CC BY
152
УДК 615.322:582.287.237
М. А. Сысоева, О. Ю. Кузнецова, В. С. Гамаюрова,
П. П. Суханов, Ф. Г. Халитов
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗОЛЯ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ II. ИЗМЕНЕНИЕ ИЗУЧАЕМОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ЭКСТРАКЦИИ РАЗЛИЧНЫМИ СПОСОБАМИ
Проведено исследование полифенольных комплексов (ПФК) чаги, полученных разными способами экстракции, в водных извлечениях и в сухом состоянии. Содержание углеводов в водных извлечениях из чаги и в ПФК, а также методы ЯМР-релаксации и ИК-спектроскопии показали, что ПФК по-разному сформированы в зависимости от способа получения водной вытяжки.
На основе водных извлечений чаги, получаемых противоточным методом, в фармации готовят такие препараты, как бефунгин. Ранее выпускался обеззоленный препарат бин-чага [1], разработан сухой препарат, получаемый с использованием при экстракции ультразвука [2]. В народной медицине используют настой из чаги [3], который рекомендуется использовать в течение 6-7 дней после приготовления. Все эти препараты широко применяются в медицине как средства для лечения неоперабельного рака IV степени, гастритов различной этиологии, как иммуномодуляторы.
Основным действующим веществом водной вытяжки является ПФК, синтезируемый грибом на основе лигнина и занимающий промежуточное положение по своим физико-химическим свойствам между лигнином и гуминовыми кислотами [4]. Он так же, как и другие гуминоподобные вещества, обладает неустойчивой молекулярной структурой, имеет различную степень полимеризации и под действием различных факторов способен легко уплотняться, окисляться и конденсироваться [5]. Эти процессы могут происходить под воздействием различных факторов. Так, например, С.М. Андреевой [5] показано влияние температуры, времени экстракции и сушки на состояние осаждаемого ПФК, полученного по принципу противотока в диффузионной батарее из шести диффузоров с продолжительностью настаивания в каждом по одному часу. Оценка состояния комплекса проведена по содержанию в нём углерода и кислых функциональных группировок. Анализ сырых и высушенных комплексов показал, что при увеличении температуры экстракции и сушки от 50 до 100оС в ПФК происходит увеличение содержания углерода и понижение количества карбонильного кислорода, карбоксильных и метоксильных групп, что связано с уплотнением и конденсацией комплекса. На основании контроля содержания углерода и меток-сильного числа заводских серий препарата из чаги автор дает рекомендацию не выпускать препарат с содержанием углерода в ПФК более 60% в связи с очень сильной степенью уплотнения и конденсацией комплекса. Также в литературе отмечается, что глубокие, необратимые структурные изменения коллоидной системы ПФК чаги вызывают снижение качества препарата [3].
К соединениям, обеспечивающим биологическую активность полифенолов чаги, полученных с использованием при экстракции ультразвука, относят его углеводную компоненту [2]. Ранее было показано, что в водных извлечениях чаги находятся следы редуцирующих сахаров, а основное количество углеводов, от 6 до 8%, представлено полисахаридами, отнесенными к глюканам [6]. При гидролизе 2-нормальной соляной кислотой в
течение 5 часов на водяной бане ПФК природной чаги содержание в его составе сахаров составили до 10% от суммы веществ гидролизата и 2% от исходного [6].
Формирование коллоидного раствора водного извлечения из чаги - это сложный процесс, зависящий от выхода из сырья водорастворимых компонентов. Смена условий экстракции также влияет на состояние ПФК в растворе. Применены три способа экстракции: ре-мацерацией по методике, представленной в [3], реперколяцией (согласно технологии производства бефунгина) и с применением перемешивания при использовании встряхивателя. Показано (табл. 1), что количество выделяемого ПФК, содержание сухого остатка и зольность водной вытяжки зависят от способа получения водной вытяжки. Наибольшее содержание ПФК, наименьшая зольность наблюдается в вытяжке, полученной ремацерацией.
Содержание углеводов, представленных полисахаридами, также зависит от способа получения вытяжки (табл. 2). Их максимальное содержание наблюдается в вытяжке, полученной ремацерацией. Анализ углеводов в фильтрате показывает, что при осаждении ПФК основная их часть переходит в состав ПФК вне зависимости от примененного способа экстракции. Можно отметить, что та часть углеводов, которая переходит в состав ПФК, при осаждении косвенно свидетельствует о различной структуре ПФК, формируемых при разных способах экстракции. Если количество углеводов, перешедших в состав ПФК в результате реперколяции и при перемешивании, почти одинаково, то количество углеводов, перешедших в ПФК при получении водной вытяжки ремацерацией, почти в два раза выше. Следовательно, можно предположить, что ПФК, полученные реперколяцией и при перемешивании, имеют более плотную структуру и более конденсированы, чем ПФК из водной вытяжки, полученой ремацерацией.
