CC BY
351
М. А. Сысоева, О. Ю. Кузнецова, В. С. Гамаюрова,
П. П. Суханов, Г. К. Зиятдинова, Г. К. Будников
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И СВОЙСТВА ПОЛИФЕНОЛОВ ЧАГИ
Водные извлечения чаги широко применяются для лечения предраковых и раковых заболеваний. Основным действующим веществом, обеспечивающим терапевтический эффект водных вытяжек, являются полифенолы чаги. Для описания их структурной организации создана модель, которая хорошо согласуется с литературными данными и проведенными нами комплексными исследованиями сырья, водных извлечений, выделенных полифенолов. Показано, что антиоксидантная активность полифенолов чаги зависит от их структурной организации.
В последнее время актуальной проблемой является разработка и внедрение в производство новых групп лекарственных средств и биологически активных добавок (БАД) с целевым назначением, включая препараты с тонизирующим, профилактическим и лечебным действием [1]. При приготовлении различных биологически активных комплексов для расширения ассортимента их обогащают антиоксидантами (полифенолами, биофлавонои-дами), используя различные экстракты из природного сырья [2]. Введение в лекарственные препараты и БАДы антиоксидантов снижает опасность сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, вызываемых образованием свободных радикалов [3-4].
Экстракты трутового гриба чаги obliquus) применяют в официальной и на-
родной медицине в качестве противоракового, тонизирующего, очищающего кровь и болеутоляющего лекарственного средства. Прием водных настоев чаги уменьшает боль и улучшает состояние пациента, снимает изжогу. Эти настои применяются также при хроническом гастрите и других заболеваниях желудочно-кишечного тракта, включая язву [5].
Лечебное действие чаги обусловлено присутствием в ее составе основного действующего вещества, обладающего фармакологической и терапевтической активностью -полифенолоксикарбонового комплекса (ПФК), помимо которого водой извлекаются также производные фенольных альдегидов, стероидные, птериновые соединения, зольные элементы и др. [6]. Эти компоненты стимулируют усиление иммунитета организма на воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды [7], в частности, радиационного облучения.
Поскольку препараты на основе чаги используются для лечения рака различной этиологии, эрозивных состояний желудочно-кишечного тракта, относящихся к свободнорадикальным патологиям, то изучение структурной организации и свойств полифенолов чаги является актуальным.
В настоящее время в научной литературе недостаточно сформировано представление о структуре сложных полимерных консорциумов, таких как, гуминовые кислоты, дубильные вещества, полифенолы различной этиологии, и, в частности, полифенолы трутового гриба чаги. Формирование этих объектов связано с биосинтезом различных биологических объектов и, поэтому, они могут отличаться по молекулярной массе, расположению полимерных компонентов относительно друг друга, включению в свой состав низкомолекулярных и неорганических компонентов. В водных и буферных средах описанные объекты ведут себя как гидрофильные коллоидные системы. Мицеллы образуемых золей стабилизируются
в дисперсионной среде за счет наличия на их поверхности большого количества полярных группировок. Формирование представлений о структуре таких консорциумов позволит более полно определить их физические, химические и биологические свойства.
В процессе жизнедеятельности чага синтезирует трёхмерный полимер на основе древесного лигнина, полисахариды на основе целлюлозы и гемицеллюлоз. Эти полимеры откладываются в мицелии гриба, по-видимому, ассимилируясь с меланинами, другими пигментами, белками, низко молекулярными и неорганическими компонентами. Можно предположить, что при проведении экстракции водой в зависимости от образованных в консорциуме связей, а также гидрофильности входящих в него компонентов в водном извлечении будет формироваться мицелла, состоящая из ассоциата входящих в консорциум компонентов. При этом вероятно, вновь образуемый конгломерат по составу компонентов, объёму и другим свойствам будет отличаться от консорциума молекул находящихся в чаге.
Традиционно в литературе описанный консорциум полимерных молекул, экстрагируемый водой из чаги называли ранее чаговой кислотой [8], затем за ним закрепилось название полифенолоксикарбоновый комплекс (ПФК) [9]. Однако и это название не полностью отражает его природу. Александрова [10] предложила употреблять термин гетерополиконденсат по отношению к гуминовым кислотам. Учитывая близость природы этих объектов можно было бы применить этот термин и к ПФК, однако с химической точки зрения нам кажется более удачно называть ПФК - комплексом.
Цель настоящего исследования состоит в анализе сформированного грибом чагой консорциума полимеров, синтезируемого в процессе его жизнедеятельности, а также формируемого в золе водного извлечения и определение связи антиоксидантной активности со структурой ПФК.
