CC BY
150
REVIEWS
ОБЗОРЫ
© ГУДИМА Г.О., ХАИТОВ Р.М., 2017
УДК: 616.98:578.828.6]-092:612.017.1-064]-085
Гудима Г.О., Хаитов Р.М.
ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ МИКРОРНК И МАЛЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК ДЛЯ ТЕРАПИИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ
ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, Москва
Широкое применение антиретровирусной терапии (АРТ) позволило значительно увеличить продолжительность и качество жизни ВИЧ-инфицированных пациентов. Однако применение АРТ сопряжено с рядом проблем: образование устойчивых вариантов ВИЧ, пожизненный приём препаратов, невозможность удаления вируса из латентных резервуаров в организме инфицированного человека. В связи с этим особую актуальность приобретает разработка молекулярно-биологических подходов для воздействия на провирусную ДНК, интегрированную в геном клетки-хозяина. Одним из таких подходов является генотерапия. Основными направлениями её применения являются регуляция синтеза вирусных белков и клеточных факторов, необходимых для проникновения ВИЧ-1 в клетку-мишень и его последующей репликации, а также предотвращение интеграции провирусной ДНК в геном клетки-мишени, удаление интегрированной ДНК ВИЧ из генома клетки-мишени или мутагенная деактивация генов вируса. Анализу перспективных стратегий генотерапии ВИЧ-инфекции посвящён настоящий обзор.
Ключевые слова: ВИЧ-инфекция; мкРНК; миРНК; РНК-интерференция; антивирусная терапия; обзор. Для цитирования: Гудима Г.О., Хаитов Р.М. Перспективы применения микроРНК и малых интерферирующих РНК для терапии ВИЧ-инфекции. Иммунология. 2018; 39(2-3): 137-142. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-2-3-137-142
Gudima G.O., Khaitov R.M.
PERSPECTIVES OF MICRORNA AND SMALL INTERFERING RNA USAGE FOR HIV INFECTION THERAPY
NRC Institute of Immunology, FMBA, Russia, 115478, Moscow
Due to use of antiretroviral therapy (ART) the life span and quality of HIV-infected patients increased dramatically. However ART is accompanied by development of resistant HIV variants, life-time drug therapy and inability to eradicate virus from latent reservoirs. Thus the development of molecular biological approaches to affect the proviral DNA integrated to host genome is extremely actual. gene therapy represents one of these approaches. Main directions of this approach are regulation of synthesis of viral proteins and cellular factors necessary for HIV entry to target cell and further replication, prevention of proviral DNA integration to host genome, removal of integrated HIV DNA from target cell genome or mutagenic deactivation of viral genes. This review is devoted to analysis of perspective strategies of HIV infection gene therapy.
Keywords: HIV infection, mcRNA, siPRA, RNA interference, antiviral therapy, review.
For citation: Gudima G.O., Khaitov R.M. Perspectives of microRNA and small interfering RNA usage for HIV infection therapy. Immunologiya. 2018; 39(2): 137-142. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-2-3-137-142
For correspondence: Gudima Georgii Olegovich, Dr.Biol. Sci, Prof., E-mail: [email protected].
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Received 17.10.17 Accepted 16.12.17
Антиретровирусная терапия (АРТ) позволила снизить заболеваемость, смертность и уровень передачи ВИЧ-1 [1]. Однако её применение имеет ряд ограничений. К ним относятся неблагоприятные побочные эффекты, формирование резистентности, а также невозможность удаления латентного резервуара вируса. Для достижения эффекта требуется понимание того, что терапия назначается пожизненно, что необходимы высокая приверженность лечению и ежедневный приём антиретровирусных препаратов. В связи с этим ведутся интенсивные исследования по разработке альтернативных терапевтических стратегий, которые основаны на однократном воздействии или долгодействующем комбинированном
Для корреспонденции: Гудима Георгий Олегович, д-р биол. наук, профессор, E-mail: [email protected].
применении, направленном на блокирование репликации ВИЧ-1, предотвращение развития резистентности и удаление латентного резервуара вируса. Одной из таких стратегий является генотерапия.
За последние 30 лет произошёл значительный прогресс в разработке генотерапевтических технологий и подходов, в том числе применительно к ВИЧ-инфекции. В доклинических и клинических испытаниях исследуются антисмысловые РНК, рибозимы, доминантно-негативные мутанты, ТАБ-ловушки и препараты интерферирующих РНК [2, 3]. Использование вирусных векторов для доставки терапевтических генных конструкций в стволовые кроветворные клетки и клетки-предшественники открыло перспективу получения клеток, устойчивых к ВИЧ-инфекции, и тем самым приблизило разработку эффективной терапии этого заболевания.
ОБЗОРЫ
1. МикрорИК и малые интерферирующие рнК
МикроРНК (мкРНК) и малые интерферирующие РНК (миРНК) представляют собой небольшие некодирующие фрагменты РНК (21 - 80 нуклеотидов), ингибирующие экспрессию генов [4, 5]. На долю мкРНК приходится регуляция до 50% кодирующих мРНК в клетках человека [6, 7]. Установлена значимая роль мкРНК в регуляции процессов пролиферации, апоптоза, ответа на стресс, нейродегенерации, гемопоэза, онкогенеза [5]. Идентифицировано более 1800 мкРНК человека [4, 8 - 10]. Активность мкРНК характеризуется множественностью точек воздействия и кооператив-ностью. Одна и та же мкРНК способна взаимодействовать с сотнями и тысячами генов. С другой стороны, одна и та же мишень может быть ингибирована несколькими различными мкРНК [11]. Нарушение мкРНК-опосредованной регуляции связано с патогенезом многих заболеваний [12 - 14]. В частности, 70% случаев В-клеточной хронической лейкемии были связаны с делецией локуса 13q14, кодирующего miR-15a и miR-16a [12]. Эти мкРНК подавляют развитие опухоли, и их потеря способствует онкогенезу.
