CC BY
89
Химия растительного сырья. 2005. №1. С. 41-47.
УДК 615.322:582.287.237
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗОЛЯ ВВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ.
IV. АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ. ВЛИЯНИЕ СПОСОБА ИЗВЛЕЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЛЕКСОНОВ, ГИДРООКСИДА НАТРИЯ*
© М.А. Сысоева1, О.Ю. Кузнецова1 , В.С. Гамаюрова1, П.П. Суханов1, Г.К. Зиятдинова2,
Г.К. Будников2
1 Казанский государственный технологический университет, ул. К. Маркса, 68, Казань, Республика Татарстан, 420015 (Россия)
E-mail: [email protected]
2Казанский государственный университет, ул. Кремлевская, 18, Казань,
Республика Татарстан, 420008, (Россия) E-mail: [email protected]
Препараты на основе водных извлечений чаги широко применяются для лечения предраковых состояний и рака различной этиологии. Проведено исследование антиоксидантной активности водных извлечений и полифенолоксикар-боновых комплексов (ПФК) из различных партий сырья чаги. Определено влияние способа получения водного извлечения и использования в экстракции комплексонов и гидроокиси натрия в низких концентрациях на антиоксидантную активность водных извлечений и выделенных из них ПФК. С помощью метода ЯМР релаксации показано, что антиоксидантная активность водных извлечений зависит от формирования золя вводной вытяжки, а ПФК - от его структуры и формирования в золе водной вытяжки. Установлено, что применение в экстракции комплексонов и гидроокиси натрия приводит к повышению антиоксидантной активности ПФК в 2,5-3 раза по сравнению с ПФК, выделенных из водных извлечений.
Введение
В настоящее время расширяется спектр препаратов и БАД на основе водных извлечений из чаги. Это обусловлено наличием множества соединений различных классов, переходящих из чаги в раствор при проведении водной экстракции, обладающих биологической активностью. Основным действующим веществом водной вытяжки является полифенолоксикарбоновый комплекс (ПФК). По содержанию его в водных извлечениях оценивают качество жидких препаратов чаги. На основе ПФК готовят таблетированные препараты чаги и БАДы. Они эффективно применяют для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний, рака различной этиологии.
В настоящее время рак относят к свободнорадикальным патологиям, поэтому исследование антиокси-дантной активности водных извлечений и ПФК является актуальной задачей.
Из веществ, экстрагируемых из чаги водой, основной вклад в антиоксидантную активность водного извлечения вносит ПФК.
Цель исследования:
1. Определение антиоксидантной активности водных извлечений и ПФК, выделенных из различных партий чаги.
* Предыдущее сообщение: Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С., Суханов П.П., Зиятдинова Г.К., Будников Г.К. Исследование золя вводных извлечений чаги. III. Влияние состава сырья на выход экстрактивных веществ водных извлечений чаги // Химия растительного сырья. 2004. №4. С. 29-34.
Автор, с которым следует вести переписку.
2. Определение антиоксидантной активности водных вытяжек, полученных с помощью разных способов экстракции и из различных образцов сырья.
3. Изучение влияния на антиоксидантную активность водных извлечений и ПФК применения в экстракции комплексонов и предварительного замачивания сырья в растворах гидроокиси натрия.
Экспериментальная часть
Для проведения исследования сырье закупали в аптечной сети. Производитель, партия, дата выпуска сырья приведены ниже:
1) ООО «АПЕКС» (Санкт-Петербург), серия 20082001, 2001 г.;
2) ЗАО «ТЕХМЕДСЕРВИС» (Москва), серия 200502, 2002 г.;
3) Лекарственные травы ЗАО «АРНИКА» (Санкт-Петербург), серия 00270802, 2002 г.;
4) АОА «Красногорсклексредства» (Московская область (МО), Красногорский район), серия НАО 20803, 2003 г.;
5) ООО «Травы Башкирии» (Уфа), серия 100603. 2003 г.;
6) АОА «Красногорсклексредства»* (МО, Красногорский район), серия НАО 21003, 2003 г.;
В тексте статьи использованы названия фирм-поставщиков сырья чаги.