Таблица 2 - Содержание свободных углеводов в водных вытяжках чаги (%)
Способ экстракции ПФК Суммарное содержание углеводов
Водная вытяжка Фильтрат Количество углеводов, перешедших из водной вытяжки в ПФК
Реперколяция 8.9 2.00 0.20 1.80
Ремацерация 12.9 4.52 0.46 4.06
Механическое 7.0 2.77 1.00 1.77
перемешивание
Проведение щелочного гидролиза полученных ПФК также подтверждает высказанное предположение. По ходу проведения гидролиза наблюдалось два максимума углеводов, выделяющихся из матрицы полимера и по-разному интегрированных с трехмерным полимером ПФК, образованным остатками сиреневой, ванилиновой и параоксибензойной кислот (табл. 3). Первый максимум можно объяснить выделением полисахаридов, слабо связанных с матрицей ПФК или физически адсорбированных ею. Вероятно, сюда можно отнести и те полисахариды, которые были захвачены ПФК при его выделении из раствора. Из данных, приведенных в табл. 2, 3, видно, что выделение углеводов при проведении гидролиза на первом максимуме в два - три раза выше, чем их количество, перешедшее в ПФК при его выделении из водной вытяжки. Второй максимум, приходящийся на 11- 13 часов гидролиза, характеризует более глубокую деградацию ПФК и выделение полисахаридов, более прочно связанных с его матрицей. Общее содержание углеводов в ПФК также
Таблица 1 - Условия проведения процесса получения водных вытяжек чаги и
содержание в них ПФК
Способ полу- Коли- Время Тем- Коли- Коли- Количе- Сухой Зольность Выход
чения водной чество про- пера- чество чество ство остаток ПФК
вытяжки стадий цесса тура процесса сырья экст-раген-та вытяжки
шт. ч оС г мл мл г г % %
Реперколяция 3 7.5 70 30 320 274 1.54 0.79 40.0 8.9
Ремацерация 2 10.0 70 50 500 450 1.78 0.46 25.8 12.9
Механическое 1 7.0 70 10 110 90 1.36 0.58 42.6 7.0
перемешивание
Таблица 3 - Содержание связанных углеводов полифенольного комплекса (%)
Способ экстракции Суммарное содержание углеводов
Гидролиз ПФК (1-й максимум) Гидролиз ПФК (2-й максимум) Суммарное содержание связанных углеводов ПФК
Реперколяция 6.38 10.00 16.38
Ремацерация 8.90 12.72 21.62
Механическое перемешивание 5.00 5.36 10.05
указывает на различное строение ПФК, формируемых при различных способах экстракции. Как и при анализе углеводов водной вытяжки, содержание углеводов в ПФК, полученных реперколяцией и при перемешивании, ниже, чем в ПФК, полученном ремацера-цией. Следовательно, первые имеют более плотную структуру, более конденсированы, чем последний.
Оценку состояния ПФК в растворе и в высушенном состоянии провели с использованием метода ЯМР-релаксации [7].
Исследованные температурные зависимости спин-решеточной релаксации Т водных вытяжек чаги, полученных различными методами экстракции представлены на рис. 1. Каждый из применяемых способов приводит к формированию индивидуальной водо-полимерной системы с соответствующими значениями параметров релаксации. Времена спин-спиновой релаксации Т2, исследуемых образцов меняются аналогично и поэтому не приводятся. Условная ширина (рис.1) спектров времен корреляции А (А ~ Т1/Т2) меняется с температурой по экстремальному закону с общим максимумом для образцов, получае-
мых методами ремацерации (система 1) и реперколяции (система 2) в области 50°С, а методом с применением перемешивания (система 3) - в области 60^70°С.
Анализ релаксационных характеристик в области 70°С (температура проведения экстракции) показывает, что релаксационное поведение водно-полимерной системы 2 может быть представлено как среднее значение суперпозиции (суммы) соответствующих параметров для систем 1 и 3, что показано на рис. 1 и 2. Это позволяет предположить, что структурно-конформационный состав полимерной компоненты системы 2 представляет собой суперпозицию структурно-конформационных особенностей полимерных компонент систем 1 и 3.
Наблюдаемая корреляция релаксационных параметров водных вытяжек и образцов ПФК, выделенных из водных вытяжек, полученных ремацерацией (образец 2), реперколя-цией (образец 1) и с помощью перемешивания (образец 3), показывает, что мы имеем дело с изменением конформационной структуры полимеров, а не с особенностями механизмов релаксации, обусловленных присутствием жидкофазной компоненты в водно-полимерных системах (рис. 3).
