CC BY
121
УДК 615.322:582.287.237
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗОЛЯ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ. III. ВЛИЯНИЕ СОСТАВА СЫРЬЯ НА ВЫХОД ЭКСТРАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ*
© М.А. Сысоева1, О.Ю. Кузнецова1 , В.С. Гамаюрова1, П.П. Суханов1, Г.К. Зиятдинова2,
Г.К. Будников2
1 Казанский государственный технологический университет, ул. К. Маркса,
68, Казань, 420015, Республика Татарстан (Россия)
E-mail: [email protected]
2Казанский государственный университет, ул. Кремлевская, 18, Казань,
420008, Республика Татарстан (Россия) E-mail: [email protected]
Проведено исследование сырья чаги, полученных из него водных извлечений и выделенных полифенолоксикарбоновых комплексов (ПФК) с помощью метода ЯМР-релаксации. Определена антиоксидантная активность водных вытяжек, полученных с помощью разных способов экстракции и из различных образцов сырья. Показано, что состав полимерных компонентов у всех образцов сырья в основном одинаков, но каждое сырьё отличается по степени доступности компонентов. На формирование и состав ПФК влияет подвижность длинной компоненты спада свободной индукции (ССИ) исходного сырья. Определено, что ПФК может быть сформирован как из двух, так и из трёх типов полимерных структур с разной молекулярной подвижностью. Водные извлечения, полученные с помощью одного способа экстракции, из всех исследованных образцов сырья, с различными релаксационными характеристиками, имеют близкие значения антиоксидантной активности.
Введение
На основе водных извлечений чаги готовят препараты в промышленных и домашних условиях, которые используют для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний, рака различной этиологии [1-
3]. ПФК, выделяемый из водных извлечений чаги, относят к биогенным стимуляторам, имеющим широкий диапазон действия на подавленные ингибиторами ферментные системы и обладающим высокой активностью в восстановлении нарушенного болезнью эритропоэза [4].
Поступающие на переработку наросты чаги неоднородны. В продольном сечении они имеют три слоя, которые отличаются по цвету и плотности: очень плотный верхний чёрный, менее плотный тёмнокоричневый и рыхлый светло-коричневый. Указанные слои содержат разное количество экстрактивных веществ, в том числе и полимеров. Верхний слой содержит наибольшее количество зольных элементов и водорастворимых веществ. Содержание лигнина в слоях приблизительно равно 28-30% на сухой вес гриба, а целлюлозы, гемицеллюлоз и водорастворимого полисахарида существенно ниже. Количество в слоях целлюлозы и гемицеллюлоз увеличивается от верхнего слоя к рыхлому, и изменяется от 1,9 до 9,1% и от 8,3 до 15,9% соответственно. Содержание водорастворимого полисахарида и ПФК уменьшается от верхнего слоя к рыхлому от 4,8 до 2,1% и от 16,0 до 9,2% соответственно [5]. Необходимо отметить, что заготавливаются только верхний и плотный слои.
* Предыдущее сообщение: Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С., Халитов Ф.Г., Суханов П.П. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами // Вестник Казанского технологического университета (КГТУ). 2003. №2. С. 172-176.
Автор, с которым следует вести переписку.
В состав ПФК входит полимер, синтезируемый грибом на основе лигнина [6]. Он также имеет нерегулярное строение, и его структурными единицами являются эфиры синапового и кониферилового альдегидов, ванилин, сиреневый альдегид, сиреневая, ванилиновая, п-оксибензойная, галловая и протокатеховая кислоты и их производные [1, 4, 7]. В полифенольный комплекс входят также свободные и связанные фенолы и углеводы, флавоноиды, карбоновые кислоты и др. [2]. Окраску полифенолам придают меланины, отнесенные к алломеланинам [8].
В состав сырья, водных извлечений и выделяемых из них ПФК входят структурные полимеры, которые могут быть различно организованы в сырье, в водной среде и в ПФК. Их состояние и организация должны влиять на физико-химические и биологические свойства сырья, водных извлечений и ПФК.
Целью исследования является изучение способа организации структурных полимеров в сырье, водных извлечениях чаги, ПФК и его влияние на физико-химические и антиоксидантные свойства водных извлечений и ПФК.
Актуальность поставленной задачи заключается в расширении представлений о строении сырья и выделяемых из него продуктов, обладающих биологической активностью. Полученные результаты могут быть использованы для характеристики поступающего на переработку сырья, для его стандартизации, выбора метода получения водных извлечений и анализа ПФК.