Молекулы мкРНК синтезируются на некодирующих участках ДНК, а миРНК синтезируются на ДНК, кодирующей различные белки [15]. Из каждого предшественника мкРНК образуется только один мкРНК-дуплекс. Процессинг первичных транскриптов РНК (pri-мкРНК) проходит в ядре с участием РНКазы Drosha и её кофактора DGCR8, в результате чего удаляются лишние нуклеотиды и образуется петлевая шпилькообразная структура - пре-мкРНК размером около 60 нуклеотидов [16]. В цитоплазме под действием РНКазы Dicer от пре-мкРНК отщепляется петля и образуется мкРНК размером 18 - 23 нуклеотида [15]. Направляющая цепь мкРНК встраивается в РНК-индуцированный комплекс выключения гена (RNA-induced silencing complex, RISC), другая цепь деградирует [17]. В состав RISC входят белки AGO1-4, TRBP (TAR RNA-binding protein) и ряд других факторов [5, 18, 19]. Из обеих цепей двухцепочечного предшественника миРНК образуются множественные бимолекулярные РНК-дуплексы, а затем в результате процессинга - миРНК, которые не формируют шпилькообразные структуры. В отличие от миРНК мкРНК практически всегда консервативны у близких организмов [6].
Связывание комплекса мкРНК-RISC с комплементарным 3 '-UTR-участком мРНК приводит к подавлению трансляции [6, 20]. Если последовательность мкРНК не полностью комплементарна последовательности мРНК-мишени, то происходит связывание мкРНК и мРНК, а затем комплексы RISC/ мРНК перемещаются в Р-тельца, где происходит деградация РНК [20, 21]. При полной комплементарности мРНК-мишени и мкРНК, встроенной в RISC, происходит расщепление мРНК с участием белка AGO2 [20, 22]. Комплекс мкРНК/RISC способен взаимодействовать с ДНК, что приводит к рекрутированию гистон-модифицирующих белков, изменению структуры хроматина и подавлению транскрипции генов, комплементарных направляющей последовательности мкРНК [23].
Многие вирусы, в том числе ВИЧ, кодируют и экспрес-сируют собственные мкРНК в клетках хозяина. Некоторые из этих мкРНК модулируют активность иммунной системы и способствуют уходу вируса от её защитного действия, а также обеспечивают поддержание латентной инфекции [24]. Ряд вирусных мкРНК комплементарны мРНК хозяина и, наоборот, многие мкРНК хозяина комплементарны генам вируса. Взаимодействие вируса и хозяина на уровне этих регулятор-ных элементов имеет важное значение в патогенезе заболевания [8, 9]. Около 200 мкРНК человека обладают потенциальной антивирусной активностью. Комплементарность к этим мкРНК обнаружена в большинстве вирусных геномов, что может свидетельствовать о наличии мкРНК-опосредованной противовирусной защиты у человека [9, 25].
2. МикроРНК человека, комплементарные к генам ВИЧ
В Т-лимфоцитах человека экспрессируются мкРНК (hsa-miR - мкРНК Homo sapiens), комплементарные к высококонсервативным участкам мРНК ВИЧ-1, кодирующих акцессорные белки [26]. Мишенью hsa-miR-29a и hsa-miR-29b является ген nef, мишенью hsa-miR-149 - ген vpr, мишенью hsa-miR-378 - ген env, мишенью hsa-miR-324 - ген vif. 3 '-конец мРНК ВИЧ-1 является мишенью для клеточных мкРНК miR-28, miR-125b, miR-150, miR-223 и miR-382. Они имеют высокий уровень экспрессии в покоящихся CD4+-T-клетках, ингибируют интеграцию провируса в геном клетки-мишени, репликацию вируса и способствуют установлению латентности [26, 27].
Белок Nef, мРНК которого ингибируется miR-29a и miR-29b, критически важен для прогрессии ВИЧ-инфекции. Этот белок начинает действовать на ранних этапах жизненного цикла вируса и вызывает подавление продукции CD4, способствует высвобождению вирионов и установлению долговременной инфекции. Делеция nef приводит к существенному замедлению развития симптомов СПИДа (до 10 лет). В ВИЧ-инфицированных Т-клетках человека miR-29a имеет высокий уровень экспрессии и специфически взаимодействует с 3'-UTR ВИЧ-1, что снижает уровень Nef и приводит к подавлению репликации вируса. При ингибировании miR-29a вирусная репликация усиливается [28]. Ингибирую-щим действием на репликацию ВИЧ-1 обладают miR-20a, miR-330-5p, miR-191 и miR-223. Напротив, miR-511 вызывает усиление продукции белков вируса. МикроРНК miR-29a прямо связывается с мРНК Nef, а miR-20a, miR-330-5p, miR-191 и miR-511 взаимодействуют с клеточными факторами, которые опосредованно влияют на репликацию ВИЧ-1 [29]. Обнаружено, что в CD4+CD8-мононукпеарных клетках периферической крови (МНПК), инфицированных ВИЧ-1 in vitro, уровень miR-223 существенно повышен, а уровни miR-29a/b, miR-155 и miR-21 значительно снижены [30].
