферирующими РНК - т.н. siRNAs. В отличие от miRNAs и piRNAs, они собственно генов не имеют, происходят из длинных днРНК эндо- и экзогенной природы (у человека, нематод, дрозофилы, растений), часто синтезируются искусственно и используют цис- и трансдейсвующие механизмы сплайсинга генов-мишеней [32]. В многочисленных опытах вводимые в разных векторах siRNAs модифицируют множество сигнальных путей при нормальных и патологических процессах (включая канцерогенез).
В настоящее время считается, что механизмы действия и перспективы использования miRNAs и siRNAs в значительной степени схожи: взаимодействие малых РНК и их мишеней (при РНКи) сопровождается деградацией или обратимой и необратимой блокировкой трансляции хозяйских и вирусных мРНК. Результатом такой РНКи, по крайней мере, может быть ослабление прогрессии онкологического заболевания. Преимущества использования РНКи состоят в высокой специфичности и эффективности, а также в низкой токсичности индуцированных ею процессов. Индукция сайленсинга малыми РНК перспективна в отношении отдельных генов и более крупных локусов хромосом [ibid.].
Одна из стратегий терапии рака связана, в частности, с трансфекцией ретровирусных siRNA-содержащих плазмид, уменьшающих уровень экспрессии мРНК тимидилат-синтетазы на 80-95% (в HeLa, др.); мишенями были определенные (898-916 и 965-983) нуклеотидные позиции фермента [105].
Гепатоцеллюлярный рак
При этом виде рака, а также в случае острого и хронического гепатитов эффективными были опосредованные лентивирусом siRNA-1 и siRNA-7 (механизмы разные; эффективность большая, чем при действии ла-мивудина). Эти siRNAs подавляли экспрессию HBV-вирусных и десятки-сотни (от 54 до 499) клеточных генов линии HepG2.2.15 in vitro (по 18 генов регулировались обеими siRNAs) [44].Также важно, что лентиви-русный вектор, содержащий pol-III-промотор с искусственными siPAí4-генами (генными кассетами), способен обеспечить трансдукцию неделящихся клеток, длительное поддержание экспрессии трансгенов, нокаут генов-мишеней, эффективную генную (в частности, антивирусную) терапию в различных тканях (мозг, печень, мышцы) и кроветворных клетках. Анализ результатов позволил заключить, что siRNA-терапия, вместе с традиционной антивирусной терапией, могут вести к эффекту потенцирования [65].
Возможна также антисенстерапия, основанная на внутриопухолевом введении латентно действующих микросфер с anti-VEGF-siRNAs, переходе к длительному генотерапевтическому эффекту и направленная на подавление экспрессии генов различных факторов (в частности, ангиогенных), активирующих канцерогенез у млекопитащих [76].
Рак молочной железы
Торможение роста опухоли, как и снижение экспрессии мРНК рецептора эпидермального фактора роста, усиливались при трансфекции клеток векторами с EGFR-специфичными, но не другими siRNAs. При введении этих siRNAs внутри липофектамин-2000-содержащих липосом in vivo, длительность генного сайленсинга и эффективность РНКи возрастали по сравнению с таковыми в случае предварительной трансфекции этих клеток in vitro [101].
Аналогично, трансфекция клеток MCF-7 рака молочной железы человека in vitro и in vivo (мыши Nude) плазмидой с siRNA (и иб-промотором) против XIAP-мишени (продукта гена X-связанного ингибитора апоптоза) сопровождалась заметным подавлением роста опухоли (задержкой в G1 -фазе, уменьшением размера и степени некротизацации), ингибированием пролиферации, индукцией апоптоза. Падение уровня экспрессии мишени (на 90%) и активности клеточного роста in vitro оценивались, сответственно, RT-PCR, Western blot методами и МТТ-тестом, а степень апоптоза - проточной цитофотометрией и TUNEL-методами. Считают, что это многообещающий инструмент терапии рака [108].
Рак желудка
siRNAs, специфично таргетирующие мутантный K-ras (точнее его 19- нуклеотидный участок вблизи 12 кодона), трансфецировались в двух поли-этиленимин- siRNAs-плазмидных рекомбинантных векторах (с отличиями по одному нуклеотиду) внутрь подкожно растущих у мышей Nude PC-7 и Panc-1 опухолей рака желудка человека (как и в соответствующие культуры тканей). При этом наблюдали эффективное подавление продукции онкогена (анализ RT-PCR и Western blot методов). Ключевое таргетирующее взаимодействие (РНКи) было связанно с центральным (вторым) нуклеотидом 12 кодона [112].