Водные вытяжки чаги приготовлялись ремацерацией по [1], реперколяцией согласно технологии производства бефунгина [2] и с применением перемешивания с помощью встряхивателя в режиме 50 колебаний в минуту, при температуре 70 оС в течение семи часов.
Выделение из водной вытяжки и определение содержания ПФК проведено согласно фармацевтической статье на бефунгин (ФС 42-3291-96).
Количество углеводов в водных извлечениях чаги определено фенолсернокислотным методом [3, 4].
Определение сухого остатка и зольности проведено по [5].
Введение комплексонов (гидроксиэтилидендифосфоновой кислоты (ОДЭФ) и натриевой соли этилен-диамин-Ы",М,№,№-тетрауксусной кислоты (трилон Б)) осуществлялось двумя способами: 1) предварительное замачивание сырья в водном растворе комплексона с последующей экстракцией водой; 2) проведение экстракции водным раствором комплексона.
Применение в качестве экстрагента слабощелочных растворов гидроокиси натрия осуществляли на стадии замачивания с последующей ремацерацией водой.
Подбор оптимального времени замачивания сырья в растворах комплексонов и гидроокиси натрия осуществлялся в интервале от 30 мин до 13 ч. Концентрация варьировалась от 0,005 до 0,5 г/л.
Параметры релаксации водных вытяжек чаги и ПФК определены на лабораторном ЯМР-релаксометре с частотой резонанса 19 МГц и временем нечувствительности приема передающего тракта 8 микросекунд при 20 °С. Времена поперечной ядерной магнитной релаксации определялись методами КПМГ у водных вытяжек и по ССИ - у сухих остатков [6].
Антиоксидантную активность определяли кулонометрически. Электрогенерацию брома осуществляли на потенциостате П-5827 М при постоянной силе тока 5,0 мА из водных 0,2 М растворов КВг в 0,1 М Н2804 с определением конца титрования амперометрической индикацией с двумя поляризованными платиновыми электродами (ДЕ=300 мВ). В кулонометрическую ячейку вносили 20,0 мл фонового раствора и аликвоту исследуемого образца (0,1^3,0 мл). Для титрования брали аликвоты с таким расчетом, чтобы время титрования не превышало 5 мин.
Фиксировали изменение индикаторного тока во времени. По перегибу на индикаторных кривых находили конечную точку титрования (к.т.т.) и рассчитывали величину антиоксидантной активности как количество электричества в кулонах на 100 г сухого сырья [7, 8].
Обсуждение результатов
Для определения антиоксидантных свойств водных вытяжек и ПФК чаги нами использован широко применяемый на практике кулонометрический способ оценки антиоксидантной активности с помощью электрогене-рированного брома. Антиоксидантная активность водных извлечений и выделенных ПФК из различных партий чаги приведена в таблице 1.
Антиоксидантная активность водных извлечений из первых пяти партий сырья имеет близкие значения и составляет от 28 до 33 кКл/100г. Наблюдается низкая антиоксидантная активность у шестого образца сырья при достаточно высоком содержании ПФК в вытяжке. Анализ физико-химических характеристик водных извлечений, приведенных в таблице 1, позволяет отметить, что корреляции антиоксидантной активности с приведенными параметрами не наблюдается.
ПФК выделялся из водных извлечений осаждением при изменении рН среды от 5 до 2. Его высушивали на воздухе при комнатной температуре. Антиоксидантную активность ПФК исследовали в водном растворе. В целом, как будет видно из данных, приведенных далее, она имеет тенденцию к увеличению по сравнению с антиоксидантной активностью водных извлечений. По-видимому, это связано с иной стабилизацией ПФК и его пространственной структурой в воде по сравнению с водным извлечением из чаги более насыщенными соединениями, участвующими в стабилизации ПФК.
Антиоксидантная активность водных вытяжек из различных образцов сырья, полученных с помощью разных способов экстракции - ремацерацией, реперколяцией и с помощью механического перемешивания приведена в таблице 2. При смене способа получения водного извлечения изменяется его антиоксидантная активность и физико-химические параметры. Так, более высокое содержание углеводов в водных извлечениях, полученных ремацерацией, повышает их биологическую активность.