Латентность ВИЧ-1 в покоящихся CD4+-Т-кпетках является наиболее серьезным препятствием на пути к удалению вируса у пациентов, получающих АРТ. Уровень клеточных мкРНК, которые ингибируют продукцию ВИЧ-1 (miR-28, miR-125b, miR150, miR-223 и miR-382), в покоящихся CD4+-Т-кпетках существенно выше, чем в активированных [27]. Специфические ингибиторы этих мкРНК усиливают образование белков ВИЧ-1 и продукцию новых вирионов в покоящихся CD4+-Т-клетках, выделенных от ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих АРТ. Таким образом, мкРНК клеток хозяина принадлежит важная роль в ингибировании репликации и установлении латентности ВИЧ-1, а восстановление нарушенной регуляции экспрессии мкРНК может стать перспективным подходом к контролю вируса и его элиминации из латентных резервуаров [27].
При ВИЧ-инфекции происходит нарушение экспрессии мкРНК, однако они все-таки играют значимую роль в противодействии вирусной инфекции. Хотя моноциты и макрофаги имеют необходимые рецепторы для входа ВИЧ-1 в клетку, моноциты достаточно устойчивы к ВИЧ-инфекции in vivo и in vitro. Напротив, тканевые макрофаги и макрофаги, дифференцировавшиеся из моноцитов in vitro, имеют высокую восприимчивость к инфицированию R5-тропными штаммами ВИЧ-1. Частота инфицирования моноцитов достаточно низкая и они редко служат латентным резервуаром ВИЧ-1 [31]. Эта особенность моноцитов обусловлена высоким содержанием противовирусных мкРНК (miR-28, miR-150, miR-223 и miR-382), чего не наблюдается в происходящих из них макрофагах. Подавление экспрессии противовирусных мкРНК в моноцитах облегчает их инфицирование вирусом, а увеличение экспрессии анти-ВИЧ-мкРНК в макрофагах приводит к подавлению репликации вируса. Эти данные позволяют на молекулярном уровне объяснить устойчивость
REVIEWS
МкРНК человека, взаимодействующие с генами ВИЧ-1 [5, 27, 30, 32, 33, 42, 44, 45].
Наименование мкРНК
Мишень
Противовирусное действие
miR-29a
miR-29b miR-29c miR-24
miR-15a miR-15b miR-16 miR-1224-3p
miR-28
miR-125b
miR-150
miR-223
miR-382
miR-17-5p
miR-20a
miR-198
Nef 3'-LTR/UTR Nef 3'-LTR Nef 3'-LTR Nef 3'-LTR
Nef 3'-LTR 3'-UTR
3'-UTR гена ацетил-трансферазы PCAF Циклин T1
Связывание с участком Nef 3'-LTR в положении 420. Снижение экспрессии белка Nef, торможение репликации ВИЧ-1.
Связывание участка Nef 3'-LTR в положении 420. Снижение экспрессии белка Nef, торможение репликации ВИЧ-1.
Связывание участка Nef 3'-LTR в положениях 68, 444, 503, 766. Снижение экспрессие белка Nef, торможение репликации ВИЧ-1.
Связывание участка Nef 3'-LTR в положениях 156, 724. Снижение экспрессии белка Nef, торможение репликацию ВИЧ-1.
Связывание участка Nef 3'-LTR в положении 193. Снижение экспрессии белка Nef, торможение репликации ВИЧ-1
Усиление латентности ВИЧ-1, снижение трансляции белков и образования вирионов ВИЧ-1. Усиление устойчивости моноцитов/макрофагов к ВИЧ-инфекции. MiR-150 связывается с участком Nef 3'-LTR в положениях 89 и 773; miR-223 связывается с участком Nef 3'-LTR в положении 408. Уровень этих мкРНК повышен в моноцитах и покоящихся CD4+-T-клетках. В МНПК потребителей опиоидных наркотиков уровень miR-28, miR-125b, miR-150, miR-382 снижен.
Опосредованное ингибирование ВИЧ-инфекции.
Опосредованное ингибирование репликации ВИЧ-1 в моноцитах в результате подавления экспрессии циклина Т1.
моноцитов к ВИЧ-инфекции и поддерживают представления о том, что врождённый иммунитет, опосредованный внутриклеточными мкРНК, может играть значимую роль в защите моноцитов/макрофагов от ВИЧ-инфекции [32]. Нельзя, однако, отрицать и существенную роль относительно низкого уровня экспрессии CCR5 и CD4 в устойчивости моноцитов к инфекции. Обработка моноцитов опиоидами in vitro приводит к снижению в них уровня противовирусных мкРНК. Эти результаты хорошо согласуются с данными о низком уровне противовирусных мкРНК в МНПК ВИЧ-инфицированных потребителей героина, что может способствовать повышению чувствительности этих клеток к ВИЧ-инфекции [33].