В другом случае трансфекция в подкожно трансплантированную мышам Nude клеточную линию ВхРСЗ (как и в случае in vitro) векторов с МАТ1 -специфичными siRNAs вызывала сайленсинг этого гена [мишень - 21-нуклеотидный (siRNA)x(M4T1) фрагмент днРНК) и значительное подавление роста опухоли (35% снижение клеточной дупликации, задержку в фазах G0/Gl] in vivo [67].
Кроме того, для линии клеток SGC-7901 рака желудка человека (in-vitro/in-vivo) показаны ингибирование экспрессии антиапоптического Вс1-2-фактора, пролиферации, теломеразной активности и усиление апоптоза при использовании Вс1-2-специфичных-siRNAs [46; 47]. Уменьшение клоногенности (опухоле-образования, метастазирования) панкреатических раков в мягком агаре вызывалось нокдаун-специфически-ми PRL-(1,2)-siRNAs [47; 93]. При генной терапии рака желудка описана эффективная доставка анти-VEGF-C-siRNAs внутри СаСОЗ-наночастиц (диаметр - 58 нм), сопровождаемая усилением торможения лимфоангиоге-неза, роста опухоли и метастазов (региональных л/у) [47].
Рак легких
Специфичные, устойчиво трансфецируемые и вводимые в рекомбинантных pSilencer3.1 плазмидах
(in vitro; in vivo: внутрь введенной п/к мышам Nude опухоли), siRNAs успешно таргетировали мРНК мутантного по 12 кодону K-ras (своими 9 из 63 нуклеотидов), ингибировали его экспрессию, пролиферацию, рост числа, но усиливали апоптоз истощаемых по мутантному (GGT^GTT) гену клеток линии H441 НМРЛ человека. Уровни мРНК, белка, пролиферация и апоптоз определялись, соответственно, методами RT-PCR, Western blot, МТТ и проточной цитометрией [109]. Сходным образом нокдаун мутантных (но не интактных) мРНК K-ras аденовирус-опосредуемыми антисенс-siRNAs (AdH1 и siK-ras(V12)) ингибировал рост и сопровождался случаями полной регрессии этой же, и тем же путем введенной опухоли линии H441 рака легких [110].
Колоректальный рак
Допускают, что siRNAs, специфические к одому из Wnt-рецепторов (frizzled-7, FZD7), могут быть использованы в качестве анти-CRCs терапевтических агентов (особенно в опухолях с мутациями в APC или CTNNB1 генах), т.к. в некоторых клеточных линиях этого рака (HCT-116, др.), трансфецированных анти-FZD7-siRNAs-плазмидой, значительно понижались транскрипция TCF-фактора (на 20-80%), жизнеспособность и инвазия клеток in vitro [102].
Меланома
Взаимодействие анти-Mcl1-siRNAs со своей мишенью, экспрессия которой регулируется мито-ген-активирующей ERK-киназой, в некоторых устойчивых к анти-Р0№-зависимому апоптозу линиях клеток меланомы, и подобно действию циклогекси-мида, вело к индуцированному анти-Fas моноклональными антителами апоптозу (не связанному с Bcl-2- или Bcl-xL-опосредуемыми путями), активации caspase-9, восстановлению иммунного надзора и элиминации опухолевых клеток [25].
Заключение
О возможных преимуществах практического использования малых РНК в прогнозировании, диагностике и терапии онкологических заболеваний уже сказано выше.
Поэтому, в заключение, заметим, что множество малых РНК (их генов), входя в состав и участвуя в регуляции экспрессии генов и геномов, генетических и эпигенетических изменений клеток организма в норме и патологии (включая канцерогенез), сами, по крайней мере частично, регулируются белками (ферментами), редактированием РНК (например, A^-I-де-заминирование - в pre-miRNA-22 человека и мыши [70] и многих miRNAs, таргетирующих 3’-НТО мРНК человека [15]), и др. процессами.
Ранее предлагалась и подробно описывалась гипотетическая схема, согласно которой малые РНК, их мРНК и РНК-мишени, отдельные олигонуклео-тидные последовательности генома (а следовательно и множество процессов и явлений в клетке) могут находиться под контролем т.н. нуклеиновых эквивалентов (НЭ; в 15-30 нуклеотидов), сформированных в специальной структуре, «ретранслосоме», при самоорганизации ее компонент - участников процесса т.н. вариабельной Поэпитопной Обратной Трансляции (отдельного эпитопа в 5-10 аминокислот), вПОТ [4-6]. При этом предполагаемая функциональная роль НЭ, переносимых мобильными нуклеотидными векторами или РНП-частицами (скорее, малыми) между ДНК-содержащими клеточными органеллами и цитоплазмой, состояла:
1. В значительно комплементарном (конкурентном) взаимодействии с малыми РНК, их генами (включая делеции, вставки, перестановки) и мРНК и РНК-мишенями, некодирующими регуляторными участками генома (повторами, подвижными элементами), интронами, а также в праймер-опосредуемой инициации транскрипции отдельных участков геномов ;
2. В реализации/замыкании условно иерархической схемы:
(НЭ^-повторы^-интроны^-экзоны)п.