Водные извлечения из сырья разных поставщиков, полученные ремацерацией и реперколяцией, имеют близкие значения антиоксидантной активности. При этом вытяжки, полученные ремацерацией, обладают более высокой антиоксидантной активностью. Это можно было бы объяснить более высоким содержанием в них ПФК, однако вытяжка, полученная с помощью механического перемешивания, содержит наименьшее количество ПФК и обладает самой высокой антиоксидантной активностью.
Для оценки состояния ПФК в водном извлечении и в высушенном виде проведены исследования изучаемых объектов с использованием метода ЯМР-релаксации. Оценка состояния полимерных структур в водном извлечении чаги показала, что каждый из применяемых способов приводит к формированию индивидуальной коллоидной системы с соответствующими значениями параметров релаксации.
Водное извлечение, полученное ремацерацией, характеризуется относительной гидрофильностью и одновременно максимально плотной и однородной упаковкой индивидуальных полимерных цепей в ПФК. Это может быть связано с большим вкладом однородных высокомолекулярных линейных фрагментов в полимерную структуру полифенола, а также подразумевает возможность формирования значительного числа кристаллоподобных фрагментов (углеводные, белковые и другие компоненты) в составе ПФК. Сделан вывод о том, что образуемая в составе водного извлечения макромолекулярная структура ПФК обусловлена его состоянием в растворе.
Параметры релаксации высушенных ПФК, полученных с применением ремацерации, как и в водной среде, представляют собой некую среднюю величину по сравнению с аналогичными параметрами ПФК, полученными двумя другими методами.
Наблюдаемая корреляция релаксационных параметров водных вытяжек и ПФК, выделенных из соответствующих водных вытяжек, показывает, что мы имеем дело с изменением конформационной структуры полимеров, а не с особенностями механизмов релаксации, обусловленных присутствием жидкофазной компоненты в коллоидных системах.
Проведенный анализ данных ЯМР-релаксации показал, что в ПФК, выделенный из водных извлечений, полученных ремацерацией, существенную роль играют взаимодействия физической природы. Для ПФК, выделенных из водных извлечений, полученных реперколяцией, и особенно ПФК, выделенных из водной вытяжки, полученной при механическом перемешивании, более характерны структурные особенности, обусловленные образованием ковалентных связей.
ПФК, выделенные из водного извлечения, полученного ремацерацией, характеризуются относительной легкостью набухания в воде (гидрофильностью) и одновременно максимально плотной и (или) однородной упаковкой индивидуальных полимерных цепей. Это может быть связано с большим вкладом однородных высокомолекулярных линейных фрагментов в полимерную структуру полифенола, а также подразумевает возможность формирования значительного числа кристаллоподобных фрагментов в составе ПФК [8]. Такое различие структур ПФК в водных извлечениях, полученных различными способами экстракции, хорошо согласуется с их антиоксидантной активностью, приведенной в таблице 2 .
Таблица 1. Физико-химические характеристики и антиоксидантная активность водных извлечений чаги и ПФК, полученных ремацерацией из различного сырья
Сырье Содержание в водной вытяжке АЕ водных вытяжек, кКл/100г АЕ водных растворов ПФК, кКл/100г
выход ПФК, % С % '-'угл? /и сухой остаток,г зольность, г
ООО «АПЕКС» 12,9 2,40 1,78 0,46 13,88±0,9 19,72±0,05
ТЕХМЕДСЕРВИС 9,75 1,84 1,52 0,65 29,40±0,2 38,66±0,3
АРНИКА 11,39 1,86 1,60 0,44 28,35±0,2 27,22±0,3
КРАСНОГОРСК 11,80 3,62 2,66 0,74 28,08±0,3 Не растворился
БАШКИРСКОЕ 9,25 2,30 0,97 0,58 29,61±1,8 37,24±0,9
КРАСНОГОРСК* 9,30 1,56 1,55 0,64 32,82±0,2 22,68±0,3
* Сырье другой партии.