3. Нарушение функционирования мкРНК хозяина при ВИЧ-инфекции
ВИЧ-инфекция клетки-мишени запускает антивирусную мкРНК-защиту [9]. Исследованные мкРНК, оказывающие влияние на жизненный цикл ВИЧ-1, и мишени их действия приведены в табл. В покоящихся Т-клетках выявлена повышенная экспрессия мкРНК, которая взаимодействует с 3'-концом РНК ВИЧ-1, подавляет экспрессию генов вируса и способствует сохранению латентного состояния [27]. Профиль экспрессии мкРНК в МНПК отличался у элитных контроллеров и у ВИЧ-инфицированных пациентов в период ви-ремии. В целом наблюдалась корреляция профиля экспрессии мкРНК с уровнем CD4+-Т-клеток и вирусной нагрузкой. При этом некоторые мкРНК имели сходный характер экспрессии в этих двух группах. Различия наблюдались в экспрессии мкРНК, связанных с латентностью вируса, в частности, miR-29, miR-125b и miR-150. Идентифицированы мкРНК, в частности, miR-31, экспрессия которых отличала виремических пациентов от неинфицированных индивидуумов и элитных контроллеров [34]. Уровень miR-31 в Treg ниже, чем в других Т-клетках [35]. Её экспрессия индуцируется белком С/ EBP beta (CCAAT/enhancer binding protein beta) [36], изофор-мы которого способны как ингибировать, так и стимулировать репликацию ВИЧ-1 [37]. Мишенью miR-31 является ген SATB2, кодирующий ДНК-связывающий белок SATB2 (Special AT-rich sequence Binding protein 2) и участвующий в регуляции дифференцировки Т-клеток [38]. Профили экспрессии мкРНК сходны в МНПК элитных контроллеров и неинфи-цированных индивидуумов. При этом сама группа элитных контроллеров оказалась гетерогенной по характеру экспрессии мкРНК, связанных с ВИЧ-инфекцией [34].
ВИЧ-1 способен противодействовать мкРНК-опосредованным защитным механизмам клетки. В клетках, инфицированных ВИЧ-1, происходит существенное измен-ние экспрессии мкРНК по сравнению с интактными клетками [39]. Вирусный белок Tat вызывает изменение профиля экспрессии мкРНК хозяина и предотвращает подавление репликации ВИЧ-1. Белки Tat, Vpr и Nef ингибируют активность РНКазы Dicer [20, 40, 42], в результате чего ограничивается способность клетки к процессингу двухцепочечной РНК-предшественника в миРНК, которая подавляет репликацию вируса [20]. Деактивирующие мутации гена tat ВИЧ-1 снижают блокирующее действие на 22 мкРНК в лимфоцитах, что свидетельствует об участии белка Tat в угнетении клеточного иммунного ответа на ВИЧ-инфекцию [41]. При ВИЧ-инфекции в МНПК хозяина обнаруживается супрессия мкРНК miR-17-5p и miR-20, которые оказывают ингибирую-щее действие на репликацию вируса [42]. В результате репликация вируса в инфицированных клетках усиливается. В МНПК экспрессия большинства мкРНК, в том числе miR-31 и miR-150, при ВИЧ-инфекции подавляется [43]. При этом уровень некоторых мкРНК (miR-16, miR-181, miR-130b) наоборот, возрастал. Экспрессия miR-125b положительно коррелировала с содержанием CD4+-Т-клеток [35].
Описано 18 дифференциально экспрессирующихся мкРНК, уровни которых могли бы стать более точными параметрами для прогнозирования развития ВИЧ-инфекции в период хронической стадии, чем обычно используемые показатели - уровень CD4+-Т-клеток и вирусная нагрузка. Экспрессия шести из этих мкРНК достоверно связана с ускоренной потерей CD4+-Т-клеток [46].
4. МикроРНК ВИЧ-1
Обнаружение в геноме ВИЧ-1 последовательностей, кодирующих мкРНК, и выявление функциональных мкРНК вирусного происхождения позволило сделать предположение о роли интерференции РНК в экспрессии генов ВИЧ [47]. В геноме ВИЧ-1 описано пять участков, кодирующих мкРНК: вблизи TAR; в районе гена Gag, кодирующего капсидный белок; вблизи точки переключения рамки считывания gag-po; в гене ne; в 3 '-LTR [40]. Кодируемые этими участками мкРНК способны взаимодействовать с широким спектром клеточных мРНК и изменять экспрессию генов хозяина. Показана сильная корреляция между определенными мРНК ВИЧ-1 и подавлением экспрессии ряда белков в CD4+-Т-клетках и
ОБЗОРЫ
макрофагах, в том числе CD28, CTLA-4 (CD152), некоторых интерлейкинов [48].
Описано несколько мкРНК ВИЧ-1. Молекула мкРНК TAR представляет собой шпилькообразную структуру, включающую 50 нуклеотидов. Эта мкРНК связывается и с TRBP, и с Dicer. Показано, что мкРНК TAR способна снижать экспрессию генов вируса и активность клеточных белков, участвующих в репликации, передаче рецепторных сигналов, репарации, функционировании митохондрий, апоптозе, что способствует защите инфицированной клетки от стресс-индуцированной гибели и продолжению времени её жизни [49]. МикроРНК Nef снижает транскрипцию генома ВИЧ-1 и экспрессию белка Nef, что вносит вклад в формирование состояния длительной непрогрессии заболевания [47]. МикроРНК miR-H1 включает в себя 81 нуклеотид петлеобразного участка, расположенного ниже сайтов связывания NF-kB в LTR ВИЧ-1. MiR-H1 действует как антагонист мкРНК TAR, которая препятствует апоптозу [50]. В результате ошибок обратной транскриптазы индивидуальная последовательность miR-H1 может отличаться на различных стадиях развития заболевания. Некоторые заболевания, сопутствующие ВИЧ-инфекции/СПИДу, в том числе СПИД-ассоциированная лимфома и ВИЧ-ассоциированная демен-ция, связаны с активностью miR-H1 [51].