Условность схемы связана с включением повторов (по убыванию) в интроны и экзоны с возможным параллелизмом указанных этапов в разных типах клеток и между клетками (соматическими, герминативными, стволовыми, иммунными) [2].
Вышеназванный вПОТ-механизм, вероятно, может быть важен для достижения нескольких целей, и наиболее значимы из них две:
1. Защитная (участие в формировании анти-ген-специфических участков антител и рецепторов Т- и В-клеток);
2. Генетический-код-формирующая.
В многоклеточном организме поддержание определенного состояния клетки, и, главное, переключение с одного режима на другой (включая патологические - канцерогенез, и т.д.), очевидно, невозможно без участия огромного числа различных специфических сочетаний спектров малых РНК. Что же за процессы создают и регулируют вышеназванные сочетания?
Интересно, что теоретически существует более 1013 вариантов последовательностей длиной в 22 нуклеотида [9] (это без учета минорных оснований). Эта длина характерна, одновременно, для средних размеров функционального участка малых РНК (контролирующих экспрессию генов и геномов), и предсказанных в 1993 г. [5] нуклеиновых эквивалентов (НЭ), предположительно, контролирующих (физиологически и эволюционно) и малые РНК и связанные с ними процессы [2; 6].
Число в.н. вариантов сопоставимо и на порядки меньше такового для антител и рецепторов лимфоцитов (до 1016 и 1018, соответственно, для В- и Т-лимфоцитов), регулирующих иммунный статус и генетическую целостность организма [11; 12]. Заметим, что суммарная длина в.н. последовательностей на несколько порядков превышает длину эукариотических геномов, которые, выходит, содержат (и контролируют) лишь небольшую часть из потенциально возможных их вариантов.
В то же время природа иммунной системы потенциально позволяет ей контролировать гораздо большее число белковых эпитопов и олигонуклео-тидных последовательностей, происхождение которых, очевидно, связано не только с собственным геномом и не только с линейными эпитопами [2; 6].
Литература
Таким образом, уточним (очерчен некий триумвират):
1. Есть клеточные и вирусные геномы, которые содержат лишь малую часть из потенциально возможных вариантов регуляторных и регулируемых олигопоследовательностей (среди которых и малые РНК);
2. Есть иммунная система, контролирующая на порядки большее число вариантов линейных и конформационных аминокислотных эпитопов (а также соответствующих им и других олигопоследовательностей);
3. Наконец, есть гипотетический механизм (вПОТ), посредством которого любые эпитопы могут регулировать свою экспрессию (физиологическую; возможно, также, онто- и филогенетическую) и получать ретранслируемые нуклеотидные выражения (т.е. НЭ-ты - как информационно-пластический материал), используемые, далее, как для различных в.н. видов экспрессии, так и для защиты от поврежденных собственных и инородных белково-нуклеиновых агентов. Ясно, что если этот механизм поддержания феногенотипического равновесия [3] существует, - а другого подобного механизма-посредника с элементами самоорганизации, сравнимого по своей способности сопряженно контролировать взаимосоответствие между олигоструктурами и аминокислотной и нуклеотидной природы не предложено, - он должен быть мостиком, одновременно и ограничивающим и генерирующим протекающие в целом геноме и его частях (включая иммунокомпетентную) процессы поддержания динамически изменяющейся эпиге-номной и генетической целостности.
Очевидно, НЭ, по отношению к малым РНК и другим регуляторным единицам (среди которых и гены), способны решать т.н. проблему «регуляции регуляторов» относительно замкнутой системы целого генома. В этой системе, скорее всего, и при некотором упрощении, регулируется экспрессия не только сочетаний отдельных белков, но и входящих в их состав индивидуальных/наборов эпитопов. А в контексте целого генома, НЭ-ты (потенциально - новая минимальная генетическая единица), вероятно, могут оказаться не только информационно-регуляторным, но и тем пластическим материалом, из которого, собственно, по небольшим точечным и олигонуклеотидным частям формируются и гены и целые части генома. Следуемый отсюда вывод (принципиально доступный проверке) состоит, в частности, в том, что, скорее всего, не должно быть таких, по крайней мере глобальных, эпигенетических изменений (в том числе при онкогенезе), которые бы не сопровождались какими-либо временными (ненаследуемыми и наследуемыми) или стойко наследуемыми изменениями в целом геноме - прежде всего, в его регуляторной (повторы), некодирующей части, точечные и другие нуклеотидные флуктуации в которой (в качестве контроля), обычно не исследуются.
1. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и эпигенетика // Генетика. - 2006. - 42(9). - Р.1186-99
2. Дейчман А.М. Возвращаясь к вопросу о РНК/Белковой симметрии // Электронный Жрнл «Исследовано в России». - 2007. - C. 1-50 (in Russian). - P. 1-41 (in English); (http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2007/149.pdi).
3. Дейчман А.М. Гипотетические корневые механизмы метаболизма генома формируют контуры новой парадигмы // Ст.-П.: Интеллектуальный Форум «Открытая Дверь» (ФГУП НИИ ПММ). Новые концепции естествознания. - 2007. - С. 260-7.
4. Дейчман А.М. Гипотетические механизмы формирования гипервариабельных и консервативных олигонуклео-
тидных участков генома. Возможные перспективы/Российский Биотерапевгичгский Журнал. -2007. - №3. - С. 51-60.
5. Дейчман А.М. Один из вариантов точечных мутаций, возможно, запускается поэпитопной обратной трансляцией. Гипотетическая концепция // М.: Рукопись деп. в ВИНИТИ. - 1993. - №1502-В93. - С. 56.
6. Дейчман А.М, Цой В.Ч., Барышников А.Ю. Редактирование РНК. Гипотетические механизмы // М.: «Практическая Медицина». - 2005. - P. 265 in English. - С. 302 in Russian (www.medprint.ru).
7. Кленов М.С., Гвоздев В.А. Формирование гетерохроматина: роль коротких РНК и метилирования ДНК // Биохимия. - 2005. - 70(11). - С. 1445-58.
8. Рязанский С.С., Гвоздев В.А. Короткие РНК и канцерогенез // Биохимия. - 2008. - 73(5). - С. 640-55.
9. Сергеев А. МикроРНК (miRNA): механизм действия и биологические функции // Электронн. Журнал «Биология и Медицина». - 2005. - (http://medbiol.ru/medbiol/rna_interf/0003f69d.htm).
10. Спирин А.С. Биосинтез белков, РНК-Мир и происхождение жизни // Вестник Российской Академии Наук. - 2001. - 71(4). - С. 320-328 ( http://vivovoco.rsl.ru/vv/joumal/vran/aspirin/asp...).
11. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология // М.: Медицина. - 2000. - С. 432.
12. Ярилин А.А. Основы иммунологии // М.: Медицина». - 1999. - С. 608.
13. Bandres E., Cubedo E., Agirre X. et al. Identification by Real-time PCR of 13 mature microRNAs differentially expressed in colorectal cancer and non-tumoral tissues. Mol Cancer. - 2006. - 5. - P. 29.
14. Blenkiron C., Goldstein L.D., Thorne N.P, et al. MicroRNA expression profiling of human breast cancer identifies new markers of tumor subtype // Genome Biol. - 2007. - 8(10). - R214.
15. Blow M.J., GrocockR.J., van Dongen S. et al. RNA editing of human microRNAs // Genome Biol. - 2006. -7(4). - R27.
16. Bohmert K., Camus I., Bellini C. et al. AGO1 defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development // EMBO J. - 1998. - 17. - P. 170-80.
17. Brouha B., Schustak J., Badge R.M. et al.Hot. L1s account for the bulk of retrotransposition in the human population // PNAS. - 2003. - 100(9). - P. 5280-5.
18. Calin G.A., Croce C.M. MicroRNA-cancer connection: the beginning of a new tale // Cancer Res. - 2006. -66(15). - P. 7390-4.
19. Calin G.A., Croce C.M. Genomics of chronic lymphocytic leukemia microRNAs as new players with clinical significance // Semin Oncol. - 2006. - 33(2). - P. 167-73.
20. Calin G.A., Dumitru C.D., Shimizu M. et al. Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia // PNAS. - 2002. - 99(24). - P. 15524-29.
21. Calin G.A., Ferracin M., Cimmino A. et al. MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia // N Engl J Med. - 2005. - 353(17). - P. 1793-1801.
22. Calin G.A., Liu C.G., Sevignani C. et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias // PNAS. - 2004. - 101(32). - P. 11755-60.