Экспериментальная часть
Для проведения исследования сырьё закупали в аптечной сети. Производитель, партия, дата выпуска сырья приведены ниже:
1) ОАО «Татхимфармпрепараты» (Казань), серия 02032001, 2001 г.;
2) ЗАО «ТЕХМЕДСЕРВИС» (Москва), серия 200502, 2002 г.;
3) АДОНИС АО (Санкт-Петербург), серия 60603, 2003 г.;
4) ООО «ФАРОС-21» (Краснодар), серия 02052003, 2003 г;
5) ООО «Травы Башкирии» (Уфа), серия 270602, 2002 г.;
6) Лекарственные травы ЗАО «АРНИКА» (Санкт-Петербург), серия 00270802, 2002 г.;
7) АОА «Красногорсклексредства» (МО, Красногорский район), серия НАО 20803, 2003 г.;
8)ООО «Травы Башкирии»* (Уфа), серия 100603. 2003 г.;
9) АОА «Красногорсклексредства»* (МО, Красногорский район), серия НАО 21003, 2003 г.
В тексте статьи использованы названия фирм поставщиков сырья чаги.
Водные вытяжки чаги приготовлялись ремацерацией по [3], реперколяцией согласно технологии производства бефунгина [9] и с применением перемешивания с помощью встряхивателя в режиме 50 колебаний в минуту, при температуре 70 °С в течение семи часов.
Выделение из водной вытяжки и определение содержания полифенольного комплекса (ПФК) проведено согласно фармацевтической статье на бефунгин (ФС 42-3291-96).
Количество углеводов в водных извлечениях чаги определено фенолсернокислотным методом [10, 11].
Определение сухого остатка и зольности проведено по [12].
Параметры релаксации водных вытяжек чаги и ПФК определены на лабораторном ЯМР-релаксометре с частотой резонанса 19 МГц и временем нечувствительности приёма передающего тракта 8 микросекунд при 20 °С. Времена поперечной ядерной магнитной релаксации определялись методами КПМГ у водных вытяжек и по ССИ - у сухих остатков [13].
Антиоксидантную активность определяли кулонометрически. Электрогенерацию брома осуществляли на потенциостате П-5827 М при постоянной силе тока 5,0 мА из водных 0,2 М растворов КВг в 0,1 М Н2804 с определением конца титрования амперометрической индикацией с двумя поляризованными платиновыми электродами (ДЕ=300 мВ). В кулонометрическую ячейку вносили 20,0 мл фонового раствора и аликвоту исследуемого образца (0,1 ^3,0 мл). Для титрования брали аликвоты с таким расчетом, чтобы время титрования не превышало 5 мин.
Фиксировали изменение индикаторного тока во времени. По перегибу на индикаторных кривых находили конечную точку титрования (к.т.т.) и рассчитывали величину антиоксидантной активности как количество электричества в кулонах на 100 г сухого сырья [14, 15].
Обсуждение результатов
С точки зрения молекулярной подвижности шесть образцов исследованного сырья и полученных из него ПФК, согласно релаксационным характеристикам, приведенным в таблице 1, имеют двухкомпонентную структуру. Обе компоненты соответствуют жесткоцепным полимерным формам, однако имеют существенные различия. Длинная компонента, описываемая временем спин-спиновой релаксации Т2Ь отвечает за состояние более аморфной и, соответственно, менее упорядоченной протонсодержащей структурной компоненты. Короткое время Т22 характеризует состояние более упорядоченной или кристаллической компоненты. Во всех шести образцах сырья более жесткая компонента составляет около двух третей (в среднем 66%) от общего количества протонсодержащего вещества, а менее жесткая компонента с более развитым молекулярным движением - приблизительно одну треть общего объёма (в среднем 34%). Качественно аналогичная картина наблюдается у шести образцов ПФК (1-6 в таблице 1). Согласно литературным данным [1], ПФК относят к аморфным комплексам, со средним содержанием в сырье около 25%, что качественно соотносится с содержанием длинной компоненты ССИ в сырье. Однако основу ПФК составляет трёхмерный полимер нерегулярного строения, имеющий в своем составе остатки сиреневой, параоксибензойной и ванилиновой кислот [7], поэтому подвижность этого компонента ПФК явно ограничена. Кроме того, в состав ПФК входят алломеланины [8]. Из-за жесткой структуры этих полимеров, можно предположить, что они входят в состав жёсткой компоненты исследуемых комплексов, а также сырья. Также известно, что ПФК имеет в своём составе и кристаллические соединения, такие, например как полисахариды [2], что подтверждается также и нашими исследованиями [16, 17]. Для разрушения структуры ПФК и выделения перечисленных соединений применяют щелочной или кислый гидролиз. Необходимо отметить, что обе жесткоцепные полимерные формы присутствуют как в сырье, так и в ПФК. Длинные времена Ти в ПФК в среднем существенно ниже, чем для исходного сырья, при этом в ПФК заметно возрастает средняя доля той же фазы. Это может свидетельствовать о присутствии более жестких, в том числе кристаллических участков в ПФК, поскольку именно полисахариды переходят в состав ПФК при выделении его из водного извлечения. Возможно также и изменение упаковки компонентов в ПФК, в различном соотношении переходящих из сырья во время экстракции, при формировании коллоидного раствора водного извлечения.