5. МикроРНК и антивирусная терапия
Применение технологии РНК-интерференции с использованием мкРНК, миРНК и коротких шпилькообразных РНК ^1РНК) для ингибирования репликации ВИЧ-1 в клетках-мишенях представляет большой интерес как потенциальная генотерапия ВИЧ-инфекции [52]. In vitro миРНК против белков Gag, Pol, IN, Vpu, Tat, Rev, Vif и Nef способны ограничивать их экспрессию и подавлять репликацию вируса в Т-клетках человека [53]. Tat-специфическая мкРНК на 80% снижала уровень антигена р24 в инфицированных культивируемых клетках-мишенях [54]. Наиболее эффективным путём ингибирования репликации ВИЧ-1 с помощью РНК-интерференции представляется воздействие на множественные участки генома ВИЧ-1 или сочетание различных вариантов терапии [52]. Например, трансдукция незрелых CD34+-клеток лентивирусным вектором, содержащим shРНК против Tat или Rev, TAR-ловушку и CCR5-рибозим, приводила к образованию фенотипически нормальных трансгенных Т-клеток, устойчивых к ВИЧ-инфекции in vitro [55]. Сочетан-ное применение антител и миРНК позволяло специфическим образом воздействовать на Т-клетки и предотвратить потерю CD4+-Т-клеток в модели ВИЧ-инфекции на гуманизированных мышах [56].
Терапевтический антивирусный эффект терапии может быть достигнут путём прямого воздействия с помощью ингибиторов и антагонистов на мкРНК хозяина, вовлеченные в процесс репликации и распространения вируса. При инфекции вирусом гепатита С мкРНК хозяина miR-122 в печени селективно связывает 5 '-конец генома HCV, что способствует выживанию и накоплению вируса в гепатоцитах [57]. Специфический ингибитор miR-122 миравирсен (15-звенный олигонуклеотид) распознаёт и блокирует эту мкРНК, что приводит к снижению вирусной нагрузки [58]. Миравирсен был эффективен в моделях на животных [59] и стал первым антагонистом мкРНК, включённым в клинические испытания [58]. По результатам этих исследований было высказано предположение, что целевое воздействие на мкРНК, регуляция которой нарушена, может быть применено и для противодействия ВИЧ-инфекции [59].
Прогрессия ВИЧ-инфекции в СПИД в значительной мере зависит от генетических факторов хозяина. Описана быстрая прогрессия, медленная прогрессия, а также состояние долговременной непрогрессии ВИЧ-инфекции. Аллельные варианты HLA класса I оказывают наиболее существенное влияние на развитие заболевания. Значимую ассоциацию
с динамикой ВИЧ-инфекции имеет локус HLA-C. У ВИЧ-инфицированных индивидуумов с высокой экспрессией молекул HLA-C наблюдается более эффективный контроль виремии и замедление развития клинических проявлений СПИДа по сравнению с индивидуумами, у которых экспрессия молекул HLA-C снижена [60, 61]. Экспрессия HLA-C в значительной мере регулируется мкРНК miR-148a. Нуклео-тидные замены в miR-148а обусловливают нарушение её взаимодействия с мРНК HLA-C, что приводит к высокому уровню экспрессии HLA-C [61]. Эти данные стали основой для разработки новых стратегий конструирования мкРНК для терапии ВИЧ-инфекции [60].
Таким образом, мкРНК представляются перспективными препаратами для терапии и диагностики [62]. Ведутся интенсивные исследования в области поиска соответствующих ингибиторов и мкРНК-миметиков для терапии различных заболеваний, включая вирусные инфекции, неврологические расстройства, онкологические заболевания, сердечнососудистые заболевания, нарушения обмена веществ [9, 63].
6. Ограничения терапевтических подходов, основанных на применении мкрНК
Трудности и проблемы возникают при разработке любого лекарственного средства, и конструирование терапевтических средств на основе мкРНК не является исключением. Пока существует недостаточно знаний об их функционировании и механизме действия. Тем не менее, - это быстроразви-вающаяся область современной биомедицины и количество кандидатных препаратов мкРНК, находящихся на начальных стадиях клинических исследований, демонстрирует большой потенциал и перспективность применения мкРНК для диагностики, прогнозирования и терапии большого спектра инфекционных и неинфекционных заболеваний.
Одним из уникальных свойств мкРНК является регуляция активности генов, которая осуществляется в результате её связывания с целевой последовательностью мРНК. Одна мкРНК способна воздействовать на множество генов, соответственно, необходимо иметь ясное представление о широте функционального взаимодействия мкРНК и мРНК.
При вирусных инфекциях, в том числе и в случае ВИЧ-инфекции, применение терапевтических подходов, основанных на РНК-интерференции, сопряжено с рядом потенциальных проблем. При неадекватном выборе миРНК способны в большей мере повышать вирусную активность, нежели ингибировать её, в результате усиления образования escape-мутантов в процессе обратной транскрипции [53]. Было показано, что долговременное воздействие shРНК, блокирующей ген nef приводило к образованию escape-мутантов, которые были способны уходить от действия РНК-интерференции [64]. Поэтому крайне важно установить, при каких условиях успешное ингибирующее действие мкРНК может привести к клинически значимым результатам.