Таблица 2. Антиоксидантная активность водных извлечений чаги, полученных с помощью различных способов экстракции
Сырье Способ экстракции Содержание в водной вытяжке АЕ водных вытяжек, кКл/100г АЕ водных растворов ПФК, кКл/100г
выход ПФК, % С % сухой остаток,г зольность, г
КРАСНОГОРСК РЕМ 11,80 3,62 2,66 0,74 28,08±0,3 Не
РЕП 9,80 3,00 1,79 0,71 24,22±0,2 растворились
МП 6,80 2,40 1,45 0,47 39,68±0,3
ООО «АПЕКС» РЕМ 12,9 2,40 1,78 0,46 13,88±0,9 19,72±0,05
РЕП 10,20 2,20 1,46 0,56 9,74±0,8 Не растворился
Согласно данным [9] антиоксидантная активность водного настоя чаги, полученного с предварительным кипячением сырья, составляет 4,9+0,2 кКл/100 г. Такое низкое значение антиоксидантной активности этого водного извлечения можно объяснить конденсацией ПФК, вызванной воздействием на него высокой температуры при проведении экстракции.
Изучено влияние на антиоксидантную активность водных извлечений и ПФК с использованием в экстракции комплексонов и предварительного замачивания сырья в растворах гидроокиси натрия.
Применение комплексонов при получении водных извлечений чаги продиктовано тем, что они имеют высокое содержание зольных элементов - К, N8, Са, Mg, Мп, Бе, А1, 81. Среди перечисленных К и № составляют около 52% от всех зольных элементов, а калия в 5-6 раз больше, чем натрия. Наличие большого количества калия в препаратах чаги не показано, особенно для лечения и профилактики язвенной болезни, гастритов и рака IV стадии. Поэтому снижение их концентрации в препаратах из чаги актуально [10].
Использование трилона Б приводит к увеличению выхода ПФК, сухого остатка водной вытяжки и ее зольности по сравнению с контролем. При применении ОДЭФ выход ПФК повышается, однако показатели зольности и сухого остатка несколько ниже, чем в контроле. Действие комплексонов при проведении экстракции чаги различно. ОДЭФ как комплексон, способный образовывать прочные комплексы с щелочноземельными металлами в кислой среде (рН водной вытяжки около 5), по-видимому, должен несколько дестабилизировать золь водной вытяжки. Это приводит к снижению содержания сухого остатка при сохранении показателей зольности и количества углеводов на уровне с контролем. Поскольку выход ПФК возрастает, его стабилизацию могут осуществлять зольные элементы и другие соединения водной вытяжки за счет более слабых взаимодействий с его полярными группами.
При применении трилона Б происходит увеличение всех анализируемых параметров водной вытяжки, даже ее зольности. Известно, что комплексообразование при рН 5 трилоном Б затруднено, так как наиболее прочные комплексы он образуюет при рН среды 8-9 с двухвалентными ионами. Их количество в водной вытяжке намного меньше, чем ионов щелочноземельных металлов. Высокая зольность водной вытяжки может быть обусловлена, например, связыванием трилона Б с сырьем и облегчением выхода из него зольных элементов [11].
Согласно данным [12] ПФК имеет достаточно большое количество полярных групп, таких как меток-сильные 5,81%, карбонильный кислород 4,50%, карбоксильные 6,50 млэкв/г (в расчете на чистое органическое вещество).
Исследование ПФК с помощью ИК-спектроскопии позволяет заключить, что несмотря на различный механизм взаимодействия комплексонов с зольными элементами водной вытяжки, процесс комплексооб-разования, по-видимому, происходит и приводит к освобождению карбоксильных групп полифенолов по сравнению с контролем. Такие структурные изменения ПФК, вероятно, влияют на его формирование в золе водного извлечения и снижение антиоксидантной активности водного извлечения по сравнению с контролем в два раза, что представлено в таблице 3.
Различия в структурной организации вытяжек и выделенных из них ПФК при применении комплексонов в процессах экстракции показаны с помощью метода ЯМР-релаксации. Падение времени релаксации водных извлечений наблюдается с уменьшением температуры (с 70 до 20 °С), а также в зависимости от природы комплексонов последовательности: контроль (вода) ^ ОДЭФ ^ трилон Б. В том же порядке наблюдается рост жесткости цепи и (или) молекулярной массы образующегося в водном извлечении ПФК, что показано в таблице 4.
При переходе от водных извлечений к ПФК в твердом состоянии во всех исследуемых объектах время релаксации закономерно падает.