23. Carnell A.N. and Goodman J.I. The long (LINEs) and the short (SINEs) of it: altered methylation as a precursor to toxicity // Toxicol. Sci. - 2003. - 75(2). P. 229-35.
24. Chan J.A., Krichevsky A.M., Kosik K.S. MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells // Cancer Res. - 2005. - 65(14). - P. 6029-33.
25. Chetoui N., Sylla K., Gagnon-Houde J. V. et al. Down-regulation of mcl-1 by small interfering RNA sensitizes resistant melanoma cells to fas-mediated apoptosis // Mol Cancer Res. - 2008. - 6(1). - P. 42-52.
26. Connell R.M., Taganov K.D., Boldin M.P. et al. MicroRNA-155 is induced during the macrophage inflammatory response // PNAS. - 2007. - 104(5). - P. 1604-1609.
27. Corson T.W., Gallie B.L. One hit, two hits, three hits, more? Genomic changes in the development of retinoblastoma // Genes Chromosomes Cancer. - 2007. - 46(7). - P. 617-34.
28. Couturier J.P., Root-Bernstein R.S. HIV may produce inhibitory microRNAs (miRNAs) that block production of CD28, CD4 and some interleukins // J. Theor. Biol. - 2005. - 235(2). - P. 169-84.
29. Cullen B.R. Derivation and function of small interfering RNAs and microRNAs // Virus Res. - 2004. - 102(1).
- P. 3-9.
30. Dagan T., SorekR., Sharon E. et al. AluGene: a database of Alu elements incorporated within protein-coding genes. Copyright 2004, Oxford University Press // Nucleic Acids Res. - 2004. - 32(Database issue): D489-D492.
31. Dews M., Homayouni A., Yu D. et al. Augmentation of tumor angiogensis by a Myc-activated microRNA cluster // Nat Genet. - 2006. - 38 (9). - P. 1060-5.
32. Diallo M., Arenz C., Schmitz K. et al. Long endogenous dsRNAs can induce complete gene silencing in mammalian cells and primary cultures // Oligonucleotides. - 2003. - 13(5). - P. 381-92.
33. Du T., Zamore P.D. MicroPrimer: the biogenesis and function of microRNA // Development. - 2005. -132(21). - P. 4645-52.
34. Duan R., Pak C., Jin P. Single nucleotide polymorphism associated with mature miR-125a alters the processing of pri-miRNA // Hum. Mol. Genet. - 2007. - 16(9). - P. 1124-31.
35. Eis P.S., Tam W., Sun, L. et al. Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas // PNAS.
- 2005. - 102(10). - P. 3627—3632.
36. Esau C., KangX., Peralta E. et al. MicroRNA-143 regulates adipocyte differentiation // J. Biol. Chem. - 2004.
- 279(50). - P. 52361-65.
37. Esquela-Kerscher A., Slack F.J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer // Nat. Rev. Cancer. - 2006. -6(4). - P. 259-69.
38. Esteller M. Cancer epigenomic: DNA metilomes and histone-modification maps // Nat. Rev. Genet. - 2007. -8(4). - P. 286-298.
39. Faller M., Guo F. MicroRNA biogenesis: there's more than one way to skin a cat // Biochim Biophys Acta. -2008. - 1779(11). - P. 663-67.
40. Fukagawa T., Nogami M., Yoshikawa M. et al. Dicer is essential for formation of the heterochromatin structure in vertebrate cells // Nat. Cell Biol. - 2004. - 6(8). - P. 784-91.
41. Fulci V., Chiaretti S., Goldoni M. et al. Quantitative technologies establish a novel microRNA profile of chronic lymphocytic leukemia // Blood. - 2007. - 109(11). - P. 4944—4951.
42. Gironella M., Seux M., Xie M.J. et al. Tumor protein 53-induced nuclear protein 1 expression is repressed by miR-155, and its restoration inhibits pancreatic tumor development // PNAS. - 2007. - 104(41). - P. 1617016175.
43. Goodier J.L., Zhang L., Vetter M.R. et al. Line-1 ORF1 protein localizes in stress granules with other RNA-binding proteins, including components of RNA interference RNA-induced silencing complex // Mol. Cell Biol. - 2007. - 27(18). - P. 6469-83.
44. Guo Y., Guo H., Zhang L. et al. Genomic analysis of anti-hepatitis B virus (HBV) activity by small interfering RNA and lamivudine in stable HBV-producing cells // J Virol. - 2005. - 79 (22). - P. 14392-403.