К числу фундаментальных рисков относятся неспецифические эффекты мкРНК. Для понимания потенциальной эффективности целевых препаратов необходимо точно определить функциональную роль факторов, связанных с биогенезом мкРНК (LOQS, PACT, HEN1, SE и др.). Молекулы мкРНК претерпевает модификации - уридинилирование, аденилирование, метилирование - и потенциальную значимость этих процессов следует учитывать при конструировании регуляторных мкРНК или их ингибиторов. Также важно решить проблемы доставки терапевтических мкРНК к соответствующим клеткам без побочных эффектов и в том числе разработать технологии, которые могли бы обеспечить устойчивую экспрессию мкРНК in vivo [52]. Экстраполяция результатов лабораторных исследований ингибирования репликации вируса в культуре на потенциальное подавление инфекции в организме требует осторожности и является одной из важных проблем в создании препаратов мкРНК для терапии ВИЧ-инфекции [59]. Так как мкРНК обладают функ-
циональной плейотропностью и кооперативностью [65], необходимо исследовать возможные перекрёстные эффекты кандидатных терапевтических препаратов мкРНК, а также определить потенциальные побочные эффекты изменения регуляции мкРНК и их обратимость. Тем не менее, будучи основными регуляторами экспрессии генов и белков, мкРНК имеют большие терапевтические перспективы в контроле вирусных инфекций и ряда других заболеваний. После решения проблем доставки и неспецифичности мкРНК in vivo они не только станут отличной мишенью для терапевтических средств, но и откроют путь для нового поколения биомаркеров в диагностике и прогнозе широкого спектра болезней человека и животных.
Регуляторные процессы, опосредованные вирусными мкРНК, представляют собой важный компонент взаимодействия вируса и хозяина. Идентификация мишеней мкРНК показала, что вирусные мкРНК играют важную роль не только в жизненном цикле вируса, но и в определении течения заболевания, что достигается за счёт изменения активности генома хозяина. Это может иметь важное значение для ухода вируса от действия иммунной системы в результате подавления иммунного надзора и увеличения продолжительности жизни инфицированных клеток хозяина. Выявление подобных мишеней и исследование их функционирования в течение заболевания может представить ясную картину взаимодействия вируса и хозяина и способствовать разработке инновационных терапевтических стратегий. Определение характера нарушения мкРНК-опосредованной регуляции при ВИЧ-инфекции также позволит идентифицировать перспективные мишени терапии.
МикроРНК отличаются стабильностью и представляют собой самостоятельный класс диагностических и прогностических биомаркеров. Участие этих молекул в уходе вируса от действия иммунного ответа хозяина является критически важным фактором, который требует глубокого анализа при разработке анти-ВИЧ/СПИД-вакцин и подходов к генотера-пии. Исследование таких важных пост-трансляционных вирусных регуляторов имеет большой диагностический и лечебный потенциал для широкого ряда заболеваний, включая ВИЧ-инфекцию.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-3, 5-7, 9-13, 15-65 см. REFERENCES)
4. Баулина Н.М., Кулакова О.Г., Фаворова О.О. МикроРНК: роль в развитии аутоиммунного воспаления. ActaNaturae. 2016; 8, N»1 (28): 23-36.
8. Хаитов М.Р. Биобезопасность и интерференция РНК. Постгеномные процессы, иммунонанотехнологии, новые принципы создания и применения лекарств. М.: ОП ПИК «ВИНИТИ»-«Наука»; 2012.
14. Киселев Ф.Л. МикроРНК и рак. Молекулярная биология. 2014; 48 (2): 232.
REFERENcES
1. Global AIDS Update. UNAIDS, 2016. http://www.unaids.org/sites/ default/files/ media_asset/ global-AIDS-update-2016_en.pdf.
2. Chung J., Scherer L.J., Gu A., Gardner A.M., Torres-Coronado M., Epps E.W. et al. Optimized lentiviral vectors for HIV gene therapy: multiplexed expression of small RNAs and inclusion of MGMT(P140K) drug resistance gene. Molec. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther. 2014; 22 (5): 952-63.
3. DiGiusto D.L., Krishnan A., Li L., Li H., Li S., Rao A. et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translationalmedicine. 2010; 36 (2): 36ra43.
REVIEWS
4. Baulina N.M. Kulakova O.G., Favorova O.O. MicroRNAs: role in the development of autoimmune inflammation. Acta Naturae. 2016; 8,1 (28): 23-36. (in Russian)
5. Houzet L., Jeang K. MicroRNAs and human retroviruses. Biochim Biophys Acta. 2011; 1809: 686-93.
6. Bartel D. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 2009; 136: 215-33.
7. Friedman R., Farh K., Burge C., Bartel D. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 2009; 19: 92105.
8. Khaitov M.R. Biosafety and interference RNA. Post-genomic processes, immunonanotechnologies, new principles of creation and application of medicines. [Postgenomnye protsessy, immunonanotekh-nologii, novyeprintsipy sozdaniyaIprimeneniya lekarstv]. Moscow: OP PIK "VINITI" - "Nauka"; 2012. (in Russian)
9. Fowler L., Saksena N.K. Micro-RNA: new players in HIV-pathogenesis, diagnosis, prognosis and antiviral therapy. AIDS Rev. 2013; 15: 3-14.