С учетом релаксационных характеристик ПФК в водных извлечениях предположено, что основной вклад в отмеченные закономерности вносят значительно большие размеры, связность и жесткость полимерной цепи, формирующейся в присутствии ОДЭФ. Если представить модель структуры ПФК в виде пористой среды, то в присутствии ОДЭФ формируется пористый кластер максимальных размеров с более широким, чем у остальных ПФК, распределением размеров капилляров и пор, функциональных групп или иных активных центров по геометрическим параметрам и энергетическим характеристикам рабочей поверхности.
Таблица 3. Антиоксидантная активность водных извлечений чаги при использовании в экстракции комплексонов и предварительного замачивания в растворе гидроокиси натрия
Сырье Реагент Содержание в водной вытяжке АЕ водных АЕ водных
выход ПФК, % С % угл сухой остаток, г зольность, г вытяжек, кКл/100г растворов ПФК, кКл/100г
ООО «АПЕКС» Контроль (вода) 12,9 2,40 1,78 0,46 13,88±0,9 19,72±0,05
Трилон Б 16,3 3,04 1,97 0,55 6,77±0,8 28,8±0,05
ОДЭФ 14,8 2,38 1,61 0,44 7,27±0,7 62,03±0,02
ТЕХМЕДСЕРВИС Контроль (вода) 9,75 1,84 1,52 0,65 29,40±0,2 38,66±0,03
ЫаОИ 9,25 1,96 1,43 0,54 29,16±1,8 52,37±0,09
АРНИКА Контроль (вода) 11,39 1,86 1,60 0,44 28,35±0,2 27,22±0,03
ЫаОИ 8,67 2,16 1,42 0,55 29,90±1,3 51,53±0,09
БАШКИРСКОЕ Контроль (вода) 9,25 2,30 0,97 0,58 29,61±1,8 37,24±0,09
ЫаОИ 9,25 2,08 1,48 0,81 29,21±1,4 52,05±0,09
Таблица 4. Зависимость структурной однородности компонентов Д ПФК в водной вытяжке и твердом состоянии*
№ Комплексон Д=Ті/Т2
20 °С 70 °С
Водная вытяжка
1 Контроль 1,16 1,55
2 Трилон Б 1,03 1,43
3 ОДЭФ 1,06 1,45
ПФК
1 Контроль 27,00 25,50
2 Трилон Б 19,40 17,00
3 ОДЭФ 37,00 31,00
*Водные вытяжки и ПФК, получены ремацерацией без замачивания
Поскольку ПФК, полученные с применением ОДЭФ, обладают наибольшим объемом и наиболее доступными активными центрами, то соответственно они и имеют максимальное значение антиоксидантной емкости.
В целом применение комплексонов в экстракции чаги приводит к увеличению антиоксидантной активности ПФК, полученных с их применением. Причем антиоксидантная активность ПФК, полученных с применением трилона Б, почти в полтора раза выше контроля, а антиоксидантная активность ПФК, полученных с применением ОДЭФ, выше более чем в три раза.
Применение предварительного замачивания сырья в растворах гидроокиси натрия обусловлено лучшей растворимостью полифенолов чаги, имеющих в своем составе меланины, именно в слабо щелочной среде. Было предположено, что создание слабо щелочной среды на стадии замачивания облегчит диффузию ПФК в водное извлечение при проведении экстракции ремацерацией и повысит его содержание в водной вытяжке.
Физико-химические характеристики и антиоксидантная акивность полученных извлечений приведены в таблице 3.
В этом случае водные извлечения, полученные из сырья разных партий, отличаются от контроля по-разному. Например, выход ПФК по сравнению с контролем повысился только при экстракции из сырья производителя «АРНИКА». Корреляции физико-химических характеристик с изменением антиоксидант-ной активности водных извлечений не наблюдается. Антиоксидантная активность водных извлечений также изменяется по сравнению с контролем по-разному: из «АРНИКИ» и «Башкирского» остается на том же уровне, а из «Техмедсервиса» повышается.
Антиоксидантная активность ПФК, выделенных из водных извлечений с предварительным замачиванием сырья в растворах гидроокиси натрия, намного превышает антиоксидантную активность контрольных опытов в случае экстракции из сырья «АРНИКА» и «Техмедсервис» и снижается при экстракции из «Башкирского» сырья.