45. Hale C., Kleppe K., Terns R.M. et al. Prokaryotic silencing (psi)RNAs in Pyrococcus furiosus // RNA. - 2008.
- 14(12). - P. 2572-9.
46. Hao J.H., Gu Q.L., Liu B.Y. et al. inhibition of the proliferation of human gastric cancer cells SGC-7901 in vitro and in vivo using Bcl-2 siRNA // Chin Med J (Engl). - 2007. - 120(23). - P. 2105-11.
47. He X.W., Liu T., Chen.YX. et al. Calcium carbonate nanoparticle delivering vascular endothelial growth factor-C siRNA effectively inhibits lymphangiogenesis and growth of gastric cancer in vivo // Cancer Gene Ther. -2008. - 15(3). - P. 193-202.
48. Hébert S.S., Horré K., Nicolaï L. et al. Loss of microRNA cluster miR-29a/b-1 in sporadic Alzheimer's disease correlates with increased BACE1/beta-secretase expression // PNAS. - 2008. - 105(17). - P. 6415-20.
49. Hoffmann M.J., Schulz WA. Causes and consequences of DNA hypomethylation in human cancer // Biochem. Cell Biol. - 2005. - 83(3). - P. 296-321.
50. Hossain A., Kuo M.T., Saunders G.F. Mir-17-5p Regulates Breast Cancer Cell Proliferation by Inhibiting Translation of AIB1 mRNA // Mol Cell Biol. - 2006. - 26(21). - P. 8191-201.
51. Hsu P. W., Huang H.D., Hsu S.D. et al. miRNAMap: genomic maps of microRNA genes and their target genes in mammalian genomes // Nucleic Acids Res. - 2006. - 34(Database issue): D135-9.
52. Ionov Y., Peinado M.A., Malkhosyan S. et al. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a mechanism for colonic carcinogenesis // Nature. - 1993. - 363 (6429). - P. 558-561.
53. Izzotti A., Calin G.A., Arrigo P. et al. Downregulation of microRNA expression in the lungs of rats exposed to cigarette smoke // FASEB J. - 2008. - [Epub ahead of print].
54. Jaenisch R., Bird A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals // Nat. Genet. - 2003. - 33(Suppl.). - P. 245—254.
55. Jay C., Nemunaitis J., Chen P. et al. miRNA profiling for diagnosis and prognosis of human cancer // DNA Cell Biol. - 2007. - 26 (5). - P. 293—300.
56. Jones N.C., Pevzner P.A. Comparative genomics reveals unusually long motifs in mammalian genomes // Bioinformatics. - 2006. - 22(14). - P. e236-42.
57. Jones P.A., Baylin, S.B. The epigenomics of cancer // Cell. - 2007. - 128 (4). - P. 683-92.
58. Keshet I., Schlesinger Y, Farkash S. et al. Evidence for an instructive mechanism of de novo methylation in cancer cells // Nat. Genet. - 2006. - 38(2). - P. 149-153.
59. Kluiver J., Haralambieva E. et al. // Genes Chromosomes. Cancer. - 2006. - 45 (2). - P. 147-53.
60. Kluiver J., Poppema S., de J.D. et al. BIC and miR-155 are highly expressed in Hodgkin, primary mediastinal and diffuse large B cell lymphomas // J.Pathol. - 2005. - 207 (2). - P. 243—249.
61. Kutay H., Bai S., Datta J. et al. Downregulation of miR-122 in the rodent and human hepatocellular carcinomas // J. Cell Biochem. - 2006. - 99(3). - P. 671-8.
62. Lee N.S., Kim D.H., Alluin J. et al. Functional and intracellular localization properties of U6 promoter-expressed siRNAs, shRNAs, and chimeric VA1 shRNAs in mammalian cells // RNA. - 2008. - 14(9). - P. 1823-33.
63. Lee R.C., Feinbaum R.L. and Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 // Cell. - 1993. - 75(5). - P. 843-54.
64. Lewis B.P., Burge C.B., Bartel D.P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets // Cell. - 2005. - 120(1). - P. 15-20.
65. Li M.J., Rossi J.J. Lentiviral vector delivery of recombinant small interfering RNA expression cassettes // Methods Enzymol. - 2005. - 392. - P. 218-26.
66. Li M., Teruya-Feldstein J., Weinberg Robert A. Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer // Nature. - 2007. - 449(7163). - P. 682-688.
67. Liu J.P., Yuan S.Z., Zhang S.N. Experimental study of MAT1 gene silencing mediated by siRNA in pancreatic cancer // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. - 2007. - 87(38). - P. 2719-23.