Как и в водной среде, параметры релаксации ПФК (образец 2) представляют собой некую среднюю величину по сравнению с аналогичными параметрами образцов 1 и3. При этом в области повышенных температур не наблюдается расслоения по молекулярной подвижности только у образца 2. Подобное расслоение для образцов 1 и 3 свидетельствует
1дТ1,С
0,2 п
-*-1 ж
0,15 - "/ /
0,1 - ~Л~3 / /
0,05 - / /
0 - /У
-0,05 -
-0,1 - ///
-0,15 - ///
-0,2 - ///
-0,25 -
-0,3 - 11111
20 40 50 60 70 80
т,с
Рис. 1 - Температурная зависимость времен спин-решеточной релаксации водных вытяжек чаги: 1 - механическое перемешивание; 2 - ремацерация; 3 - реперко-ляция
Рис. 2 - Температурная зависимость
условной ширины спектра времен корреляции водных вытяжек чаги (Л=Т1/Т2): 1- механическое перемешивание; 2 - ремацерация; 3 - ре-перколяция
о значительно более широком распределении полимерной компоненты по молекулярной массе или составу.
С увеличением температуры, как правило, происходит гомогенизация системы по молекулярной подвижности, и соответственно падает величина А. Но, судя по рис. 2, до температуры 50°С у образцов 2 и 3 и до 60^70°С у образца 1 ширина спектра времен корреляции А возрастает, что можно объяснить ростом объема межмолекулярных взаимодействий в водно-полимерной системе, например, вследствие набухания полимерной компоненты. Этот процесс протекает наиболее интенсивно в образце 2 и наименее эффективен для образца 3 . Однако процесс гомогенизации в водных вытяжках по молекулярной подвижности наиболее легко протекает для системы 3 и с максимальными энергетическими затратами - для системы 1 (рис. 3).
В целом по эффективности (по объему и энергетическим затратам) процесса набухания полимерной компоненты исследуемые системы можно расположить в следующий ряд: 2 >> 3 > 1. Из рис. 2 следует, что образец 2 характеризуется относительной легкостью набухания в воде (гидрофильностью) и одновременно максимально плотной и (или) однородной упаковкой индивидуальных полимерных цепей (рис. 3). Это может быть связано с большим вкладом однородных высокомолекулярных линейных фрагментов в полимерную
а
Р;
0,7 -
0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -
т,с
Рис. 3 - Температурная зависимость параметров спин-спиновой релаксации полифенолов водных вытяжек:
а) времена релаксации линии ЯМР Лоренцевой формы: 1- механическое перемешивание; 2 - ремацерация; 3 - реперколяция; 4 - Т21 время релаксации длинной компоненты; 5 - Т22 время релаксации короткой компоненты; 6 - Т21 время релаксации длинной компоненты; 7 - Т22 время релаксации короткой компоненты;
б) 1 - короткая компонента ССИ (Р2); 2 - длинная компонента ССИ (Р1); 3 - короткая компонента ССИ; 4 - длинная компонента ССИ
структуру полифенола, а также подразумевает возможность формирования значительного числа кристаллоподобных фрагментов в составе ПФК, выделенного из водной вытяжки, полученной ремацерацией.
В целом проведенный анализ показывает, что при формировании ПФК, выделенного из водной вытяжки, полученной ремацерацией, существенную роль играют взаимодействия физической природы по сравнению с ПФК, выделенным из водной вытяжки, полученной реперколяцией, и особенно по сравнению с ПФК, выделенным из водной вытяжки, полученной при перемешивании. Для последнего более характерны структурные особенности, обусловленные образованием ковалентных связей.
ИК-спектроскопия использовалась ранее для подтверждения соответствия ПФК, выделенных из водных вытяжек при выращивании чаги в культуре, ПФК, выделенным из водных вытяжек природной чаги [9]. В целом, полученные нами спектры совпадают со спектрами, приведенными в литературе.
Нами отмечены наибольшие изменения в области колебаний связей карбоксильных групп и карбоксилат-иона 1200 - 1800 см-1. В этой области проявляются колебания других присутствующих в полифенольном комплексе связей, например колебания СН бензольных колец, СН и СН2 колебания алкильных радикалов, С=С и С=О связей, а также колебания эфирных связей [9]. Представленные на рис. 4 ИК спектры ПФК, выделенных из водных вытяжек, полученных реперколяцией (спектр 1) и ремацерацией (спектр 2), различаются. Изменения в этой области спектра существенны и зависят от способа получения ПФК. На спектрах 1 и 2 наблюдается 4 сильных полосы поглощения: с V(c-o) = 1240 см-1 и V(c=o) = 1720 см -1 отнесенные к колебаниям карбоксильной группы, а также с Vs = 1400 см-1 и = 1620 см -1, отнесенные к карбоксилат иону (1,2,3).