Очевидно, что проведение предварительного замачивания сырья в растворах гидроокиси натрия сильно влияет на формирование золя водного извлечения и зависит от доступности и растворимости в воде различных компонентов из различных партий сырья. Золь водного извлечения имеет различную стабилизацию ПФК и соответственно различное изменение антиоксидантной активности. При выделении ПФК из водного извлечения и помещении его в равные условия - водный раствор, антиоксидантная активность также зависит от характеристик и качества сырья.
С точки зрения практического применения ПФК, выделенного из вытяжек, полученных различными рассмотренными способами, необходимо отметить, что его растворимость в воде возрастает при выделении из водной вытяжки полученной: реперколяцией < ремацерацией < при применении в экстракции комплексонов = при предварительном замачивании сырья в растворах гидроокиси натрия.
Выводы
Антиоксидантная активность, характеризующая биологическую активность водных извлечений и ПФК чаги, может иметь различные значения в зависимости от используемого сырья. В связи с этим считаем необходимым исследование этой характеристики для получения лекарственных препаратов и БАД из чаги.
Антиоксидантная активность зависит от способа водного извлечения. Нами показано, что водные извлечения, получаемые в фармацевтической промышленности с помощью реперколяции, уступают по анти-оксидантной активности водным извлечениям, получаемым ремацерацией.
Установлено, что антиоксидантная активность водных извлечений зависит от формирования золя водной вытяжки. Антиоксидантная активность ПФК зависит от его структуры и формирования в золе водной вытяжки.
При создании лекарственных препаратов и БАД на основе чаги, обладающих высокими антиоксидант-ными свойствами, эффективнее использовать полифенолы чаги, чем ее водные извлечения.
Полифенолы, выделенные из водных извлечений при использовании в экстракции гидроокиси натрия и ОДЭФ в низких концентрациях, имеют антиоксидантную активность в 2,5-3 раза более высокую, чем выделенные из водного извлечения.
Список литературы
1. Якимов П.А., Андреева С.М., Алексеева Е.В. Методы переработки чаги в лекарственные формы // Комплексное изучение физиологически активных веществ низших растений. М.; Л., 1961. С. 129-138.
2. Муравьев И.А. Технология лекарств. М., 1980. 704 с.
3. Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J. K., Rebers P. A., Smith F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances // Analytical Chemistry. 1956. V. 28. P. 350-356.
4. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев, 1982. 192 с.
5. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд., доп. М., 1987. 389 с.
6. Фаррер Т., Беккер Э. Импульсная и Фурье-спектроскопия ЯМР. М., 1973. 179 с.
7. Абдуллин И.Ф., Турова Е.Н., Будников Г.К., Зиятдинова Г.К., Гайсина Г.Х. Электрогенерированный бром -реагент для определения антиоксидантной способности соков и экстрактов // Заводская лаборатория. 2002. Т. 68. №9. С. 12-15.
8. Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С., Халитов Ф.Г., Суханов П.П. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами // Вестник Казанского технологического университета (КГТУ). 2003. №2. С. 172-179.
9. Абдуллин И.Ф., Турова Е.Н., Гайсина Г.Х., Будников Г.К. Применение электрогенерированного брома для оценки интегральной антиоксидантной способности лекарственного растительного сырья и препаратов на его основе // Журнал аналитической химии. 2002. Т. 57. №6. С. 666-670.
10. Якимов П.А., Ступак М.Ф. Зольные элементы чаги и препараты из нее // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии / Под ред. П.К. Булатова, В.И. Долина, П.С. Савельева и др. Л., 1959. 334 с.
11. Кузнецова О.Ю., Сысоева М.А., Гамаюрова В.С., Халитов Ф.Г. Исследование золя водных извлечений чаги. I. Изменение изучаемой системы при введении комплексонов // Башкирский химический журнал. 2004. Т. 11. №2. С. 62-65.
12. Шиврина А.Н. Биологически активные вещества высших грибов. М.; Л., 1965. 199 с.
Поступило в редакцию 18 апреля 2005 г.