68. Lu C., Tej S.S., Luo S. et al. Elucidation of the small RNA component of the transcriptome // Science. - 2005. -309(5740). - P. 1567-9.
69. Lu J., Getz G., Miska E.A. et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers // Nature. - 2005. -435(7043). - P. 834—838.
70. Luciano D.J., Mirsky H., Vendetti N.J., Maas S. RNA editing of a miRNA precursor // RNA. - 2004. - 10(8). -P. 1174-77.
71. Maniataki E., Mourelatos Z. Human mitochondrial tRNAMet is exported to the cytoplasm and associates with the Argonaute 2 protein // RNA. - 2005. - 11(6). - P. 849-52.
72. MattickJ.S.,MakuninI.V. Small regulatory RNAs in mammals//Hum Mol Genet. - 2005. - 14 Spec No 1:R121-32.
73. MehlerM.F., Mattick J.S. Non-coding RNAs in the nervous system // J Physiol. - 2006. - 575(Pt 2). - P. 333-41.
74. Metzler M., Wilda M., Busch K. et al. High expression of precursor microRNA-155/BIC RNA in children with Burkitt lymphoma // Genes Chromosomes Cancer. - 2004. - 39 (2). - P. 167-169.
75. Morin R.D., Aksay G., Dolgosheina E. et al. Comparative analysis of the small RNA transcriptomes of Pinus contorta and Oryza sativa // Genome Res. - 2008. - 18(4). - P. 571-84.
76. Murata N., Takashima Y., Toyoshima K. et al. Anti-tumor effects of anti-VEGF siRNA encapsulated with PLGA microspheres in mice // J Control Release. - 2007. - 126(3). - P. 246-54.
77. Paddison P.J., Caudy A.A., Sachidanandam R. et al. Short hairpin activated gene silencing in mammalian cells // Methods Mol Biol. - 2004. - 265. - P. 85-100.
78. Poliseno L., Tuccoli A., Mariani L. et al. MicroRNAs modulate the angiogenic properties of HUVEC // Blood.
- 2006. - 108(9). - P. 3068-71.
79. Perucho M. Tumors with microsatellite instability: many mutations, targets and paradoxes // Oncogene. -2003. - 22(15). - P. 2223-25.
80. Ruby J.G., Jan C., Player C. et al. Large-scale sequencing reveals 21U-RNAs and additional microRNAs and endogenous siRNAs in C. elegans // Cell. - 2006. - 127(6). - P. 1193-207.
81. Rinn J.L., Kertesz M., Wang J.K. et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs // Cell. - 2007. - 129(7). - P. 1311-23.
82. Ro S., Song R., Park C. et al. Cloning and expression profiling of small RNAs expressed in the mouse ovary // RNA. - 2007. - 13(12). - P. 2366-80.
83. Rodriguez A., Vigorito E., Clare S. et al. Requirement of bic/microRNA-155 for normal immune function // Science. - 2007. - 316 (5824). - P. 608—11.
84. Sai Lakshmi S., Agrawal S. piRNABank: a web resource on classified and clustered Piwi-interacting RNAs // Nucleic Acids Res. - 2007. - 36(Database issue): D173-7.
85. Schuettengruber B., Chourrout D., VervoortM. et al. Genome regulation by polycomb and trithorax proteins // Cell. - 2007. - 128 (4). - P. 735—45.
86. Schulz W.A. L1 retrotransposons in human cancers // J. Biomed. Biotechnol. - 2006. - 2006(1). - P. 83672.
87. Sheedy F.J., O'Neill L.A. Adding fuel to fire: microRNAs as a new class of mediators of inflammation // Ann Rheum Dis. - 2008. - 67(Suppl) 3:iii 50-55.
88. Shivdasani R.A. MicroRNAs: regulators of gene expression and cell differentiation // Blood. - 2006. -108(12). - P. 3646-3653.
89. Smalheiser N.R., Torvik V.I. Alu elements within human mRNAs are probable microRNA targets // Trends Genet. - 2006. - 22(10). - P. 532-6.
90. Sohail F., Tavazoie S.F., Alarcon C. et al. Endogenous human microRNAs hat suppress breast cancer metastasis // Nature. - 2008. - 451 (7175). - P. 147-152.
91. Sonoki T., Iwanaga E., Mitsuya H. et al. Insertion of microRNA-125b-1, a human homologue of lin-4, into a rearranged immunoglobulin heavy chain gene locus in a patient with precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia // Leukemia. - 2005. - 19(11). - P. 2009-10.
92. Spadafora C. Endogenous reverse transcriptase: a mediator of cell proliferation and differentiation // Cytoge-net. Genome Res. - 2004. - 105(2-4). - P. 346-50.