10. Peterson S.M., Thompson J.A., Ufkin M.L., Sathyanarayana P., Liaw L., Congdon C.B. Common features of microRNA target prediction tools. Front Genet. 2014; 5: 23.
11. Lewis B., Burge C., Bartel D. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 2005; 120: 15-20.
12. Calin G., Sevignani C., Dumitru C. et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101: 2999-3004.
13. Croce C. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat. Rev. Genet. 2009; 10: 704-14.
14. Kiselev F.L. MicroRNAs and cancer. Moleculyarnaya biologiya. 2014; 48(2): 232. (in Russian)
15. Scaria V., Hariharan M., Maiti S., Pillai B., Brahmachari S.K. Hostvirus interaction: a new role for microRNAs. Retrovirology. 2006; 3: 68.
16. Shan J., Lee Y., Yeom K., Kim Y., Jin H., Kim V. The Drosha-DGCR8 complex in primary microRNA processing. Genes Dev. 2004; 18: 3016-27.
17. Schwartz D., Hutvagner G., Du T., Xu Z., Aronin N., Zamore P. Asymmetry in the Assembly of the RNAi Enzyme Complex. Cell. 2003; 115: 199-208.
18. Meister G., Landthaler M., Peters L., Chen P., Urlaub H., Lurhmann R., Tuschl T. Identification of Novel Argonaute-Associated Proteins. Current Biology. 2005; 15(23): 2149-55.
19. MacRae I.J., Ma E., Zhou M., Robinson C.V., Doudna J.A. In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008; 105(2): 512-7.
20. Narayanan A., Kehn-Hall K., Bailey C., Kashanchi F. Analysis of the roles of HIV derived microRNAs. Exp. Op. Biol. Theor. 2011; 11: 17-29.
21. Kulkarni M. On track with P-bodies. Biochem. Soc. Trans. 2010; 38: 242.
22. Wang Y., Juranek S., Li H., Sheng G., Wardle G., Tuschl T. Nucleation, propagation and cleavage oftarget RNAs in Ago silencing complexes. Nature. 2009; 461: 754-61.
23. Buhler M., Moazed D. Transcription and RNAi in heterochromatic gene silencing. Nat. Struct. Mol. Biol. 2007; 14: 1041-8.
24. Boss I., Renne R. Viral miRNAs: tools for immune evasion. Curr OpinMicrobiol. 2010; 13: 540—5.
25. Watanabe Y., Kishi A., Yachie N., Kanai A., Tomita M. Computational analysis of microRNA-mediated antiviral defense in humans. FEBS Lett. 2007; 581: 4603-10.
26. Hariharan M., Scaria V., Pillai B., Brahmachari S. Targets for human en- coded microRNAs in HIV genes. Biochem Biophys Res. Commun. 2005; 337: 1214-8.
27. Huang J., Wang F., Argyris E. et al. Cellular microRNAs contribute to HIV-1 latency in resting primary CD4+ T lymphocytes. Nat. Med. 2007; 13: 1241-7.
28. Nathans R., Chu C., Serquina A., Lu C., Cao H., Rana T. Cellular mi-croRNA and P bodies modulate host-HIV-1 interactions. Mol. Cell. 2009; 34: 696-709
29. Tan Gana N.H., Onuki T., Victoriano A.F., Okamoto T. MicroRNAs in HIV-1 infection: an integration of viral and cellular interaction at the genomic level. Front Microbiol. 2012; 3: 306.
30. Sun G., Li H., Wu X. et al. Interplay between HIV-1 infection and host microRNAs. Nucleic Acids Res. 2012; 40: 2181-96.
ОБЗОРЫ
31. Kedzierska K., Crowe S. The role of monocytes and macrophages in the pathogenesis of HIV-1 infection. Curr Med. Chem. 2002; 9: 1893-903.
32. Wang X., Ye L., Zhou Y., Wang Y., Metzger D., Ho W. Cellular microRNA expression correlates with susceptibility of monocytes/ macrophages to HIV-1 infection. Blood. 2009; 113: 671—4.
33. Wang X., Ye L., Zhou Y., Liu M., Zhou D., Ho W. Inhibition of anti-HIV microRNA expression: a mechanism for opioid-mediated enhancement of HIV infection of monocytes. Am. J. Path. 2011; 178: 41-7.
34. Witwer K., Watson A., Blankson J., Clements J. Relationships of PBMC microRNA expression, plasma viral load, and CD4+ T-cell count in HIV-1-infected elite suppressors and viremic patients. Retrovirology. 2012; 9: 5.
35. Rossi R.L., Rossetti G., Wenandy L., Curti S., Ripamonti A., Bonnal R.J. et al. Distinct microRNA signatures in human lymphocyte subsets and enforcement of the naive state in CD4+ T cells by the microRNA miR-125b. Nat. Immunol. 2011; 12: 796-803.
36. Xi S., Yang M., Tao Y., Xu H., Shan J., Inchauste S. et al. Cigarette smoke induces C/EBP-beta-mediated activation of miR-31 in normal human respiratory epithelia and lung cancer cells. PLoS One. 2010; 5: Re13764
37. Dudaronek J.M., Barber S.A, Clements J.E. CUGBP1 is required for IFNbeta-mediated induction of dominant-negative CEBPbeta and suppression of SIV replication in macrophages. J. Immunol. 2007; 179: 7262-9.