Из сравнения этих спектров видно, что относительные интенсивности полос V(c-o) и Vs, V(c=o) и Vos заметно перераспределяются. В первом спектре относительные интенсивности 1240 см -1 и 1720 см увеличиваются относительно интенсивности полос 1400 см -1 и 1620 см -1 по сравнению со спектром 2, что свидетельствует в пользу увеличения при реперколя-ции количества свободных карбоксильных групп по отношению к карбоксилат-ионам.
Следовательно, можно предположить, что относительное количество карбок-силат-ионов на поверхности ПФК, выделенного из водной вытяжки, полученной рема-церацией больше, что косвенно свидетельствует о его большем объёме.
С помощью методов ЯМР-релаксации и ИК-спектроскопии и по содержанию углеводов в водной вытяжке и в составе ПФК показано, что в зависимости от способа получения водной вытяжки ПФК сформированы по-разному. Установлено, что ПФК, выделенные из водных вытяжек, полученных реперколяцией и при перемешивании, имеют более плотную структуру, более конденсированы, чем ПФК, выделенные из водной вытяжки, полученной ремацерацией.
Экспериментальная часть
Водные вытяжки чаги приготовлялись ремацерацией по методике, предложенной в [3], ре-перколяцией согласно технологии производства бефунгина и с применением перемешивания с использованием встряхивателя в режиме 3000 колебаний в минуту, при температуре 70 оС в течение семи часов. Выделение из водной вытяжки полифенольного комплекса и определение его содержания (ПФК) осуществлено согласно [10]. Гидролиз ПФК проведен гидроокисью натрия в течение пятнадцати часов на водяной бане. Количество углеводов определено фенолсернокислотным методом [11, 12]. ИК-спектры выделенных полифенолов сняты в таблетках КВг на спектрофотометре иЯ-20. Параметры релаксации водных вытяжек чаги и ПФК определены на лабораторном ЯМР-релаксометре с частотой резонанса 19 МГц и временем нечувствительности приёма передающего тракта 8 мс. Времена продольной релаксации определялись методом бегущей последовательности 180 - 90о, времена поперечной релаксации получены методом КПМГ [7].
900 1100 1300 1500 1700 1900 V, см"1
Рис. 4 - ИК-спектры поглощения полифенолов
чаги: 1 - комплекс, выделенный из водной вытяжки, полученной реперколяцией; 2 - комплекс, выделенный из водной вытяжки, полученной ремацерацией
Литература
1. Шиврина А.Н. // Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. М.-Л.: Наука, 1966. 135с.
2. Рыжова Г.Л. и др. // Химико-фармацевтичекий журн. 1997. №10. С.44-47.
3. Якимов П.А., Андреева С.М., Алексеева Е.В. // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. М.-Л.: Наука, 1961. С.129-138.
4. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. // Биохимия. 1959. Т.24. Вып.1. С.67-72.
5. Андреева С.М. // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. М.-Л.: Наука, 1961. С.120-128.
6. Шиврина А.Н., Платонова Е.Г. //В сб.: Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. М.-Л. Наука, 1966. 135с.
7. Фаррер Т., Беккер Э. Импульсная и Фурье-спектроскопия ЯМР. М.: Мир, 1973. 179с.
8. Шиврина А.Н.// Почвоведение. 1962. №11. С.51-60.
9. Козицына Л.А. Купленская Н.Б. Применение УФ-, ИК- и ЯМР-спектроскопии в органической химии. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1979. 238с.
10. МуравьеваД.А. Фармакогнозия. М.: Медицина, 1981. 714с.
11. Michel Dubois, K. A. Gilles, J. K. Hamilton, P. A. Rebers, and Fred Smith. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Division of Biochemistry, University of Minnesota, St. Paul, Minn. Analytical chemistry, vol. 28, N0.3, March 1956.
12. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев: Наукова думка, 1982.192с.
© М. А. Сысоева - канд. хим. наук, доц. каф. промышленной биотехнологии КГТУ; О. Ю. Кузнецова - ассист. той же кафедры; В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф., зав. каф. промышленной биотехнологии КГТУ; П. П. Суханов - д-р хим. наук, проф. каф. ТППКМ КГТУ; Ф. Г. Халитов -д-р хим. наук, проф. КГЭУ.