Согласно данным, приведенным в таблице 2, наибольшие различия в количестве и качестве более подвижной компоненты в ПФК по сравнению с чагой, из которой он был выделен, наблюдаются у образцов 5, 2, 1. Наименьшим изменениям подвергается образец 6, промежуточное положение занимают образцы 3 и 4. Согласно данным по зольности водных извлечений, приведенным в таблице 3, наблюдается хорошая корреляция обсуждаемых параметров с зольностью водных вытяжек и содержанием в них полисахаридов. Образцы 3 и 4 имеют самое высокое содержание зольных элементов и полисахаридов в водных извлечениях. Более высокое содержание ПФК наблюдается у образца 3, причём длинная и короткая компоненты ССИ как у сырья, так и у ПФК этого образца максимальны среди данных шести образцов сырья, в том числе и по сравнению с образцом 4. Вероятно, поэтому выход ПФК на 5% выше при экстракции сырья из 3 образца, чем из 4. Водные извлечения из образцов сырья 5, 2, 1 имеют близкие значения зольности и содержание полисахаридов. Их содержание ниже по сравнению с извлечениями из сырья образцов 3 и 4. При почти равном содержании полисахаридов и ПФК в водном извлечении из сырья
6, по сравнению с извлечениями из сырья 5, 2, 1, зольность образца 6 ниже. По всей видимости, при экстракции определенное содержание зольных элементов в вытяжке способствует формированию золя и влияет на состав и компоновку полимерной структуры ПФК.
В образце 7 (табл. 1) жесткая компонента так же, как и у других исследованных образцов, составляет около двух третей (66%) от общего количества протонсодержащего вещества, а длинная компонента составляет приблизительно одну треть общего объёма (34%). Однако длинная компонента ССИ этого образца относительно велика, а короткая компонента - минимальна. При анализе ПФК, выделенного из водного извлечения, полученного ремацерацией из сырья образца 7, обнаружено, что он сформирован из трех структурных компонентов. В нём имеется две более подвижные или менее упорядоченные структуры, составляющие 8 и 71% от общего количества протонсодержащего вещества, а также более упорядоченная компонента, составляющая 21%. ПФК, выделенный из этого водного извлечения, имеет две фазы. Первая содержит полимерные структуры, полностью соответствующие содержащимся в сырье, а вторая в процессе экстракции и выделения ПФК претерпевает существенные изменения. Содержание этих структур в ПФК составляет 30 и 70%, т.е. они приблизительно соотносятся как 1 к 2. Согласно данным,
приведенным в таблице 3, водное извлечение, полученное с помощью ремацерации, имеет самое высокое содержание полисахаридов при достаточно высокой зольности и более высоком, на 1-2%, содержании ПФК. Можно предположить, что в процессе экстракции полисахариды, экстрагируемые из сырья в большем, чем обычно количестве, затрудняют формирование её золя и стабилизацию в его составе ПФК. В большей степени они участвуют в формировании ПФК при выделении, что сказывается на его выходе и структуре. Известно, что при выделении ПФК из водного извлечения полисахариды почти полностью переходят в состав ПФК и ассоциируются с его структурами настолько сильно, что для их количественного определения приходится использовать химический гидролиз в жестких условиях [2, 16, 17].