38. Aprelikova O., Yu X., Palla J., Wei B.R., John S., Yi M. et al. The role of miR-31 and its target gene SATB2 in cancer-associated fibroblasts. Cell Cycle. 2010; 9: 4387-98.
39. Yeung M., Bennasser Y., Myers T., Jiang G., Benkirane M., Jeang K. Changes in microRNA expression profiles in HIV-1-transfected human cells. Retrovirology. 2005; 2: 81.
40. Bennasser Y., Le S., Benkirane M., Jeang K. Evidence that HIV-1 encodes an siRNA and a suppressor of RNA silencing. Immunity. 2005; 22: 607-19.
41. Hayes A., Qian S., Yu L., Boris-Lawrie K. Tat RNA silencing suppressor activity contributes to perturbation of lymphocyte miRNA by HIV-1. Retrovirology. 2011; 8: 36-48.
42. Triboulet R., Mari B., Lin Y. et al. Suppression of microRNA-silencing pathway by HIV-1 during virus replication. Science. 2007; 315: 1579-82.
43. Houzet L., Yeung M., de Lame V., Desai D., Smith S., Jeang K. MicroRNA profile changes in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) seropositive individuals. Retrovirology. 2008; 5: 118.
44. Roberts A., Lewis A., Jopling C. The role of microRNAs in viral infection. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 2011; 102: 101-39.
45. Sung T., Rice A. miR-198 inhibits HIV-1 gene expression and replication in monocytes and its mechanism of action appears to involve repression of cyclin T1. PLoSPathog. 2009; 5: Re1000263.
46. Zhu L., Qui C., Qui C. et al. MicroRNA profile identifies different outcomes of disease progression at later stage of HIV infection. XIX IAS Conference. Washington DC; 2012: M0PE026.
47. Omoto S., Fujii Y. Regulation of human immunodeficiency virus 1 transcription by nef microRNA. J. Gen. Virol. 2005; 86: 751-5.
48. Couturier J., Root-Bernstein R. HIV may produce inhibitory microRNAs (miRNAs) that block production of CD28, CD4 and some interleukins. J. Theor. Biol. 2005; 235: 169-84.
49. Klase Z., Winograd R., Davis J. et al. HIV-1 TAR miRNA protects against apoptosis by altering cellular gene expression. Retrovirology. 2009; 6: 18.
50. Kaul D., Ahlawat A., Gupta S. HIV-1 genome-encoded hiv1-mir-H1 impairs cellular responses to infection. Mol. Cell Biochem. 2009; 323: 143-8.
51. Lamers S., Fogel G., McGrath M. HIV-miR-H1 evolvability during HIV pathogenesis. Biosystems. 2010; 101: 88-96.
52. Capodici J., Kariko K., Weissman D. Inhibition of HIV-1 infection by small interfering RNA-mediated RNA interference. J. Immunol. 2002; 169: 5196-201.
53. Chang L., Liu X., He J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Therapy. 2005; 12: 1133-44.
54. Bowden D., Pusch O., Silbermann R., Lee F., Tucker L., Ramratnam B. Enhanced gene silencing of HIV-1 specific siRNA using microRNA designed hairpins. Nucleic Acids Res. 2004; 32: 1154-8.
55. Anderson J., Li M., Palmer B. et al. Safety and efficacy of a lentiviral vector containing three anti-HIV genes - CCR5 ribozyme, tat-rev siRNA, and TAR decoy - in SCID-hu mouse-derived T cells. Mol. Ther. 2007; 15: 1182-8.
56. Kumar P., Ban H., Kim S. et al. T cell-specific siRNA delivery suppresses HIV-1 infection in humanized mice. Cell. 2008; 134: 577-86.
57. Jopling C., Yi M., Lancaster A., Lemon S., Sarnow P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific MicroRNA. Science. 2005; 309: 1577-81.
58. Janssen H., Reesink H., Zeuzem S. et al. A randomized, doubleblind, placebo (plb) controlled safety and anti-viral proof of concept study of miravirsen (MIR), an oligonucleotide targeting miR-122, in treatment naive patients with genotype 1 (gt1) chronic HCV infection. Hepatology. 2011; 54: 1430.
59. Stenvang J., Petri A., Lindow M., Obad S., Kauppinen S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 2012; 3: 82.
60. Kerrigan D. Control of HIV through a cell surface protein, HLA-C, and its complicated regulation. USA: Centre for Cancer Research; 2011.
61. Kulkarni S., Savan R., Qi Y. et al. Differential microRNA regulation of HLA-C expression and its association with HIV control. Nature. 2011; 472: 495-8.
62. Wahid F., Shehzad A., Khan T., Kim Y. MicroRNAs synthesis, mechanism, function, and recent clinical trials. Biochim. Biophys Acta. 2010; 1803: 1231-43.
63. Beal J., Hakim A. Therapy Analysis - microRNA. Pharmaprojects Update Analysis. 2008; 29(4): 3-20.
64. Das A.T., Brummelkamp T.R., Westerhout E.M., Vink M., Madiredjo M., Bernards R., Berkhout B. Human immunodeficiency virus type 1 escapes from RNA interference-mediated inhibition. J. Virol. 2004; 78: 2601-5.
65. Lewis B., Burge C., Bartel D. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 2005; 120: 15-20.
Поступила 17.10.17 Принята к печати 16.12.17