Для этого проведено комплексное исследование сырья, водных извлечений из чаги и ПФК. В работе применены широко используемые методы: ЯМР-релаксации, ИК-спектроскопии, кулонометрического титрования электрогенерированным бромом, химического гидролиза. Оценку физико-химических характеристик водных извлечений осуществляли по стандартным методикам, в соответствии с требованиями ГФ XI [11].
Исследование ПФК представляет определенные трудности, поскольку водные извлечения из чаги являются сложными полидисперсными коллоидными системами, получение которых зависит от условий проведения экстракции. Образование золя водных извлечений чаги оказывает существенное влияние на выход экстрактивных веществ из сырья в раствор, и как следствие, на физико-химические свойства водной вытяжки.
Можно предположить, что коллоидные частицы водных извлечений чаги представлены ПФК, которые образуют мицеллы, имеющие вытянутую или близкую к сферической форму. Это отображено в предлагаемой гипотетической модели мицеллы ПФК, представленной в виде схемы на рисунке 1. На схеме показано расположение полимеров и функциональных групп в комплексе, его окружение в водной вытяжке, что позволяет условно оценить его реакционную способность, объем комплекса и его гидрофильность.
Рис. 1 - Гипотетическая модель строения полифенолоксикарбонового комплекса (ПФК)
Основная полимерная компонента ПФК - это высокомолекулярный трехмерный сетчатый полимер нерегулярного строения, который на представленной схеме изображен черными прерывистыми линиями. Структурными единицами этого полимера являются сиреневые и гваяциловые ядра, а также другие структурные элементы, такие как ванилин, сиреневый альдегид, сиреневая, ванилиновая, n-оксибензойная, галловая и протокатеховая кислоты и их производные. Поскольку ПФК синтезируется грибом чагой на базе лигнино-вых фрагментов, то в зависимости от того, какие фрагменты лигнина формируют полимер, в какой последовательности они будут соединены в полимерной цепи, будет зависеть и содержание функциональных групп в его составе и способность ассимилировать другие полимерные структуры (углеводы, белки и т.д.).
На периферии гетерополиконденсата ассимилированы белки и алломеланины. Показано [12, 13], что полисахариды, входящие в состав гетерополиконденсата, ассоциированы с основной его структурой за счёт сильных и слабых взаимодействий, поэтому было высказано предположение о том, что они могут входить в состав как периферической части гетерополиконденсата, так и располагаться в области близкой к ядру. Сформированный таким образом комплекс имеет на своей поверхности в среднем (в расчете на чистое органическое вещество): 6.50% - карбоксильных, 5.81% -метоксильных, 4.50% - карбоксильных [14], что, вероятно, обеспечивает высокую устойчивость мицелл в водных извлечениях.
После гидролиза ПФК в жестких условиях в нем установлено наличие индивидуальных низкомолекулярных соединений [14].
За счет комплексообразования и сорбции частица ПФК может содержать минеральные компоненты, в первую очередь ионы поливалентных металлов, таких как железо, марганец, кальций.
Как показано на схеме, мицеллы комплекса имеют развитую поверхность, которая придает устойчивость формируемому золю. Чем более развита эта поверхность, тем более высокими антиоксидантными свойствами будет обладать полученный комплекс за счет повышения доступности карбонильных, сопряженных связей и т.д.
Особый интерес представляет связь структурной организации ПФК с биологической активностью водного извлечения, либо выделенного ПФК, на основе которого можно создать биологически активные добавки в таблетированном виде.
Нами проведено комплексное исследование восьми партий сырья чаги различных поставщиков с помощью метода ЯМР - релаксации для определения структурных особенностей и молекулярной подвижности полимерных компонентов, входящих, как в состав сырья, так и в состав ПФК. Согласно релаксационным характеристикам исследованные образцы сырья по молекулярной подвижности имеют двухкомпонентную структуру. Обе компоненты соответствуют жесткоцепным полимерным формам, однако имеют существенные различия. Длинная компонента отвечает за состояние более аморфной и менее упорядоченной протонсодержащей структурной компоненты. Короткая компонента характеризует состояние более упорядоченной или кристаллической компоненты. В целом, состав полимерных компонентов у всех видов сырья в основном одинаков.
Качественно аналогичная картина наблюдается и у соответствующих образцов ПФК. По сравнению с сырьем в ПФК наблюдается возрастание более жестких, кристаллических участков. Это может быть связано с изменением упаковки компонентов в ПФК, в различном соотношении переходящих из сырья во время экстракции и при формировании коллоидной системы водного извлечения, или, например, с переходом полисахаридов в их состав при выделении из водной вытяжки.
На основании полученных результатов трудно приписать короткую и длинную компоненты к конкретному типу структурных фрагментов полимера в сырье и ПФК, поскольку эти полимеры в целом по-разному организованы в сырье, водной вытяжке и ПФК [15].