Таблица 1. Параметры ЯМР-релаксации сырья и выделенного из него ПФК
№ Длинная компонента ССИ Короткая компонента ССИ
Т21, мкс Рі Т 22? мкс Р2
Сырье - чага
1 Татхимфармпрепараты 92 31 18.5 69
2 Техмедсервис 91.5 34 17 66
3 Адонис 96 35 19.5 65
4 Фарос 85 32 18 68
5 Башкирское 79 37 18 63
6 Арника 87 35 18 65
7 Краскногорск 158 34 14 66
Полифенольный комплекс
1 Татхимфармпрепараты 71 42 20.5 58
2 Техмедсервис 72 46 19 54
3 Адонис 73.5 42 22 58
4 Фарос 69 41 20 59
5 Башкирское 73 45 19 55
6 Арника 56 33 20 67
7 Краскногорск 166;38 8;71 14 21
Таблица 2. Разница в населенности длинной компоненты ССИ ПФК и исходного сырья общего
происхождения
№ Производитель ДР = Р1 (ПФК) - Р2 (сырье)? %
1 Татхимфармпрепараты 11
2 Техмедсервис 12
3 Адонис 7
4 Фарос 9
5 Башкирское 12
6 Арника -2
Таблица 3. Экстрактивные вещества и антиоксидантная активность водных извлечений чаги, полученных разными способами экстракции из сырья различных поставщиков
№ Сырье Способ экстрак- ции Содержание в водной вытяжке АЕ водных вытяжек, кКл/100г
Выход ПФК, % Сугл, % Сухой остаток, г Зольность, г
1 Татхимфармпрепараты РЕМ 9,44 2,28 1,94 0,55
2 Техмедсервис РЕМ 9,75 1,84 1,52 0,65 29,40±0,2
3 Адонис РЕМ 14,70 2,84 2,38 1,37
4 Фарос РЕМ 9,66 2,70 2,12 1,17
5 Башкирское РЕМ 10,50 2,30 1,27 0,65
6 Арника РЕМ 11,39 1,86 1,60 0,44 28,35±0,2
7 Красногорск РЕМ 11,80 3,62 2,66 0,74 28,08±0,3
РЕП 9,80 3,00 1,79 0,71 24,22±0,2
МП 6,80 2,40 1,45 0,47 39,68±0,3
8 Башкирское* РЕМ 9,25 2,30 0,97 0,58 29,61±1,8
9 Красногорск* РЕМ 9,30 1,56 1,55 0,64 32,82±0,2
Примечание:* Сырье другой партии.
Проведено исследование водных извлечений и ПФК методом ЯМР-релаксации из сырья образца 7 другими способами экстракции - реперколяцией и с помощью механического перемешивания.
Исследование вытяжек показало, что они отличаются по параметру однородности, молекулярной подвижности дисперсной фазы А в ряду:
однородность водной фа’зы ^ ^ неоднородность ВОДНОЙ фгПЫ
Вытяжки, полученные с помощью других способов экстракции, характеризуются иным содержанием анализируемых компонентов, что представлено в таблице 3. Вытяжка, полученная с помощью ремацерации, отличается от извлечений других способов экстракции максимальным количеством экстрактивных веществ, полисахаридов и выходом ПФК. ПФК, выделенные из вытяжек, полученных с помощью реперколяции и механического перемешивания, имеют в своем составе полимерные структуры, качественно и количественно отличающиеся от тех, которые присутствовали в исходном сырье. Соотношение более и менее подвижных жестких компонент составляет: 1 : 1 - в ПФК, выделенном из извлечения реперколяцией, и 2 : 1 - в ПФК, выделенном из извлечения, полученного при механическом перемешивании. Указанное соотношение для ПФК, выделенного из извлечения, полученного ремацерацией, составляет 1 : 2. Таким образом, при смене способа экстракции из сырья, имеющего аномально высокое значение длинной компоненты ССИ, происходят изменения в формировании самого водного извлечения и выделенного из него ПФК. Аналогичная зависимость количественных характеристик водных извлечений и молекулярной подвижности дисперсной фазы А от способа получения водного извлечения получена ранее для другого сырья (1,38, 1,47 и
1,58 соответственно приведенной схеме) [17]. Следовательно, вне зависимости от структуры сырья, смена способа получения водной вытяжки приводит к изменению в формировании золя водного извлечения, а также в формировании выделенного из него ПФК.
В целом состав полимерных компонентов у всех видов сырья в основном одинаков, но каждое сырьё отличается по степени доступности компонентов.
Для определения биологической активности полученных водных извлечений была исследована их антиоксидантная активность с помощью кулонометрии, результаты приведены в таблице 3. Отличие структур ПФК, определенных с помощью метода ЯМР-релаксации, хорошо соотносится с антиоксидантной активностью водных извлечений, полученных из разного сырья. Водные вытяжки, полученные ремацерацией из образцов сырья 2, 6, 7 имеют близкую антиоксидантную активность. При смене способа получения водного извлечения из сырья образца 7 изменяется её антиоксидантная активность.