93. Stephens B., Han H., Hostetter G. et al. Small interfering RNA-mediated knockdown of PRL phosphatases results in altered Akt phosphorylation and reduced clonogenicity of pancreatic cancer cells // Mol Cancer Ther. -2008. - 7(1). - P. 202-10.
94. Thai T.H., Calado D.P., Casola S. et al. Regulation of the germinal center response by microRNA-155 // Science. - 2007. - 316(5824). - P. 604—608.
95. Ting A.H., McGarvey K.M., Baylin S.B. The cancer epigenome-components and functional correlates // Genes Dev. - 2006. - 20(23). - P. 3215-3231.
96. Vagin V.V., Sigova A., Chengjian Li, et al. A Distinct Small RNA Pathway Silences Selfish Genetic Elements in the Germline // Science. - 2006. - 313(5785). - P. 320-4.
97. Voorhoeve P.M., le Sage C., Schrier M. et al. A genetic screen implicates miRNA-372 and miRNA-373 as oncogenes in testicular germ cell tumors // Cell. - 2006. - 124(6). - P. 1169-81.
98. Wang G., van der Walt J.M., Mayhew G. et al. Variation in the miRNA-433 binding site of FGF20 confers risk for Parkinson disease by overexpression of alpha-synuclein // Am J Hum Genet. - 2008. - 82(2). - P. 283-9.
99. Wang T., Lerer I., Gueta Z. et al. A deletion/insertion mutation in the BRCA2 gene in a breast cancer family: a possible role of the Alu-polyA tail in the evolution of the deletion // Genes Chromosomes Cancer. - 2001. -31(1). - P. 91—95.
100. Wightman B., Ha I., Ruvkun G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans // Cell. - 1993. - 75(5). - P. 855-62.
101. Wu W.D., Fang C.H., Yang Z.X. et al. Effects of RNA interference on epidermal growth factor receptor expression in breast cancer cells: a study in tumor-bearing nude mice // Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. -2008. - 28(1). - P. 60-4.
102. Ueno K., Hiura M., Suehiro Y. et al. Frizzled-7 as a potential therapeutic target in colorectal cancer // Neoplasia. - 2008. - 10(7). - P. 697-705.
103. Upadhyay R., Bawankar P., Malhotra D., Patankar S. A screen for conserved sequences with biased base composition identifies noncoding RNAs in the A-T rich genome of Plasmodium falciparum // Mol Biochem Parasitol. - 2005. - 144(2). - P. 149-58.
104. Yanaihara N., Caplen N., Bowman E. et al. Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis // Cancer Cell. - 2006. - 9(3). - P. 189-98.
105. Yang Z., Cloud A., Hughes D., Johnson L.F. Stable inhibition of human thymidylate synthase expression following retroviral introduction of an siRNA gene // Cancer Gene Ther. - 2006. - 13(1). - P. 107-14.
106. Yu J., Wang F., Yang G.H. et al. Human microRNA clusters: Genomic organization and expression profile in leukemia cell lines // Biochem Biophys Res Commun. - 2006. - 349(1). - P. 59-68.
107.Zeng Y., Cullen B.R. Sequence requirements for micro RNA processing and function in human cells // RNA. -2003. - 9(1). - P. 112-23.
108.Zhang Y., Wang Y., Gao W. et al. Transfer of siRNA against XIAP induces apoptosis and reduces tumor cells growth potential in human breast cancer in vitro and in vivo // Breast Cancer Res Treat. - 2006. - 96(3). - P. 267-77.
109.Zhang Z.P., Jiang G.C., Yang F. et al. Study of growth inhibition of lung cancer cells by siRNA targeting mutant K-ras gene in vitro and in vivo // Zhonghua Wai Ke Za Zhi. - 2007. - 45(18). - P. 1267-70.
110.Zhang Z., Jiang G., Yang F., Wang J. Knockdown of mutant K-ras expression by adenovirus-mediated siRNA inhibits the in vitro and in vivo growth of lung cancer cells // Cancer Biol Ther. - 2006. - 5(11). - P. 1481
111.Zhao T., Li G., Mi S. et al. A complex system of small RNAs in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii // Genes Dev. - 2007. - 21(10). - P. 1190-203.
112. Zhu H., LiangZ.Y., RenX.Y., Liu T.H. Small interfering RNAs targeting mutant K-ras inhibit human pancreatic carcinoma cells growth in vitro and in vivo // Cancer Biol Ther. - 2006. - 5(12). - P. 1693-8.