Строение мицеллы ПФК зависит от проведения процесса экстракции. В вытяжке, в зависимости от примененного способа экстракции, превалирует либо извлечение из сырья высокомолекулярных соединений и формирование в растворе водной вытяжки ПФК, либо экстрагируется больше низкомолекулярных веществ, за счет чего формируется различная коллоидная система водного извлечения чаги. Коллоидная система стабилизируется соотношением, входящих в нее мицелл ПФК с низкомолекулярными компонентами и зольными элементами водных вытяжек.
Методом ЯМР - релаксации показано, что применение различных способов экстракции приводит к формированию индивидуальной водо - полимерной системы в которой поли-фенольные комплексы существенно различаются значениями параметров релаксации [16]. Эти экспериментальные данные подтверждены химическим гидролизом полученных ПФК [17].
Исследовано влияние изменения среды экстракции при введении комплексонов или слабых растворов гидроокиси натрия. Подобраны оптимальные условия экстракции. Оценка полученных результатов проводилась по содержанию ПФК в водной вытяжке. При взаимодействии комплексонов или слабых растворов гидроокиси натрия при экстракции с сырьем и компонентами золя происходит формирование различного состава водной среды, и как следствие, образование различных коллоидных систем водных извлечений чаги, что
сказывается как на параметрах релаксации, так и на антиоксидантной активности водных извлечений и ПФК.
Исследуемые образцы полифенолов и водных извлечений из чаги проанализированы на антиоксидантную активность. Отмечена корреляционная зависимость антиоксидантной емкости с данными, полученными с помощью метода ЯМР - релаксации. Увеличение объёма комплекса и возрастание содержания в нём аморфной компоненты приводит к повышению его антиоксидантной активности.
Показано, что антиоксидантная активность вытяжек, полученных с применением комплексонов практически вдвое ниже (для трилона Б - 6.77±0.8 кКл/100г; для ОДЭФ -7.27±0.7 кКл/100г), чем у водной вытяжки (13.88±0.9 кКл/100г). В то время как антиоксидантная активность ПФК в 1,5±3 раза (для трилона Б - 28.8±0.05 кКл/100г; для ОДЭФ -62.03±0.2 кКл/100г) выше контроля - 19.72±0.05 кКл/100г, что превышает антиоксидантную активность водного извлечения полученного при кипячении - 4.9±0.2 кКл/100г [18]. Под действием высоких температур происходит конденсация ПФК и его уплотнение [12].
С помощью метода ЯМР-релаксации, показано, что при применении ОДЭФ в экстракции формируется пористый кластер максимальных размеров с более широким, чем у остальных ПФК, распределением размеров капилляров и пор, функциональных групп или иных активных центров, по геометрическим параметрам и энергетическим характеристикам рабочей поверхности.
Эти характеристики хорошо согласуются с максимальной антиоксидантной активностью - 62.03±0.2 кКл/100г.
Предлагаемая модель мицеллы ПФК хорошо согласуется с данными, полученными о структурной организации полимерной компоненты, входящей в состав ПФК.
Показано, что антиоксидантная активность водных извлечений и ПФК зависит от формируемого золя водного извлечения и структуры комплекса.
Полученные данные об антиоксидантных свойствах ПФК, позволяют рекомендовать их использование в качестве биологически активных добавок.
Экспериментальная часть
Для проведения исследования сырье закупали в аптечной сети. Производитель, партия, дата выпуска сырья приведены ниже:
1. ОАО «Татхимфармпрепараты» (Казань), серия 02032001, 2001 г.;
2. ЗАО «ТЕХМЕДСЕРВИС» (Москва), серия 200502, 2002 г.;
3. АДОНИС АО (Санкт-Петербург), серия 60603, 2003 г.;
4. ООО «ФАРОС-21» (Краснодар), серия 02052003, 2003 г;
5. ООО «Травы Башкирии» (Уфа), серия 270602, 2002 г.;
6. Лекарственные травы ЗАО«АРНИКА» (Санкт-Петербург), серия 00270802, 2002 г.;
7. АОА «Красногорсклексредства» (МО, Красногорский район), серия НАО 20803, 2003 г.;
8. ООО «Травы Башкирии»* (Уфа), серия 100603. 2003 г.;
9. АОА «Красногорсклексредства»* (МО, Красногорский район), серия НАО 21003, 2003 г.
Водные вытяжки чаги приготовлялись ремацерацией по [19], реперколяцией согласно технологии производства бефунгина [20] и с применением перемешивания с помощью встряхивателя в режиме 50 колебаний в минуту, при температуре 70оС в течение семи часов.
Выделение из водной вытяжки и определение содержания ПФК проведено согласно фармацевтической статье на бефунгин (ФС 42-3291-96).