Высокая антиоксидантная активность водной вытяжки, полученной при механическом перемешивании, при низком содержании ПФК, может быть обусловлена тремя причинами. Первая из них заключается в том, что низкая зольность вытяжки, не обеспечивающая стабилизацию ПФК в процессе экстракции, способствует экстракции из сырья других соединений, обладающих антиоксидантной активностью, например, фенолов. Второй причиной может являться то, что указанное извлечение занимает промежуточное положение по неоднородности в рассматриваемых вытяжках. И, наконец, соотношение более подвижной и жесткой компонент в ПФК составляет 1 : 1, что может сказываться на повышении его антиоксидантной активности в водном извлечении по сравнению с ПФК, имеющими другое соотношение фаз. Водные извлечения, полученные ремацерацией и реперколяцией, имеют близкие значения антиоксидантной активности и в то же время сильно различаются по однородности водной фазы. Следовательно, можно предположить, что вклад первой причины увеличения антиоксидантной активности водной вытяжки, полученной с помощью механического перемешивания, является определяющим.
Выводы
Определено, что состав полимерных компонентов у всех видов сырья в основном одинаков, но каждое сырьё отличается по степени доступности компонентов.
Показано, что содержание зольных элементов и полисахаридов в водных извлечениях влияет на формирование ПФК.
Подтверждено, что в зависимости от способа экстракции происходит различное формирование золя водного извлечения, что отражается на его физико-химических свойствах и антиоксидантной активности. Структура ПФК также меняется со сменой способа получения водного извлечения, что подтверждается изменением физико-химических свойств ПФК.
Установлено, что проведенный анализ сырья чаги, его водных извлечений и выделенных из них ПФК с помощью ЯМР-релаксационного метода позволяет более полно охарактеризовать эти объекты. Полученные результаты подтверждаются их физико-химическими и антиоксидантными свойствами.
Список литературы
1. Шиврина А.Н. Химическая характеристика действующих начал чаги // Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. М.; Л., 1966. С. 49-56.
2. Рыжова Г.Л., Кравцова С.С., Матасова С.А., Грибель Н.В. и др. Химические и фармакологические свойства сухого экстракта чаги // Химико-фармацевтический журнал. 1997. №10. С. 44-47.
3. Якимов П.А., Андреева С.М., Алексеева Е.В. Методы переработки чаги в лекарственные формы // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. М.; Л., 1961. С. 129-138.
4. Якимов П.А. Общая биологическая и химическая характеристика чаги как исходного сырья для получения лечебных препаратов // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л., 1959. С. 36-49.
5. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. О химическом составе чаги // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л., 1959. С. 55-61.
6. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. К вопросу о природе и происхождении водорастворимого пигментного комплекса, образуемого трутовым грибом чага // Биохимия. 1959. Т. 24. Вып. 1. С. 67-72.
7. Шиврина А.Н. Биологически активные вещества высших грибов. М.; Л., 1965. 199 с.
8. Кукулянская Т.А. Курченко Н.В., Курченко В.П., Бабицкая В.Г. Физико-химические свойства меланинов, образуемых чагой в природных условиях и при культивировании // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. №1. С. 68-72.
9. Муравьев И.А. Технология лекарств. М., 1980. 704 с.
10. Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J. K., Rebers P. A., Smith F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances // Analytical Chemistry. 1956. V. 28. P. 350-356.
11. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев, 1982. 192 с.
12. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд., доп. М., 1987. 389 с.
13. Фаррер Т., Беккер Э. Импульсная и Фурье-спектроскопия ЯМР. М., 1973. 179 с.
14. Абдуллин И.Ф., Турова Е.Н., Будников Г.К., Зиятдинова Г.К., Гайсина Г.Х. Электрогенерированный бром -реагент для определения антиоксидантной способности соков и экстрактов // Заводская лаборатория. 2002. Т. 68. №9. С. 12-15.
15. Абдуллин И.Ф., Турова Е.Н., Гайсина Г.Х., Будников Г.К. Применение электрогенерированного брома для оценки интегральной антиоксидантной способности лекарственного растительного сырья и препаратов на его основе // Журнал аналитической химии. 2002. Т. 57. №6. С. 666-670.
16. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Гамаюрова В.С. Способы получения водных вытяжек чаги // Химия и технология растительных веществ: матер. II Всероссийской конференции. Казань, 2002. С. 131.
17. Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С., Халитов Ф.Г., Суханов П.П. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами // Вестник Казанского технологического университета (КГТУ). 2003. №2. С. 172-176.
Поступило в редакцию 15 августа 2004 г. После переработки 5 ноября 2004 г.