Определение сухого остатка и зольности проведено по [11].
Введение комплексонов (гидроксиэтилендифосфоновой кислоты (ОДЭФ) и натриевой соли этилендиамин-М,М,М1,Ы1-тетрауксусной кислоты (трилон Б)) осуществлялось двумя способами: 1)
предварительное замачивание сырья в водном растворе комплексона с последующей экстракцией водой; 2) проведение экстракции водным раствором комплексона.
Применение в качестве экстрагента слабощелочных растворов гидроокиси натрия осуществляли на стадии замачивания с последующей ремацерацией водой.
Подбор оптимального времени замачивания сырья в растворах комплексонов и гидроокиси натрия осуществлялся в интервале от 30 мин до 13 час. Концентрация варьировалась от 0,005 до
0.5.г/л.
Параметры релаксации определены согласно [21].
Антиоксидантную активность определяли по [18].
Литература
1. KrugHfrald, Sab Vftthias // Getranke-Ind. 1996. Bd. 50. N. 1. S. 18-20, P. 22-23.
2. Sloan E.A. // Food Technol. 1995. V. 49. N. 8. P. 102.
3. Nutrition, health and autioxidants. / R/A/ Jacob. // INFORM: Int. News Fats, Oils and Relat. Mater. 1994. V. 5. N. 11. P. 1271-1275.
4. Inhibitory effects of beer and other alcoholic beverages on mutagenesis and DNA adduct formation induced by several carcinogens. / Sakae Arimoto-Kobayashi, Chitose Sugiyama, Nanaho Ha-rada, Miyuki Takeuchi, Miyuki Takemura, Nikoya Nayatsu // J. Agr. And Food Chem. 1999. V. 47. N. 1. P. 221-230.
5. D.A,Reid, BR. Mycol. Soc., 206 (3), 42-7 (1976).
6. Епанчинов А.В. Лекарственные растения Урала и Зауралья. -М: Медицина, 1990. -379с.
7. Турова А.Д. Лекарственные растения СССР и их применение. -М: Медицина, 1974. -261с.
8. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. // В сб.: Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. -Л: Медгиз, 1959. -334с.
9. Якимов П.А. // В сб.:Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. -Л: Медгиз, 1959. -334с.
10. Гуминовые вещества в биосфере. / Под ред. Д.С. Орлова. -М: Наука, 1993. -238 с.
11. Государственная фармакопея СССР. 11- е изд., доп. -М.: Медицина, 1987. -389с.
12. Платонова Е.Г. // В сб.: Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. М.-Л.: Наука, 1961. С.63-69.
13. Шиврина А.Н., Платонова Е.Г. // В сб.: Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. М.-Л. Наука, 1966. 135с.
14. Шиврина А.Н. Биологически активные вещества высших грибов. М.-Л: Наука, 1965. -199 с.
15. Исследование золя вводных извлечений чаги III. Влияние состава сырья на выход экстрактивных веществ водных извлечений чаги / М.А. Сысоева, О.Ю. Кузнецова, В.С. Гамаюрова, П.П. Суханов, Г.К. Зиятдинова, Г.К. Будников // Химия растительного сырья. - 2004. - №4. - С. 15-21.
16. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами / Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С., Халитов Ф.Г., Суханов П.П. // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2003. - №2. - С.172-179.
17. Кузнецова О.Ю., СысоеваМ.А., Гамаюрова В.С. // В матер. межрегиональной конференции молодых ученых "Пищевые технологии". - Казань: КГТУ. - 2002. - С.63.
18. Электрогенерированный бром - реагент для определения антиоксидантной способности соков и экстрактов / Абдуллин И.Ф., Турова Е.Н., Будников Г.К., Зиятдинова Г.К., Гайсина Г.Х. // Заводская лаборатория. - 2002. - Т. 68. - №9. - С. 12-15.
19. Якимов П.А., Андреева С.М., Алексеева Е.В. // В сб.: Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. М.-Л. Наука, 1961. С. 129-138.
20. Муравьев И.А. Технология лекарств. -М: Наука, 1980. -704 с.
21. Фаррер Т., Беккер Э. Импульсная и Фурье-спектроскопия ЯМР. -М: Мир, 1973. -179 с.
© М. А. Сысоева - канд. хим. наук, доц. каф. промышленной биотехнологии КГТУ; О. Ю. Кузнецова - асс. той же кафедры; В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф. каф. промышленной биотех-
нологии; П. П. Суханов - д-р хим. наук, проф. каф. процессов и аппаратов химической технологии КГТУ; Г. К. Зиятдинова - асп. каф. аналитической химии КГУ; Г. К. Будников - д-р хим. наук, проф. каф. аналитической химии КГУ.
